CN102978284A - 一种筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物基因芯片技术领域，具体涉及一种筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片及其制备和使用方法。所述筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片载体表面固定有与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因序列的特异性寡核苷酸探针，所述与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因芯片上包含了相关的954个致病基因或疾病易感基因的所有编码区序列及与编码区邻近的内含子序列。本发明的通过在基因芯片载体表面固定有与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因序列的特异性寡核苷酸探针和相关的致病基因或疾病易感基因的所有编码区序列及与编码区邻近的内含子序列，因此，使用本发明的基因芯片可以同时筛查多种眼科遗传性疾病的基因芯片，大大提高了效率。

Description

一种筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片及其制备和使用方法

技术领域

 本发明涉及生物基因芯片技术领域，具体涉及一种筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片及其制备和使用方法。

背景技术

目前已报道的眼科遗传性疾病超过了200种。按照解剖学位置不同可分为泪器病、眼睑病、角膜病、青光眼、晶状体病、色素膜病、视网膜病、玻璃体病、视神经病、眼肌病、眼屈光不正和综合征等；按遗传方式不同可分为常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传、性染色体连锁遗传和线粒体遗传；按基因数量可分为单基因遗传和多基因遗传。其中的先天性青光眼、视网膜色素变性、Leber遗传视神经病、尤塞综合征等多种遗传性眼科疾病都可导致严重的不可逆性盲。眼科遗传性疾病严重影响患者的生活，给其家庭和社会带来严重的经济负担。因此，如何快速定位致病的基因位点，为患者提供遗传咨询和为后续的治疗奠定基础，是医学界乃至整个社会需迫切解决的问题。

但是，目前对于遗传性眼病的诊断非常困难。目前多依赖于典型家族史和临床特征为依据，但是许多遗传性眼病的早期临床特征并不明显，且不具备很高的特异性，家族史又不清晰，难以做出精确的临床诊断。所以，应用分子生物学方法来筛查致病的基因位点，可以做出准确的临床诊断，从而为患者的治疗和遗传学咨询提供确凿证据。

基因芯片是近年来迅速发展起来的集物理学、化学、材料学和生命科学于一体的高新技术，利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特殊序列的生物样品有序地固化在玻璃片和硅片等基质表面，并利用微量反应体积，一次杂交就可以对许多基因表达水平、突变和多态性进行特异、快速、精确检测，已经在基因表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域获得成功应用。由于基因芯片具有这些独特的优点使其在基因检测方面得到一定的运用，如利用表达谱微阵列对基因的表达状况进行检测，来探讨疾病的发病机制，或利用寡核苷酸微阵列上的引物延伸反应或直接核酸杂交检测单核苷酸多态性（SNP）等。

但是目前仍然没有一种能同时筛查多种眼科遗传性疾病的基因芯片。归结原因有二：其一，致病基因多，序列长。例如仅仅视网膜色素变性这一类疾病，目前报道的相关联的基因超过50个，每个基因外显子数目都有数十个到上百个不等，每个基因mRNA序列可多达上万个碱基序列；其二，传统测序方法效率低，成本高。传统的Sanger测序每小时只能检测6千个碱基序列。理论上一次性筛查多种疾病可能需要数月之久，且耗费极高，不适合于临床推广。

而随着近几年第二代测序技术的诞生和发展，使得第二个问题得以解决。目前第二代测序技术可在10个小时内检测4-6亿个碱基序列。不仅极大地减少了测序时间 ，同时也极大地降低了成本。

而对于第一个问题，候选基因多难以筛查，依然缺乏解决办法。在目前在眼科遗传领域，仅有针对Leber遗传视神经病几个已知位点的基因诊断芯片，由于没有包含线粒体基因组的全部序列，只能检测出一部分的Leber遗传视神经病患者。而对于其他包括了视网膜色素变性在内的200多种复杂的遗传眼病，甚至没有任何一种基因诊断芯片。其主要原因是，眼虽然是一个体积很小的器官，但结构复杂功能精细，眼科里面的分科数量又多，统计种类数量全面的遗传性眼病有很大困难，而且要定制成基因芯片又需要结合很强的遗传学知识和生物信息学知识。所以在目前的眼科领域，缺乏一种包含各类眼科遗传性疾病的基因芯片用以提供明确的临床诊断，然后为患者提供遗传咨询和为后续的治疗奠定基础。

