TWI545324B - 過敏性鼻炎之篩檢或檢測方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種篩檢華人中過敏性鼻炎之高危險群或檢測過敏性鼻炎的方法,尤其關於經由測定抗原胜肽轉運蛋白質1(antigen peptide transporter 1,TAP1)之對偶基中轉譯第637位置之胺基酸(TAP1-637)的密碼子,以於華人中篩檢過敏性鼻炎之高危險群或檢測過敏性鼻炎的方法。
過敏性鼻炎(allergic rhinitis)是指有過敏體質的人,對於環境當中的一些過敏原,例如灰塵、黴菌、花粉、塵蟎、動物的毛屑、特定食物,或者氣候變化、空氣污染等因素過度敏感所造成的過敏現像,通常與家族性的遺傳有關。過敏性鼻炎的典型症狀包括打噴嚏、鼻子癢、流鼻水、鼻塞、眼睛癢、喉嚨癢、慢性咳嗽、經口呼吸、夜間打鼾等,長期出現前述症狀,可能進一步導致病患出現頭暈、頭痛、精神不濟、失眠等症狀,嚴重影響病患之生活品質。
目前臨床上對於過敏性鼻炎的診斷方法,主要是根據病患持續性出現典型的過敏性鼻炎症狀,再輔以血液常規檢
查,例如檢驗免疫球蛋白E(IgE)及/或嗜伊紅性白血球(eosinophils)在血液中的濃度,若病患持續出現典型的過敏性鼻炎症狀,且血液中IgE及/或嗜伊紅性白血球的濃度升高,則表示患者很有可能已罹患過敏性鼻炎。然而,前述傳統的診斷方法,無法在易罹患過敏性鼻炎之患者發病之前就進行診斷,因此,罹患過敏性鼻炎之高危險群(例如,因家族遺傳而導致罹患過敏性鼻炎之機率大幅提高者)無法在發病之前就先確診,故無從提早預防罹患過敏性鼻炎。
抗原胜肽轉運蛋白質(antigen peptide transporter,簡稱「TAP」)為抗原胜肽轉運蛋白質1(antigen peptide transporter 1,或稱為transporter antigen peptide 1,簡稱「TAP1」)與抗原胜肽轉運蛋白質2(antigen peptide transporter 2,或稱為transporter antigen peptide 2,簡稱「TAP2」)所形成之異二聚體蛋白質,分別由TAP1基因以及TAP2基因所編碼。TAP可將胜肽由細胞質運送至內質網中。
TAP1及TAP2各具有一疏水性穿膜區域(domain)與一ATP-結合區域(ATP-binding domain)。先前研究發現,TAP1基因及TAP2基因的基因多態性(polymorphisms)包括第333號位置之胺基酸(位於疏水性穿膜區域),以及第637號位置之胺基酸(位於ATP-結合區域),其中,TAP第333號位置及/或第637號位置之胺基酸的變異可能會改變基質的特異性及TAP的功能。研究顯示,以罹患過敏性鼻炎之日本人作為研究個體,TAP1之多態性與過敏性鼻炎之間並無關聯性(參見Takeuchi K等人的文獻,Lack of
association between gene polymorphism of transporters associated with antigen processing and allergic rhinitis in a Japanese population.Ann Otol Rhinol Laryngol.2002;111:460-463,該文獻全文併於此處以供參考)。
然而,本案發明人研究後意外發現,對於華人而言,TAP1之對偶基中轉譯第637位置之胺基酸(TAP1-637)的密碼子以及第333位置之胺基酸(TAP1-333)的密碼子(codon)的多態性則與過敏性鼻炎之間存在高度的關聯性。因此。可透過TAP1之對偶基中轉譯第637位置之胺基酸(TAP1-637)的密碼子以及第333位置之胺基酸(TAP1-333)的密碼子(codon)的檢測,來篩檢華人中過敏性鼻炎之高危險群及/或檢測過敏性鼻炎。
本發明之一目的,在於提供一種體外篩檢是否為罹患過敏性鼻炎之高危險群的方法,包括:(1)檢測一受篩檢個體之檢體中抗原胜肽轉運蛋白質1(antigen peptide transporter 1,TAP1)之對偶基中轉譯第637位置之胺基酸(TAP1-637)的密碼子,其中該受篩檢個體係一華人;以及(2)判斷步驟(1)之檢測結果,當步驟(1)之檢測結果顯示該對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸(glycine,Gly),則判斷該受篩檢個體為罹患過敏性鼻炎之高危險群。
