CN116479111A - 一种先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查方法、筛查试剂盒 - Google Patents
一种先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查方法、筛查试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子诊断领域，具体涉及一种先天性无瞳孔‑小眼球‑白内障综合征筛查方法、筛查试剂盒及其应用。本发明首次发现患有先天性无瞳孔‑小眼球‑白内障综合征的患者，其GJA8基因上均存在一个杂合突变位点c.137G＞A，而正常人该位点不存在该突变。本发明根据该突变位点开发了一组鉴定引物，该鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，通过该鉴定引物制备的筛查试剂盒，可用于先天性无瞳孔‑小眼球‑白内障综合征的早期诊断和筛查，如怀孕初期的筛查等，对优生优育作出预警，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及体外分子诊断领域，具体涉及一种先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查方法、筛查试剂盒及其应用。
背景技术
先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征是一种罕见的眼部疾病，临床表现为眼睛内无瞳孔，伴有白内障和小眼球的联合症状，遗传方式为常染色体显性遗传。迄今为止，该综合征由Kondo首次报道，只有一个家族和两个孤立的病例被报道。遗传学研究将其候选基因定位在1、5、8、11和17号染色体上，但尚未确定到某个基因。目前为止，先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征相关的致病基因还未被确定。
GJA8（Gap Junction Protein Alpha 8，GJA8）基因定位在染色体1q21.1，包括2个外显子。该基因编码一种跨膜的连接蛋白GJA8，即CX50，是间隙连接蛋白家族的成员，在间隙连接通道的形成中起关键作用。GJA8是一个与眼部晶体发育相关的基因，其突变可能与先天性白内障、白内障、先天性白内障-小角膜综合征、青光眼和小眼症有关。目前关于先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的筛查，主要根据眼科检查来诊断，且只能诊断已出生的患者。因此，开发出一种可以快速筛查先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征患者的筛查方法和试剂盒，对该疾病的早期诊断和优生优育作出预警具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查方法和筛查试剂盒，可用于先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的早期诊断和筛查，包括怀孕初期的筛查，对优生优育作出预警，具有较好的应用前景。
为了达到上述目的，本发明提供了一种先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查方法，该筛查方法包含根据GJA8基因突变位点来确定该检测对象是否为先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征患者。
进一步地，上述的GJA8基因突变位点为c.137G＞A，其突变信息为GJA8基因编码区第137位碱基由G变为A，当检测对象GJA8基因该位点的碱基由G突变为A，表明该检测对象为先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征患者。
本发明还提供了一组用于检测先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的鉴定引物，该鉴定引物是由GJA8基因突变位点c.137G＞A开发所得，该鉴定引物的核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明提供的鉴定引物可用于先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查。
本发明还提供了一种先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查试剂盒，，该筛查试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的鉴定引物。
本发明提供的筛查试剂盒可用于先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查。
进一步地，上述的筛查试剂盒可用于先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的早期诊断或/和优生优育的预警。
本发明提供的的先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查方法和筛查试剂盒，对于解决该综合征的诊断和筛查具有以下优点：
（1）本发明提供了用于先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查的基因序列多态性位点，可作为先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查和早期干预的生物靶点，应用前景广。
（2）本发明直接采用Sanger一代测序，能简单直接有效的筛查先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征患者，为患者及时发现和治疗提供指导。
（3）本发明可以用于产前诊断，对优生优育作出预警，对预防后代先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征具有重大意义，为社会减少经济负担。
附图说明
图1为本发明中的先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征家系图。
图2为本发明中正常人和患者基因组位点c.137突变情况的测序图。
实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1）临床样本的收集