因此，设计一个涉及最多种类眼科遗传性疾病、包含最全面的致病基因的基因诊断芯片，并且能结合第二代测序技术，高效低成本地筛查遗传性眼病，对于患者及其家庭乃至整个社会，对于眼科学领域乃至整个医学界，具有重大意义。

发明内容

本发明的目的之一在于为了克服现有技术的不足而提供一种能快速同时检测多种眼科遗传性疾病的筛查各类遗传性眼病的基因芯片及其制作方法。

为此，本发明公开了一种筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片载体表面固定有与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因序列的特异性寡核苷酸探针，所述与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因芯片上包含了相关的954个致病基因或疾病易感基因的所有编码区序列及与编码区邻近的内含子序列。

现有技术相比，本发明的优点在于由于基因芯片载体表面固定有与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因序列的特异性寡核苷酸探针和相关的致病基因或疾病易感基因的所有编码区序列及与编码区邻近的内含子序列，因此，使用本发明的基因芯片可以同时筛查多种眼科遗传性疾病的基因芯片，大大提高了效率。

本发明的目的之二在于提供一种上述筛查各类遗传性眼病的基因芯片的制备和使用方法。

筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片的制备方法包括下列步骤：

a.根据人类基因组HG19,调取所有目标基因的碱基序列，此区域包含了整个设计的基因外显子编码区域及邻近的内含子区域；

b.对每个区域中非重复区域设计60bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小为3bp；

c.利用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用PCR或转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，成为眼科疾病基因捕获芯片。

所述筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片的的使用方法包括下列步骤：

   首先从病人血液中提取3-5ug DNA，并将其打断，扩增，从而构建眼科病人的全基因组文库，然后利用所述筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片将眼科病人眼科疾病相关的基因捕获出来，然后利用新一代测序仪Illumina HiSeq 2000进行高通量测序，进而分析，找出这些疾病相关基因的所有突变信息，从而找到病人的致病基因，以达到准确基因诊断的目的。

附图说明

附图1为本发明眼科疾病相关基因捕获流程示意图；

附图2为本发明测序示意图；

具体实施方式

本筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片包括有基因芯片载体，在基因芯片载体表面固定有与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因序列的特异性寡核苷酸探针，所述261种各类眼科遗传性疾病参见下表：

