CN110272995B - 一种常染色体隐性视网膜色素变性筛查试剂盒 - Google Patents

一种常染色体隐性视网膜色素变性筛查试剂盒 Download PDF

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明提供了一种突变CDHR1基因，它带有c.1231 C＞T(p.Q411X)突变位点。本发明还提供了检测该突变基因/突变位点的试剂在制备常染色体隐性视网膜色素变性中的用途。本发明还提供了对应的试剂盒。本发明可以有效、快速地对视网膜色素变性进行筛查，应用前景良好。

Description

一种常染色体隐性视网膜色素变性筛查试剂盒
技术领域
本发明属于遗传病基因诊断试剂领域。
背景技术
视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa，RP)是一种最常见的遗传性视网膜疾病，其主要特征在于视网膜光感受器(视锥细胞和视杆细胞)进行性退化和视网膜色素上皮细胞变性，导致夜盲和进行性视野缺损。RP是导致遗传性失明的主要原因之一，全球患病率约为1/3500～1/5000，具有高度的临床和遗传异质性，其遗传方式主要包括常染色体显性遗传(30％-40％)、常染色体隐性遗传(50％-60％)、X-连锁遗传(5-15％)。迄今为止，已有63个基因被报道与常染色体隐性视网膜色素变性(autosomal recessive retinitispigmentosa，arRP)有关，但被鉴定的基因仅能解释约50％～60％的病例。
CDHR1基因属于钙依赖性细胞粘附分子的钙粘蛋白超家族，已经被证实与RP有关。但该基因c.1231C＞T(p.Q411X)(编码区1231位碱基C变为T，并导致所编码蛋白411位氨基酸由Q变为X)的突变尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供了一种新的CDHR1突变基因及其用途。
本发明的技术方案包括：
一种突变基因，其特征在于，它是带有如下突变位点的人类CDHR1基因：
c.1231C＞T：编码区第1231位碱基由C变为T。
检测前述突变位点的试剂在制备视网膜色素变性筛查试剂盒中的用途。
如前述的用途，所述视网膜色素变性为常染色体隐性视网膜色素变性。
如前述的用途，所述试剂为DNA测序试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或单链构象多态性分析用试剂。
如前述的用途，所述试剂盒还包括扩增人类CDHR1基因编码区第1231位碱基的基因片段的试剂。
一种视网膜色素变性筛查试剂盒，它含有检测前述突变位点的试剂。
一种视网膜色素变性筛查试剂盒，所述视网膜色素变性为常染色体隐性视网膜色素变性。
一种视网膜色素变性筛查试剂盒，所述试剂为DNA测序试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或单链构象多态性分析用试剂。
一种视网膜色素变性筛查试剂盒，所述试剂为DNA测序试剂。
一种视网膜色素变性筛查试剂盒，所述试剂盒还包括扩增人类CDHR1基因编码区第1231位碱基的基因片段的试剂。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明提供了用于视网膜色素变性筛查的基因序列多态性位点，而该位点发生变化的DNA、mRNA以及蛋白均可作为视网膜色素变性筛查、早期干预与治疗的生物标记物，应用前景广大。
2)本发明提供的试剂盒能够简单有效地筛查视网膜色素变性。
3)本发明可以用于婚前或产前诊断，有利于预防后代视网膜色素变性。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：RP-2373家系图：箭头表示先证者；实心方形或圆形表示视网膜色素变性患者；方形表示男性；圆圈表示女性；斜线表示已故。
图2是本发明所述CDHR1突变位点测序图；Wildtype，野生型；Heterozygousmutant，杂合突变；Homozygous mutant，纯合突变。
具体实施方式
实施例本发明的试剂盒及使用方法
本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：
1.PCR扩增试剂(50人份)：
PCR扩增试剂用于扩增突变位点所在的一段DNA序列，其组成见表1。
表1 PCR扩增试剂
组分 浓度 体积
PCR混合液 2× 600μl
引物对 10μM 100μl
纯水 2ml
表1中PCR混合液包括Taq酶、dNTP、镁离子等常规PCR所需成分；其中引物对信息如表2所示。
表2 CDHR1基因扩增所用引物
SEQ ID NO. 引物名称 序列(5’→3’)
1 Primer-1F AGGCACTCACAGTCCATTCA
2 Primer-1R TGGGCTTCATTCAGGACTGT
2.CDHR1基因变异分型检测试剂(50人份)：
该试剂包括如表3所示的组分。
表3 CDHR1基因变异分型检测试剂
组分 体积