本發明之另一目的,在於提供一種體外檢測一鼻炎患者是否罹患過敏性鼻炎的方法,包括:(1)檢測一受檢測個體之檢體中抗原胜肽轉運蛋白質1之對偶基中轉譯第637位置之胺基
酸(TAP1-637)的密碼子,其中該個體係一華人;以及(2)判斷步驟(1)之檢測結果,當步驟(1)之檢測結果顯示該對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸,則判斷該受篩檢個體罹患過敏性鼻炎。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣,將描述於以下內容中,以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
第1圖所示為基因組DNA進行ARMS-PCR後進行電泳分析之電泳圖,其中,泳道「M」為電泳標記物(marker);泳道1為Val-333與Ile-333之異型體;泳道2為Ile-333之同型體;泳道3為Asp-637與Gly-636之異型體;泳道4為Asp-637之同型體。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣;惟,在不背離本發明精神下,本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐,不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外,除非文中有另外說明,於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。
本案發明人發現,TAP1-637的多態性與華人之過敏性鼻炎有關,若一受篩檢個體之對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸(Gly-637),則可判斷該受篩檢個體為罹患過
敏性鼻炎之高危險群,而若該受篩檢個體本身已為鼻炎患者(例如,已出現鼻炎之症狀),則可判斷該受篩檢個體罹係患過敏性鼻炎。
因此,本發明提供一種體外篩檢是否為罹患過敏性鼻炎之高危險群的方法,所述方法包括:(1)檢測一受篩檢個體之該檢體中TAP1之對偶基中轉譯第637位置之胺基酸(TAP1-637)的密碼子,其中該受篩檢個體係一華人;以及(2)判斷步驟(1)之檢測結果,當步驟(1)之檢測結果顯示該對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸,則判斷該受篩檢個體為罹患過敏性鼻炎之高危險群。
於本發明中,所謂「華人」係指具有中華血統的族群,包括例如,中國人以及台灣人。於根據本發明之部分實施態樣中,係以台灣人為受篩檢個體。
適用本發明方法步驟(1)之檢體並無特殊限制,只要該檢體包含受篩檢個體之基因組DNA(genomic DNA)即可。舉例言之,該檢體可為選自以下之至少一者:血液、血漿、尿液、唾液、指甲、皮膚、及頭髮,且較佳為血液與血漿之至少一者。此外,該檢體之用量亦無特殊限制,只要可提供所需生物訊息即可。
於本發明方法之步驟(1)中,可使用任何合宜方法來測定TAP1之對偶基中轉譯第637位置之胺基酸的密碼子。舉例言之,可於步驟(1)進行選自以下之至少一者:聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction)、擴增阻礙突變系統聚合酶連鎖反應
(amplification-refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)、聚合酶連鎖反應-限制酶片段長度多型性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis,PCR-RFLP)、及南方墨點法(southern blot)分析。如後附實施例所示,於根據本發明之部分實施態樣中,係使用針對TAP1-637之特異性引子進行ARMS-PCR,以分析所述檢體,後續再進行洋菜膠電泳分析經ARMS-PCR增幅之核酸產物。
於本發明方法之步驟(2)中,係利用步驟(1)之檢測結果來判斷受篩檢個體是否為罹患過敏性鼻炎之高危險群,其中,當步驟(1)之檢測結果顯示TAP1對偶基因之二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸(即,該受篩檢個體係屬於Asp-637同型體(homozygous))時,可判斷該受篩檢個體為罹患過敏性鼻炎之高危險群。