表1眼科遗传性疾病列表：

(视网膜玻璃体）原发性家族性淀粉样变
	A-V综合征
Axenfeld  异常
	Axenfeld-Rieger 综合征(包括下面两种病）
BBS综合征
	Behcet 病（白塞病）
Behr 综合征（遗传性婴儿性视神经萎缩）
	Brown 上斜肌肌鞘综合征
Cockayne综合征/侏儒-视网膜萎缩-耳聋综合征、Neill-ding-Wall综合征、20三体综合征。。。。。。
	CSNB伴眼底改变
Duane 眼球后退综合症/Stilling-Turk-Duane Syndrome
	Farber病
Farbry病
	Francois 中央云雾状营养不良
Fuchs角膜内皮营养不良
	Gaucher病
Goldmann-Favre 病
	Grayson-Wilbrandt角膜营养不良
HARP 综合征
	Hunter综合征
Hurler 综合征
	Joubert综合征
Kearns-Sayre 综合征
	Kearns-Sayre综合征
Krabba 病
	Leber 遗传性视神经病/leber 视神经萎缩
Lisch上皮角膜营养不良
	lowe综合征（先天性青光眼伴智力低下和肾铵产生减少综合征）
Marchesani syndrome
	Marchesani综合征(反马方综合征)
Marfan综合征
	Maroteux-lamy综合征
Meesmann角膜营养不良
	Mobius综合征/先天性眼-面麻痹
Morquio综合征
	Niemann-pick病
Norrie 病
	Oguchi 病
Peter综合征
	Rei-buckler 营养不良
Rieger 异常
	Sandoff病
Sanfillipo综合征A
	Scheie综合征
Schnyder角膜营养不良
	Senior-loken 综合征
Sorsby 眼底营养不良
	Sticler综合征I
Sticler综合征II
	Tay-Sachs病
Thiel-Behnke角膜营养不良
	Usher 综合征
Von-Hippel-lindan综合征
	Waardenburg综合征
Wagner玻璃体视网膜变性（以前叫 过，不准 wagner-stickler syndrome )
	X连锁的青年性视网膜劈裂/先天性视网膜劈裂症
X连锁角膜营养不良
	X连锁肾上腺脑白质营养不良
Zellweger 综合征
	白点状视网膜变性retinitis punctata albescens
白点状眼底/眼底白色斑点症
	斑状角膜营养不良
伴高度近视综合征
	伴有其他发育异常的青光眼(如下）
伴有全身异常的晶状体脱位
	伴有视网膜病变的综合征
伴有瞳孔异位的晶状体脱位
	北卡罗来纳黄斑营养不良
扁平角膜
	玻璃体相关的病
不完全性全色盲
	成人型黑矇型痴呆/Kufs 病、成人型神经元蜡样脂质褐脂质贮积症
成人型遗传性黄斑变性
	单纯性睑下垂
单纯性先天性晶状体异位
	单重睑
低中度远视
	独眼畸形
多泪小点和泪小管
	多瞳孔
发育性青光眼
	反复糜烂性上皮营养不良
房角发育不良
	缝合性白内障
高度近视、变性近视
	高度远视
格子样角膜变性/格子样角膜营养不良
	格子样角膜内皮营养不良II型
格子样角膜内皮营养不良I型
	格子状色素上皮营养不良
共同性斜视
	冠状白内障(一种发育性白内障）
规则性角膜散光
	核性白内障
颌动瞬目反射
	黑蒙性家族痴呆
红绿色盲、红绿色弱
	虹膜发育不良
虹膜角膜内皮综合症
	后部多形性角膜营养不良(遗传性角膜深层营养不良、遗传性角膜水肿、内层大疱性角膜病变、Schnyder后部疱疹）
后部无定形角膜营养不良
	后部型圆锥角膜
后弹力层角膜营养不良
	后极性白内障
黄斑变性
	黄色斑点状视网膜变性
回旋状萎缩（回旋状视网膜脉络膜萎缩）
	激素性青光眼
家族性渗出性玻璃体视网膜病/渗出性玻璃体视网膜病I、Criswick-Schepens综合征/
	家族性渗出性玻璃体视网膜病变
家族性疣、视乳头玻璃疣
	假性青光眼
胶滴状角膜营养不良
	角膜后胚胎弓
角膜基质的营养不良
	角膜内皮营养不良
