CN109735614B

CN109735614B - 一种先天性无虹膜筛查试剂盒

Info

Publication number: CN109735614B
Application number: CN201910112463.XA
Authority: CN
Inventors: 龚波; 刘小琦; 郭小新; 杨辰
Original assignee: Sichuan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Sichuan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2019-02-12
Filing date: 2019-02-12
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2039-02-12
Also published as: CN109735614A

Abstract

本发明提供了检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂在制备先天性无虹膜的筛查试剂中的用途；所述突变位点c.275G＞A是所述基因编码区第275位核苷酸由G突变为A。本发明还提供了一种先天性无虹膜筛查试剂盒，它是检测前述位点突变的试剂盒。本发明可以用于先天性无虹膜的辅助筛查，具有简单、快速的特点。

Description

一种先天性无虹膜筛查试剂盒

技术领域

本发明涉及基因点突变领域，特别涉及与先天性无虹膜相关的PAX6基因点突变。

背景技术

先天性无虹膜是一种多数呈显性遗传的罕见累及全眼的先天性遗传性眼科疾病，可同时伴有多种眼部异常表现和/或不同类型、程度的全身并发症。其中单纯发生眼部病变的“经典”无虹膜症患者通常除了虹膜发育不全的典型表现，还有如角膜、晶状体、视盘(视神经)、黄斑等眼部重要结构的特征性发育及功能异常。除此之外，一部分患者常常还患有不同程度的上睑下垂(单眼或双眼)，极少数的患者合并渗出性类Coat’s病样的视网膜脱离、先天性脉络膜缺损甚至视网膜巨大裂孔。

因此，通过正确的诊断，防止新生儿患此遗传病，十分重要。

PAX6基因的突变是导致先天性无虹膜的重要原因之一，基因诊断也成为目前确诊先天性无虹膜的重要手段。然而，并不是前述基因的任何位点的突变都与先天性无虹膜相关；通过检测现有的少数突变位点来诊断先天性无虹膜亦难免造成假阴性的检测结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供新的PAX6基因突变位点，以及它们在制备先天性无虹膜筛查试剂盒中的用途。

首先，本发明提供了检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂在制备先天性无虹膜的筛查试剂中的用途。

前述的用途中，所述的试剂包括检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类PAX6基因编码区第275位碱基的核酸片段的相关试剂。

前述的用途中，所述检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂为测序试剂。

前述的用途中，所述检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂为Sanger测序试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。

本发明还提供了一种先天性无虹膜筛查试剂盒，它包括任选的用于检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂。

前述的试剂盒中，所述的试剂包括检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类PAX6基因编码区第275位碱基的核酸片段的相关试剂。

前述的试剂盒中，所述检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂为测序试剂。

可选的，所述检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂为荧光定量PCR试剂。

可选的，所述检测人类PAX6基因突变位点c.275G＞A的相关试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。

本发明的试剂盒，通过检测PAX6基因突变位点c.275G＞A来辅助先天性无虹膜的筛查，具有可靠的特异性。

发明人通过研究，发现PAX6基因编码区第275号碱基突变可导致先天性无虹膜，某先天性无虹膜家系的成员的PAX6基因测序结果与之完全吻合。

本发明的试剂盒能实现PAX6 c.275G＞A位点的准确检测，能用于先天性无虹膜的辅助性筛查。

本发明关于PAX6 c.275G＞A位点检测试剂在先天性无虹膜筛查试剂盒制备中的用途，适用范围广，包括能用于SNP检测的所有方法。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例、实验例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是PAX6基因c.275G＞A位点测序图：A，未突变基因型测序图；B，杂合突变基因型测序图。

图2是实验例中先天性无虹膜的家系图：实心方框或实心圆表示患者。

具体实施方式

实施例本发明的试剂盒及使用方法

本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：

1.PCR扩增试剂(50人份)：

PCR扩增试剂用于扩增SNP位点所在的一段DNA序列，其组成见表1。

表1 PCR扩增试剂

组分	浓度	体积
			PCR混合液	2×	600μl
引物对	10μM	100μl
			纯水		2ml

表1中PCR混合液包括Taq酶、dNTP、镁离子等常规PCR所需成分；其中引物对信息如表2所示。

表2 PAx6基因扩增所用引物

2.PAX6基因变异分型检测试剂(50人份)：

该试剂包括如表3所示的组分。

表3 PAx6基因变异分型检测试剂

组分	体积
		血清碱性磷酸酶	120μl
限制性外切酶	6μl
		纯化缓冲液	5μl
Bigdye Mix	15μl
		5×buffer	100μl
ddH<sub>2</sub>O	1ml
		F引物	50μl

其中F引物是测序扩增引物，其序列(5’→3’)是：CAGGCAGTGTTTAAGAAAAG(SEQ IDNO.1)。

3.标准DNA样品：

组分	浓度	体积
			c.275G＞A位点G/G基因型的标准DNA	50ng/μl	10μl
c.275G＞A位点G/A基因型的标准DNA	50ng/μl	10μl

4.使用方法：

1)DNA提取

取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。

2)通过PCR扩增含有所检测的突变位点的DNA片段，每个突变位点PCR扩增体系如下：

组分	浓度	体积
			样品DNA	50ng/μl及以上	1μ1
PCR试剂混合液	2×	10μl
			引物对	10μM	2μl
纯水		7μl

反应条件(具体退火温度见表2)：

PCR产物检测：

用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。

3)Sanger测序检测

第一步：PCR产物纯化

体系：

组分	体积
		PCR产物	4μl
血清碱性磷酸酶	2μl
		限制性外切酶	0.1μl
纯化缓冲液	0.1μl

反应条件：

第二步：Sanger测序

将前述分型检测试剂作为测序扩增试剂，用于第一步纯化的PCR产物的Sanger测序。

如果测序结果在编码区第275位碱基G突变成A，出现所述突变位点的杂合双峰，则说明该检测样本先天性无虹膜患有先天性无虹膜。

为了进一步说明本发明所述突变位点与先天性无虹膜的关系，以及本发明试剂盒的效果，提供以下实验例。

实验例突变位点的验证

1.实验对象

某先天性无虹膜家系三代中的12名成员(家系图如图2所示)；健康受试者1186名。

2.方法

1)前述家系所有成员都进行了全面的眼科检查。

2)对PAX6基因的编码区序列进行PCR扩增后进行Sanger测序。

3)取前述家系所有成员的外周血淋巴细胞，应用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Germany)提取总RNA，检测PAX6mRNA表达水平。

3.结果

1)该家系有4名成员确诊为先天性无虹膜患者。

2)PAX6基因c.275G＞A位点未突变的测序结果如图1A所示，前述位点突变的测序结果如图1B所示。上述4名先天性无虹膜患者均出现了PAX6基因c.275G＞A位点突变，而本家系的其它成员以及1186名健康受试者没有该突变。

3)先天性无虹膜患者的PAX6基因mRNA表达水平比该家系健康成员低60.8％。

综上，本发明将PAX6基因c.275G＞A位点的变异，应用于先天性无虹膜辅助诊断试剂盒的制备中，能达到筛查的目的。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省人民医院

<120> 一种先天性无虹膜筛查试剂盒

<130> GY008-2018P012824CC

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caggcagtgt ttaagaaaag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctgcccaga attttactc 19

Claims

1.人类 PAX6基因突变位点c.275G>A在制备先天性无虹膜的筛查试剂中的用途。