於本發明方法中,除了檢測檢體中TAP1之對偶基中轉譯第637位置之胺基酸的密碼子以外,可進一步檢測檢體中TAP1之對偶基中轉譯第333位置之胺基酸的密碼子的步驟,以提高篩檢的準確率。舉例言之,可於本發明之步驟(1)中更包括測定該TAP1之對偶基因序列中轉譯第333位置之胺基酸的密碼子的步驟,當測定結果顯示該對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸,且該二TAP1-333的密碼子各自對應纈胺酸或異白胺酸(即,二TAP1-333的密碼子皆對應纈胺酸、二TAP1-333的密碼子皆對應異白胺酸、或者其中一TAP1-333的密碼子係對應纈胺酸,另一TAP1-333的密碼子係對應異白胺酸),可判斷該受篩檢個體為罹患
過敏性鼻炎之高危險群。
根據本發明方法,若受篩檢個體本身已出現鼻炎症狀(例如,打噴嚏、鼻子癢、流鼻水、鼻塞等)及/或經血液常規檢查診斷為罹患鼻炎,則可利用本發明前述篩檢方法,以檢測該鼻炎患者是否係罹患過敏性鼻炎。因此,本發明亦提供一種體外檢測一鼻炎患者是否罹患過敏性鼻炎的方法,包括:(1)檢測一受檢測個體之檢體,測定TAP1之對偶基中轉譯TAP1-637的密碼子,其中該個體係一華人;以及(2)判斷步驟(1)之檢測結果,當步驟(1)之測定結果顯示該對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸,則判斷該受篩檢個體罹患過敏性鼻炎。其中,有關該受篩檢個體之選擇、檢體種類與採集方式、以及測定TAP1之對偶基中轉譯TAP1-637之密碼子的方法與較佳實施態樣等,均如上述之說明,且該檢測方法亦可進一步包括如上述之測定TAP1之對偶基因序列中轉譯第333位置之胺基酸的密碼子的步驟。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明,而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
本實施例所使用之受測個體包含160位台灣人,其中73位經診斷為患有過敏性鼻炎的患者,其餘87位為健康個體,所有受測個體皆由義大醫院(高雄市,台灣)之門診所招集,並經
受測個體同意而進行下述實驗。所述73位經診斷為患有過敏性鼻炎的患者之診斷方式係基於以下一或多種診斷標準而確診:(1)打噴嚏、水樣鼻漏(watery rhinorrhea)、及鼻塞等臨床症狀;(2)過敏性疾病的家族史;(3)血清中升高的總IgE濃度,鼻塗片(nasal smears)之嗜酸性球增多症(eosinophilia);(4)皮膚測試對於一或多個一般性的吸入性過敏原呈陽性,包括塵蟎、花草混合物(grass mix)、貓過敏原(cat allergen)、和樹木花粉混合物;及(5)對於一或多個一般性的吸入性過敏原之激發測試呈陽性。所有健康個體(即,作為控制組之個體)皆係對於前述過敏性鼻炎之相關症狀與檢測標準呈陰性。160位受測個體之性別及平均年齡係如下表1所示。
分別抽取20毫升上述160位受測個體之血液樣本至添加有肝素之真空採血管(BD Biosciences,新澤西州,美國),並立即使用QIAamp DNA Blood Mini套組(Qiagen公司,加利福尼亞州,美國),根據套組之使用說明進行基因組DNA之萃取,之後,將基因組DNA樣本儲存於-80℃,以供下述分子分析實驗使用。
使用擴增阻礙突變系統聚合酶連鎖反應(amplification-refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)分析上述B所獲得的基因組DNA樣本,以分析TAP1基因於第637號位置之胺基酸及第333號位置之胺基酸之多態性。首先,製備PCR反應混合物,添加1毫克基因體DNA、0.2毫莫耳濃度去氧核醣核苷三磷酸(deoxynucleotide triphosphates,dNTP)、0.25微克寡核苷酸引子(共4種)、2單位(unit)DNA聚合酶(Stratagene,加利福尼亞州,美國),以及添加至體積100微升之1倍反應緩衝液。其中,添加至該PCR反應混合物中之4種寡核苷酸引子,其中兩種(分別為正股與反股)寡核苷酸係設計成使其3’端核苷酸可互補至編碼333號位置之胺基酸或637號位置之胺基酸之TAP1核苷酸之兩種變異體之其中一者。另外兩種(分別為正股與反股)寡核苷酸係設計成使其互補至位於多態性的核苷酸之任一側上之不對稱距離的兩翼序列(flanking sequences),用於檢測編碼333號位置之胺基酸或637號位置之胺基酸之多態性之引子的序列係如表2與所附序列表所示。