角膜前弹力层营养不良
	角膜上皮基底膜营养不良(地图样-点状-指纹状营养不良、Cogan小囊泡性营养不良）
角膜上皮营养不良
	角膜胎生环
角膜营养不良(角膜变性）
	结晶性白内障
结晶样视网膜变性
	近视
进展性双焦脉络膜视网膜病变
	晶状体缺损
局灶性营养不良
	巨大角膜/大角膜
颗粒状角膜营养不良
	蓝巩膜（van der Hoeve syndrome,Ehler-Danlos syndrome, 下颌-眼-面畸形）
蓝色盲、蓝色弱（第三型色盲、第三型色弱）
	卵黄样黄斑变性/Best病
螺旋状视乳头周围脉络膜视网膜变性
	脉络膜缺失症(进行性脉络膜萎缩、脉络膜毯营养不良TCD、脉络膜硬化）
脉络膜视网膜萎缩
	慢性进行性眼外肌麻痹（von Graefe 眼肌病）
弥漫性脉络膜萎缩变性
	内眦皱皮
囊膜性白内障
	黏液性上皮下角膜营养不良
胚胎核性白内障/中央粉尘状白内障
	普通近视
牵牛花综合征
	前部嵌顿状角膜营养不良
前房分裂综合征
	前极性白内障
青少年型黑矇型痴呆（Batten病、Vogt-Spielmeyer病,神经元蜡样脂质褐脂质贮积症）
	球形角膜
全白内障
	绕核性白内障
散发性脉络膜营养不良
	色素性青光眼
上睑下垂伴眼外肌麻痹
	少年型黄斑变性、Stargardt病
神经节苷酯贮积病
	神经纤维瘤病
视乳头凹陷
	视乳头发育不全
视乳头发育异常
	视乳头缺损
视乳头先天性弧形斑
	视乳头周围脉络膜营养不良
视神经胶质瘤
	视神经萎缩
视网膜格子样变性
	视网膜母细胞瘤
视网膜色素变性
	视网膜血管瘤病/Von hippel 病
视锥细胞单色视
	视锥细胞营养不良
双行睫
	水眼（先天性青光眼）/牛眼（后天性婴幼儿青光眼）
特殊类型青光眼
	同型半胱氨酸尿症
瞳孔异位
	完全性全色盲
晚期婴儿型黑矇型痴呆(Jansky-Bielschowsky病）
	微粒状角膜营养不良
无角膜
	无脉络膜症
下睑赘皮
	先天型黑矇性痴呆
先天性白内障
	先天性鼻泪管闭塞
先天性虹膜缺损
	先天性基质角膜营养不良
先天性睑裂狭窄综合征
	先天性角膜白斑
先天性角膜葡萄肿
	先天性晶状体脱位/异位
先天性静止性夜盲
	先天性泪囊瘘管
先天性泪小管闭锁
	先天性青光眼
先天性倾斜视盘
	先天性全色盲
先天性上睑缺损
	先天性上睑下垂
先天性上睑下垂伴有小睑裂、倒向内眦赘皮
	先天性视盘小凹
先天性视网膜脱离、先天性视网膜不附着
	先天性视网膜皱襞
先天性瞳孔残膜
	先天性瞳孔大小不等
先天性瞳孔散大
	先天性瞳孔异常
先天性外斜视
	先天性外展神经麻痹
先天性无虹膜
	先天性无泪症
先天性无眼球
	先天性小瞳孔
先天性小眼球
	先天性小眼球合并眼眶囊肿/小眼球伴有视网膜假性胶质增生和眼眶假性胶质囊肿
先天性眼睑内翻
	先天性眼睑缺损
先天性眼球震颤
	先天性眼外肌麻痹
先天性眼外肌纤维化综合征
	先天性眼外肌纤维化综合征1
先天性眼外肌纤维化综合征2
	先天性眼外肌纤维化综合征3
先天性遗传性角膜基质营养不良
	先天性遗传性角膜内皮变性
先天性遗传性角膜内皮营养不良(II型)
	先天性遗传性角膜内皮营养不良(I型)
显性遗传性黄斑囊样水肿
	显性遗传性视神经萎缩
小角膜
	小口病
雪花样玻璃体视网膜病变
	严重联合免疫缺陷病
眼前节发育不良
	眼球震颤阻滞综合征/眼球震颤代偿综合征
遗传性迟发型晶状体半脱位
	遗传性黄斑变性
遗传性脉络膜疾病
	遗传性视神经病变
异染性脑白质营养不良
	隐性遗传性视神经萎缩
隐眼畸形
	隐眼畸形/无眼睑
婴儿型黑矇型痴呆
	原发性闭角性青光眼
原发性开角性青光眼
	原发性青光眼
原发性青少年型青光眼
	原发性视神经萎缩
原发性视网膜色素变性
	原发性婴幼儿型青光眼
圆锥角膜
	远视
粘多糖贮积病
	正常眼底的CSNB
正常眼底的CSNB II型
	正常眼底的CSNB I型
脂质沉积症
	中心性视网膜色素上皮营养不良
中心性晕轮状脉络膜营养不良
	中央结晶状角膜内皮营养不良/Schnyder corneal dystrophy
锥-杆营养不良/锥-杆视网膜营养不良