血清碱性磷酸酶 100μl
限制性外切酶 6μl
纯化缓冲液 6μl
Bigdye Mix 15μl
5×buffer 120μl
ddH<sub>2</sub>O 1ml
F引物 各50μl
所述F引物为测序用引物，序列同Primer-1F。
3.标准DNA样品：带有CDHR1基因的野生纯合子/杂合子DNA，各50μl。
4.使用方法：
1)DNA提取
取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。
2)通过PCR扩增含有所检测的突变位点的DNA片段，每个突变位点PCR扩增体系如表4所示：
表4 PCR扩增体系
组分 浓度 体积
样品DNA 50ng/μl及以上 1μl
PCR试剂混合液 2× 10μl
引物对 10μM 2μl
纯水 7μl
反应条件：
Figure BDA0002133704130000031
Figure BDA0002133704130000041
PCR产物检测：
用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。
3)Sanger测序检测
第一步：PCR产物纯化
PCR产物纯化体系如表5所示。
表5 PCR产物纯化体系
组分 体积
PCR产物 4μl
血清碱性磷酸酶 2μl
限制性外切酶 0.1μl
纯化缓冲液 0.1μl
反应条件：
Figure BDA0002133704130000042
第二步：Sanger测序
将前述分型检测试剂作为测序扩增试剂，用于第一步纯化的PCR产物的Sanger测序。
如果2个位点测序结果在编码区第1231位碱基均由C突变成T，则说明该检测样本患有arRP。
为了进一步说明本发明所述突变位点与arRP的关系，以及本发明试剂盒的效果，提供以下实验例。
实验例 突变位点的验证
1.方法
1.1临床样本
在四川省人民医院确诊为患有RP的同一家系的3名患者，以及其6名正常家庭成员。该家系代号为RP-2373，家系图如图1，所有家系成员都接受了全面的眼科检查，包括最佳矫正视力(BCVA)、视野测试、眼底照相和视网膜电图(ERG)等。通过对家系成员的全外显子测序，筛选得到CDHR1基因上的一个新的纯合突变位点：c.1231C＞T。
1.2测序验证
抽取RP-2373家系中所有成员的外周静脉血液样本，提取DNA进行Sanger测序，并与2010名健康人(作为对照)的CDHR1基因进行比对，验证CDHR1的该位点是否与arRP直接相关。
2.结果
测序结果显示，RP-2373家系中确诊为RP的三名患者均为CDHR1基因c.1231C＞T(p.Q411X)纯合突变，家系中其它成员要么为杂合突变，要么未突变(见表6)。正常和突变位点测序图如图2所示。
表6 RP-2373家系各成员CDHR1基因c.1231C＞T基因型
Figure BDA0002133704130000051
综上，CDHR1基因c.1231C＞T位点与常染色体隐性视网膜色素变性密切相关，本发明的试剂盒通过检测该位点是否为纯合突变，能够有效筛查常染色体隐性视网膜色素变性患者。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省人民医院
<120> 一种常染色体隐性视网膜色素变性筛查试剂盒
<130> GYKH1277-2019P016680CC
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial seq.)
<400> 1
aggcactcac agtccattca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial seq.)
<400> 2
tgggcttcat tcaggactgt 20

Claims (5)

1.检测人类CDHR1基因c.1231 C>T突变位点的试剂在制备视网膜色素变性筛查试剂盒中的用途，其特征在于：所述视网膜色素变性为常染色体隐性视网膜色素变性，所述试剂盒还包括扩增人类CDHR1基因编码区第1231位碱基的基因片段的试剂，扩增所用引物如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测人类CDHR1基因c.1231 C>T突变位点的试剂为DNA测序试剂。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测人类CDHR1基因c.1231 C>T突变位点的试剂为荧光定量PCR试剂。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测人类CDHR1基因c.1231 C>T突变位点的试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测人类CDHR1基因c.1231 C>T突变位点的试剂为单链构象多态性分析用试剂。
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