將上述PCR反應混合物置於Perkin-Elmer 9700熱反應器(Perkin-Elmer,康涅狄格州,美國),進行ARMS-PCR,反應條件如下:於95℃進行起始變性5分鐘;於95℃進行變性1分鐘、於58℃進行黏合2分鐘、以及於72℃進行延長2分鐘,重覆35循環;並於72℃進行最終延長10分鐘。接著,將PCR反應產物以2%洋菜膠電泳進行分離,並使用溴化乙錠(ethidium bromide)進行染色。於電泳分析中,對於TAP1-637之檢測,使用長度為429鹼基對(bp)之核酸片段作為控制組核酸片段,其中除了該控制組核酸片段以外,若電泳結果僅另外顯示長度為307bp之單一核酸片段,則表示該檢體之TAP1之對偶基因序列中轉譯第637位置之胺基酸的密碼子皆對應天門冬胺酸(即,Asp-637同型體);若電泳結果僅另外顯示長度為180bp之單一核酸片段,則表示該檢體之TAP1之對偶基因序列中轉譯第637位置之胺基酸的密碼子係對應甘胺酸(即,Gly-636同型體),若同時顯示長度為307bp以及180bp之核酸片段,則表示該檢體為Asp-637與Gly-636之異型體(heterozygous))。至於TAP1-333之檢測,使用長度為533bp之核酸片段作為控制組核酸片段,其中除了該控制組核酸片段以外,若電泳結果僅另外顯示長度為241bp之單一核酸片段,則表示該檢體之TAP1之對偶基因序列中轉譯第333位置之胺基酸的密碼子皆對應異白胺酸
(即,Ile-333同型體);若電泳結果僅另外顯示長度為352bp之單一核酸片段,則表示該檢體之TAP1之對偶基因序列中轉譯第333位置之胺基酸的密碼子皆對應纈胺酸(即,Val-333同型體),若同時顯示長度為241bp以及352bp之核酸片段,則表示該檢體為Val-333與Ile-333之異型體)。
第1圖顯示四種類型之檢體的電泳實驗結果,其中,泳道「M」為電泳標記物(marker);泳道1為Val-333與Ile-333之異型體;泳道2為Ile-333之同型體;泳道3為Asp-637與Gly-636之異型體;泳道4為Asp-637之同型體。
將上述160位受測個體之樣本如上述方式進行ARMS-PCR與電泳分析,之後將所有樣本之數據進行統計分析,使用SPSS軟體(版本13.0,SPSS公司,伊利諾州,美國),利用葉茲校正(Yates' correction)進行卡方檢定(chi square test),以分析TAP1對偶基因之TAP1-637與TAP1-333之多態性與過敏性鼻炎的關聯性。統計數值以p值(p value)小於0.05視為具有統計上的顯著差異性。統計結果顯示於下表3及表4。
表3所示為TAP1對偶基因之TAP1-637與TAP1-333之多態性分析結果,其中,對偶基因之任一TAP1-333的密碼子對應纈胺酸標示為類型a、對偶基因之任一TAP1-333的密碼子對應異白胺酸標示為類型b、對偶基因之任一TAP1-637的密碼子對應天門冬胺酸標示為類型c、對偶基因之任一TAP1-637的密碼子對應甘胺酸標示為類型d;以及對偶基因之任一TAP1-333的密碼子係對應異白胺酸且任一TAP1-637的密碼子係對應天門冬胺酸標示為類型A、對偶基因之任一TAP1-333的密碼子係對應纈胺酸且任一TAP1-637的密碼子係對應甘胺酸標示為類型B、對偶基因之任一TAP1-333的密碼子係對應纈胺酸且任一TAP1-637的密碼子係對應天門冬胺酸標示為類型C、以及對偶基因之任一TAP1-333的密碼子係對應異白胺酸且任一TAP1-637的密碼子係對應甘胺酸標示為類型D。表3之結
果顯示,相較於控制組,過敏性鼻炎組之受測個體,其TAP1-637的密碼子對應甘胺酸之機率較高(即,過敏性鼻炎組之檢體呈類型d、B、或D的機率高於控制組)。
表4係將上述160位受測個體之ARMS-PCR與電泳分析結果進一步進行統整,以顯示TAP1對偶基因之二TAP1-333與二TAP1-637之多態性與過敏性鼻炎之關聯性。其中,表4所載之類型a、b、c、d、A、B、C、及D皆係如表3之定義;若單一受測個體之TAP1對偶基因皆呈類型a,則標示為「TAP1基因型a/a」,其餘基因型之標示皆依此類推。
如表4之結果所示,「TAP1基因型d/d」之受測個體