所述特异性寡核苷酸探针可以按矩阵的方式排列，所述与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因芯片上包含了相关的954个致病基因或疾病易感基因的所有编码区序列及与编码区邻近的内含子序列，所述261种各类眼科遗传性疾病相关联的基因参见下表：

表2眼科遗传性疾病的关联基因列表列表：

A4GALT
	ABCA1
ABCA4
	ABCB1
ABCC6
	ABCD1
ACE
	ACO2
ACOX1
	ACP5
ACTA1
	ACTA2
ACTB
	ACTC1
ADAM9
	ADAMTS10
ADAMTS17
	ADAMTSL4
ADH1B
	ADRA2B
ADRB1
	AGRN
AGTR1
	AHI1
AIPL1
	AKAP12
AKT1
	ALDH3A2
ALDOC
	ALMS1
AMACR
	AN1
AN2
	ANO10
ANXA1
	APC
APEX1
	APOB
APOE
	AQP5
ARIX
	ARL13B
ARL6
	ARMS2
ARSA
	ARSB
ASAH1
	ATM
ATP1A3
	ATP1B2
ATP2A1
	ATP6V0A2
ATXN1
	ATXN7
B3GALTL
	BBS1
BBS10
	BBS12
BBS2
	BBS4
BBS5
	BBS7
BBS9
	BCL2
BCMAD
	BCOR
BCS1L
	BEST1
BEST2
	BFSP2
BHLHE22
	BHLHE40
BIRC5
	BLID
BMP2K
	BMP4
BPES3
	BPESC1
BRAF
	BRCA1
BRCA2
	BSMD
BW13
	C10orf2
C12orf65
	C1QTNF5
C1QTNF9B
	C2ORF71
C5orf42
	C8ORF37
CA2
	CA4
CA9
	CABP4
CACD
	CACD3
CACNA1F
	CACNA2D4
CAT
	CATC2
CATCN1
	CATCN3
CATM
	CBS
CC2D2A
	CCA1
CCA2
	CCFDN
CCND1
	CCNP
CCT
	CCV
CCZS
	CD36
CDB2
	CDH23
CDH3
	CDHR1
CDKN2A
	CDPD1
CEP290
	CEP41
CEP920
	CERKL
CFD
	CFH
CFHR5
	CFI
CHED1
	CHED2
CHIT1
	CHM
CHML
	CHMP2B
CHMP4B
	CHN1
CHRM1
	CHRNA1
CHRNB1
	CHRND
CHRNE
	CHST6
CHX10
	CISD2
CKN2
	CLC
CLDN19
	CLN3
CLN8
	CLRN1
CLU
	CNA1
CNA2
	CNGA1
CNGA3
	CNGB1
CNGB3
	CNNM4
CNTF
	COD2
CODA1
	COH1
COL11A1
	COL11A2
COL17A1
	COL18A1
COL1A1
	COL1A2
COL2A1
	COL4A1
COL4A2
	COL4A3
COL4A4
	COL4A5
COL8A1
	COL8A2
COL9A1
	COL9A2
COLQ
	COMT
CORD1
	CORD2
CORD4
	CORD5
CORD6
	CORD7
CORD8
	CORD9
CORDX
	CORS2
COX15
	CP
CP49
	CPA6
CRB1
	CREBBP
CRP
	CRX
CRYA1
	CRYA2
CRYAA
	CRYAA
CRYAB
	CRYB1
CRYB2
	CRYB2A
CRYB3
	CRYBA1
CRYBA2
	CRYBA4
CRYBB1
	CRYBB2
CRYBB3
	CRYG1
CRYG2
	CRYG3
CRYG4
	CRYG8
CRYGA
	CRYGB
CRYGC
	CRYGC
CRYGD
	CRYGS
CSNB1
	CSNB2
CSNB3
	CSNB4
CST3
	CTAA1
CTAA2
	CTCF
CTDP1
	CTGF
CTNND2
	CTPP
CTPP3
	CTPP5
CX46
	CX50
CXCL12
	CYP1B1
CYP27A1
	CYP4V2
CZP1
	CZP2
CZP3
	DBH
DCN
	DCS1L
DDX11
	DELXQ21
DFNB31
	DFNB59
DGKI
	DHDDS
DHRD
	DLD
DMD
	DMPK
DOK7
	DSG3
DTNA
	DURS
DURS1
	DURS2
ECM
	EDN3
EDNRB
	EFEMP1
EGR1
	EHHADH
ELOVL4
	EMP3
EP300
	EP300
EPHA2
	EPHX1
EPO
	EPYC
ERCC1
	ERCC2
ERCC5
	ERCC6
ERCC8
	EVR3
EXTL2
	EXTL3
EYA1
	EYS
F2R
	F3
F5
	FA2H
FAM126A
	FAM161A
FAM189B
	FBN1
FBN2
	FBN3
FECD2
	FECD3
FECD5
	FECD7
FEOM4
	FERMT1
FGF2
	FGFR2
FGFR3
	FHASD
FLG
	FLNA
FLVCR1
	FN1
FOXB1
	FOXC1
FOXC2
	FOXE3
FOXL2
	FOXP2
FOXRED1
	FRAS1
FREM2
	FRMD7
FSCN2
	FYCO1
FZD
	FZD4
GALC
	GALNS
GALT
	GBA
GBA2
	GBA3
GC
	GCAP1
GCNT2
	GFAP
GFBP3
	GFBP4
GFER
	GFPT1
GJ
	GJA8
GJB2
	GJD2
GLA
	GLB1
GLIS3
	GM2A
GNAT1
	GNAT2
GNPTG
	GNS
GOLGA8B
	GPC3
GPR143
	GPR179
GPR98
	GRK1
GRM6
	GSN
GSTM1
	GSTP1
GSTT1
	GUCA1A
GUCA1B
	GUCY2D
GUSB
	HARS
has-mir-106b
	has-mir-181a-1
has-mir-181a-2
	has-mir-181b-1
has-mir-181b-2
	has-mir-181c
has-mir-181d
	has-mir-182
has-mir-183
	has-mir-184
has-mir-185
	has-mir-194-1
has-mir-194-2
	has-mir-204
has-mir-210
	has-mir-216a
has-mir-216b
	has-mir-217
has-mir-219-1
	has-mir-219-2
has-mir-25
	has-mir-29c
has-mir-31
	has-mir-335
has-mir-361
	has-mir-7-1
has-mir-7-2
	has-mir-7-3
has-mir-9-1
	has-mir-9-2
has-mir-9-3
	has-mir-96
HCCS
	HDAC9
HEXA
	HEXB
HGF
	HGSNAT
HIF1A
	HLA-B
HLA-B13
	HLA-B51
HLA-C
	HMCN1
HMX1
	HNRNPA2B1
HOXA1
	HOXA2
HOXD3
	HRAS
HSF4
	HSP90AA1
HSPA8
	HSPB4
HTR2A
	HYAL1
ICAM1
	IDH1
IDH3B
	IDS
IDUA
	IGF1
IKBKAP
	IKBKG
IL16
	IL17A
IL1B
	IL6
IMPDH1
	IMPG2
INPP5E
	INVS
IQCB1
	IRF5
IRX5
	ISL1
ITGA6
	ITGB1
JAG1
	KANK1
KC6
	KCNJ13
KCNV2
	KEAP1
KERA
	KIF11
KIF21A
	KIF7
KIT
	KLF6
KLHL7
	KLK6
KRAS
	KRT12
KRT3
	KSS
KTCN2
	KTCN3
KTCN4
	KTCN5
KTCN6
	KTCN7
KTCN8
	LAMA1
LARS
	LCA5
LCA5L
	LCAT
LCT
	LD
LECD
	LEPREL1
LHON
	LHX2
LIFR
	LIM2
LMBRD1
	LOXL1
LPIN2
	LRAT
LRP2
	LRP5
LTBP2
	LUM
LZTFL1
	MACOM
MAF
	MAK
MAP2K1
	MAPK1
MAPT
	MCDR1
MCDR3
	MCDR4
MCDR5
	MCOLN1
MDDC
	MDM1
MED12
	MERTK
MET
	MFN2
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	MFS2
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	MIP
MIPEP
	MIR100HG
MIR184
	MIR96
MITF
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MKS1
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MMP2
	MMP2
MMP3
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MMP9
	MPP5
MPS3C
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MSH2
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MT-ATP6
	MTHFR
MTPAP
	MTR
MTRR
	MT-TH
MT-TL1
	MT-TP
MT-TS2
	MTX1
MUSK
	MYH11
MYH9
	MYLK
MYO7A
	MYOC
MYP1
	MYP10
MYP11
	MYP12
MYP13
	MYP14
MYP15
	MYP16
MYP17
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MYP19
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MYP20
	MYP3
MYP4
	MYP5
MYP6
	MYP7
MYP8
	MYP9
NADH
	NAGLU
NAT2
	NCMD
ND1
	ND2
ND3
	ND4
ND4L
	ND5
ND6
	NDP
NDRG2
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NDUFA10
	NDUFA10
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	NDUFAF6
NDUFB11
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	NDUFS7
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NEFH
	NEIL1
NEWENTRY
	NF1
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NYX