(即,TAP1對偶基因之二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸)皆患有過敏性鼻炎,且相較於控制組,數據p值小於0.05,顯示數據具有統計上的顯著差異。此外,若進一步分析TAP1-333,可將該等「TAP1基因型d/d」之受測個體區分為「TAP1基因型B/B」(即,TAP1對偶基因之二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸,且TAP1-333的密碼子皆對應纈胺酸)以及「TAP1基因型B/D」(即,TAP1對偶基因之二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸,且其中一TAP1-333的密碼子係對應纈胺酸,另一TAP1-333的密碼子係對應異白胺酸),結果顯示,相較於控制組,「TAP1基因型B/B」以及「TAP1基因型B/D」之數據p值皆小於0.05,具有統計上的顯著差異。
前述之實驗結果顯示,經由檢測對偶基中TAP1-637(或進一步合併檢測TAP1-333),當結果顯示對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸(或進一步合併檢測TAP1-333,顯示TAP1-333的密碼子各自對應纈胺酸或異白胺酸)時,則可判斷該受篩檢個體為罹患過敏性鼻炎之高危險群,且若受篩檢個體本身即為鼻炎患者,則可判斷該受篩檢之鼻炎患者係罹患過敏性鼻炎。
<110> 中國醫藥大學
<120> 篩檢過敏性鼻炎之高危險群及檢測過敏性鼻炎的方法
<130> 無
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAP1-637引子-互補於5’兩翼序列
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<211> 29
<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAP1-333引子-互補於3’兩翼序列
<400> 8
Claims (8)
- 一種體外篩檢是否為罹患過敏性鼻炎之高危險群的方法,包括:(1)檢測一受篩檢個體之檢體中抗原胜肽轉運蛋白質1(antigen peptide transporter 1,TAP1)之對偶基中轉譯第637位置之胺基酸(TAP1-637)的密碼子(codon),其中該受篩檢個體係一台灣人;以及(2)判斷步驟(1)之檢測結果,當步驟(1)之測定結果顯示該對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸(glycine),則判斷該受篩檢個體為罹患過敏性鼻炎之高危險群。
- 如請求項1所述之方法,其中步驟(1)更包括測定該TAP1之對偶基因序列中轉譯第333位置之胺基酸(TAP1-333)的密碼子;以及步驟(2)包括當步驟(1)之測定結果顯示該對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸且該二TAP1-333的密碼子皆對應纈胺酸(valine)或分別對應纈胺酸(valine)或異白胺酸(isoleucine),則判斷該受篩檢個體為罹患過敏性鼻炎之高危險群。
- 如請求項1或2所述之方法,其中該步驟(1)之檢體為選自以下之至少一者:血液、血漿、尿液、唾液、指甲、皮膚、及頭髮。
- 如請求項3所述之方法,其中該檢體為血液與血漿之至少一者。
- 一種體外檢測一鼻炎患者是否罹患過敏性鼻炎的方法,包括:(1)檢測一受檢測個體之檢體中抗原胜肽轉運蛋白質1(antigen peptide transporter 1,TAP1)之對偶基中轉譯第637位置之胺基酸(TAP1-637)的密碼子(codon),其中該個體係一台灣人;以及(2)判斷步驟(1)之檢測結果,當步驟(1)之測定結果顯示該對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸(glycine),則判斷該受篩檢個體罹患過敏性鼻炎。
- 如請求項5所述之方法,其中步驟(1)更包括測定該TAP1之對偶基因序列中轉譯第333位置之胺基酸(TAP1-333)的密碼子;以及步驟(2)包括當步驟(1)之測定結果顯示該對偶基因序列的二TAP1-637的密碼子皆對應甘胺酸且二TAP1-333的密碼子皆對應纈胺酸(valine)或分別對應纈胺酸(valine)或異白胺酸(isoleucine),則判斷該受篩檢個體罹患過敏性鼻炎。
- 如請求項5或6所述之方法,其中該步驟(1)之檢體為選自以下之至少一者:血液、血漿、尿液、唾液、指甲、皮膚、及頭髮。
- 如請求項7所述之方法,其中該檢體為血液與血漿之至少一者。
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