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OFD1
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OPTN
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PG
	PGAM1
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PHYH
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PITX2
	PITX3
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POLG
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PRPH
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PSAP
	PTOS1
PTOS2
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PTPRG
	PXMP3
RAB18
	RAB3GAP1
RAF1
	RAPSN
RARA
	RARB
RASGRF1
	RAX
RAX2
	RB
RB1
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RBP4
	RCD1
RD3
	RD3L
RDH1
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RDH5
	RDH8
RDS
	REP-1
RET-GC1
	RGR
RGS9
	RGS9BP
Rh
	RHO
RIMS1
	RLBP1
RNANC
	RNF135
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ROM1
	RP1
RP1L1
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RP22
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RP6
	RP63
RP9
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RPGR
	RPGRIP1
RPGRIP1L
	RS1
RUNX1
	RYR1
S100A2
	SAG
SALL1
	SALL4
SANI2
	SBF2
SCCD
	SCN5A
SCP2
	SDCCAG8
SDHA
	SDHAF1
SEC23IP
	SELE
SELL
	SELP
SEMA4A
	SEPN1
SERPINE1
	SERPINI2
SGSH
	SHH
SIAE
	SIL1
SIRT1
	SIX3
SIX6
	SLC16A12
SLC18A1
	SLC18A2
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	SLC26A2
SLC28A1
	SLC39A13
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	SLC52A2
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	SLC6A4
SLPI
	SLRR
SMC1A
	SMC3
SMOC1
	SMPD1
SNCA
	SNCB
SNRNP200
	SNX3
SOD1
	SOD3
SOS1
	SOX10
SOX14
	SOX2
SP1
	SPARC
SPATA7
	SSPN
STAT4
	STIM1
STRA6
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SURF1
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TACSTD2
	TARDBP
TCF4
	TDRD7
TEAD1
	TEX28
TFAP2B
	TFE3
TGFB1
	TGFB2
TGFBI
	TGFBR1
TGFBR2
	TGF-β
TGF-β2
	TGIF1
TH
	TIGR
TIMM8A
	TIMP1
TIMP2
	TIMP3
TIMP-3
	TINF2
TLL
	TMCO1
TMEM107
	TMEM126A
TMEM138
	TMEM216
TMEM237
	TMEM67
TNF
	TNFRSF14
TNNI2
	topORS
TP53
	TP63
TPM3
	TREX1
TRIM32
	TRNI
TRPM1
	TSPAN12
TTBK2
	TTC21B
TTC8
	TTPA
TTR
	TUBB3
TUKLS
	TULP1
TWIST1
	TYMP
TYR
	UBIAD1
UBXN4
	UCHL1
UMODL1
	UNC119
USH1C
	USH1E
USH1G
	USH1H
USH1K
	USH2A
VAX1
	VCAN
VDR
	VEGFA
VHL
	VIM
VMD2
	VPS13B
VRD1
	VRNI
VSX1
	VSX2
WDPCP
	WDR19
WDR36
	WFS1
WFS2
	WHCR
WHSC1
	WMS
WNT3
	WRN
WS2A
	WS2B
WS2C
	WT1
XECD
	XPC
XRCC1
	ZEB1
ZFHX4
	ZNF469
ZNF492
	ZNF513
ZNF592
	ZNF644

本筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片的制备方法包括下列步骤：

a.根据人类基因组HG19,调取所有目标基因的碱基序列，此区域包含了整个设计的基因外显子编码区域及邻近的内含子区域，总共超过了1000000bp；

b.对每个区域中非重复区域设计60bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小为3bp；

c.利用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用PCR或转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，成为眼科疾病基因捕获芯片。

所述筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片的的使用方法，如下：

    首先从病人血液中提取3-5ug DNA，并将其打断，扩增，从而构建眼科病人的全基因组文库，然后利用所述筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片将眼科病人眼科疾病相关的基因捕获出来，然后利用新一代测序仪Illumina HiSeq 2000进行高通量测序，进而分析，找出这些疾病相关基因的所有突变信息，从而找到病人的致病基因，以达到准确基因诊断的目的。其中眼科疾病相关基因捕获如图1所示，首先将用眼科疾病相关基因的捕获探针和病人的全基因组文库混合，病人疾病相关基因片段就被杂交到探针上，进而通过生物素和streptavidin的磁珠结合被吸附到磁珠上；通过洗脱处理就能将非目标区域的DNA片段洗掉，从而富集疾病基因片段，然后利用新一代测序仪Illumina HiSeq 2000进行高通量测序，分析，可以找出相关基因的突变，从而得到病人的致病基因。测序的具体步骤如下：

1. 设计目标区域探针及芯片的定制；

2. 基因组DNA的提取抽取受检者外周静脉血3ml，先用细胞裂解液裂解红细胞和白细胞，再用蛋白酶K消化蛋白质，加入异丙醇使核酸析出，再重复洗涤后溶解于TE缓冲液。

3. 超声波随机打断基因组DNA

4. 构建DNA文库

5. 目标区域杂交、捕获、洗脱

6. PCR扩增目标区域DNA

7. 上机测序

8. 与参考基因组序列比对

9. 生物信息数据分析

10.PCR验证

  下面通过具体的实例作进一步说明：

  本实例中共有五位临床诊断为Usher综合征的患者，按上述步骤进行基因检测，数据分析统计如下表所示：

经过生物信息学的分析，将可能的致病位点从平均150个左右过滤到10个左右，再逐一在先证者及其家属的血样中用Sanger测序法验证，测序如图2所示。

最终，在5名患者身上一共发现了10个致病性的突变位点，如下表所示：

这几个突变位点成功解释了患者患病的原因，并在家系中得到了验证，成功地解释了遗传规律。

Claims (3)

1.一种筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片载体表面固定有与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因序列的特异性寡核苷酸探针，所述与261种各类眼科遗传性疾病相关的基因芯片上包含了相关的954个致病基因或疾病易感基因的所有编码区序列及与编码区邻近的内含子序列。

2.如权利要求1中所述筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

a.根据人类基因组HG19,调取所有目标基因的碱基序列，此区域包含了整个设计的基因外显子编码区域及邻近的内含子区域；

b.对每个区域中非重复区域设计60bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小为3bp；

c.利用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用PCR或转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，成为眼科疾病基因捕获芯片。

3.如权利要求1中所述筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片的的使用方法，其特征在于包括下列步骤：

   首先从病人血液中提取3-5ug DNA，并将其打断，扩增，从而构建眼科病人的全基因组文库，然后利用所述筛查各类眼科遗传性疾病的基因芯片将眼科病人眼科疾病相关的基因捕获出来，然后利用新一代测序仪Illumina HiSeq 2000进行高通量测序，进而分析，找出这些疾病相关基因的所有突变信息，从而找到病人的致病基因，以达到准确基因诊断的目的。

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