在郑州市第一附属医院招募到1个先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的家系，该家系包括3名患者和4名正常家庭成员，该家系的家系图如图1所示，其中，实心圆形表示先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征患者；空心表示正常成员；箭头表示先证者。
另外还收集了400名正常人的外周血样本，并分别提取了基因组DNA。
说明：所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书，获得患者及相关家属的外周血。
2）测序及突变位点的获得
取家系中所有成员的外周静脉全血血液样本2 mL（EDTA抗凝）并分别标记，采用天根生物有限公司的血液基因组提取试剂盒提取血液样本的基因组DNA。用微量分光光度计测量DNA的浓度及纯度，每个样本的基因组DNA的OD260/OD280值在1.7-1.9之间，浓度不少于50ng/μL，总量不少于20 μg。对提取的DNA进行全外显子测序，筛选得到GJA8基因上的一个新的杂合突变位点，发现和正常成员相比，患者的GJA8基因中编码区第137位碱基由G变为A，导致该基因的编码蛋白第46位氨基酸由G变为E，将该突变位点记为c.137G＞A。根据该突变位点可以开发出一组鉴定引物，对该突变位点进行检测，用于先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的筛查。
本发明通过实验例1中筛选到的突变位点，开发了一组鉴定引物（F和R），其中，F引物为Primer-F，R引物为Primer-R，具体引物序列如下所示：
引物序列具体如下（5’→3’）：
正向引物F为Primer-F（SEQ ID NO.1）：
CGCGTTAGCAAAAACAGA；
正向引物R为Primer-R（SEQ ID NO.2）：
TCGTAGCAGACGTTCTCG。
根据开发的鉴定引物制备了一种筛查试剂盒，包括扩增试剂和测序试剂，具体如下表1和表2所示：
表1 PCR扩增试剂
| 组分 | 浓度 | 体积 |
| PCR混合液 | 2× | 1.5 mL |
| 正向引物F | 10 μM | 150 μL |
| 正向引物R | 10 μM | 150 μL |
| ddH2O | 2 mL |
其中，表1的PCR混合液中包括Taq酶、dNTP等常规PCR所需成分；
表2 GJA8基因变异分型检测试剂（包括纯化用试剂）
| 组分 | 体积 |
| 碱性磷酸酶 | 300 μL |
| 限制性内切酶 | 20 μL |
| Bigdye | 40 μL |
| 5×buffer | 200 μL |
| F引物或R引物 | 100 μL |
| ddH2O | 1 mL |
其中，该试剂盒还包含DNA标准品：正常的和带有GJA8基因c.137G＞A位点的突变体纯合子和杂合子DNA，各150μL。
PCR扩增
通过实验例1中筛选到的突变位点c.137G＞A及基因组DNA样本，以及实验例2中开发鉴定引物以及筛查试剂盒，通过该筛查试剂盒对检测对象（实验例1中提取的家系成员和400名正常人）的DNA样本进行PCR扩增，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系，进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶检测，初步确定PCR扩增产物大小是否正确，以进行后续实验。
其中，PCR扩增的具体条件如下：
PCR扩增体系为20 μL：DNA样本1 μL，2× Mix 10 μL，10 μM的鉴定引物（F和R）各1μL，ddH2O补至20μL。
PCR扩增条件为：95 ℃ 3min；95 ℃ 15s，58 ℃ 15s，72 ℃ 10s，35 cycles；72℃ 5 min；4 ℃保存。
2）PCR扩增产物的纯化
按照下表3所示配置PCR扩增产物纯化体系（10 μL），再将配置好的PCR纯化体系按照下表4的反应条件进行PCR反应。
表3 PCR产物纯化体系
| 组分 | 体积 |
| PCR扩增产物 | 7.3 μL |
| 碱性磷酸酶 | 2.5 μL |
| 限制性内切酶 | 0.2 μL |
表4 PCR产物纯化程序
| 反应温度 | 反应时间 |
| 37 ℃ | 30 min |
| 80 ℃ | 15 min |
| 12 ℃ | Hold |
3）Sanger测序检测
将上述获得的PCR扩增纯化产物进行Sanger测序，根据下表5配制PCR测序体系，纯化体系为10 μL。再将配置好的PCR测序体系按照表6的反应条件进行PCR测序反应。如果测序结果在编码区第137位碱基由碱基G突变为A，则说明该检测对象为先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征患者。
表5 PCR纯化产物测序体系
| 组分 | 体积 |
| PCR纯化产物 | 2 μL |
| 5×buffer | 1.75 μL |
| F引物或R引物（10 μM） | 0.64 μL |
| Bigdye | 0.32 μL |
| ddH2O | Up to 10 μL |
表6 PCR纯化产物测序程序
| 反应温度 | 反应时间 |
| 96 ℃ | 15 s |
| 50 ℃ | 10 s |
| 60 ℃ | 4 min（go to1 for 29 cycle） |
| 12 ℃ | Hold |
测序结果显示，家系中确诊为先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的3名患者均为GJA8的c.137G＞A的杂合突变，家系中其他成员和400例正常人对照无该位点的杂合突变，均为野生型纯合。其中，正常人和患者基因组c.137位点的突变情况测序图如图2所示，其中，图中的II-2、II-1、III-1分别是指图1家系图中的三个成员。
综上可知，本发明提供了一个与先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征相关的突变位点和一种先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查方法，通过该突变位点开发的鉴定引物和筛查试剂盒可用于先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的早期诊断和筛查，包括怀孕初期的筛查等，对优生优育作出预警，对预防后代先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征具有重大意义。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (7)
1.一种先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查方法，其特征在于，该筛查方法包含根据GJA8基因突变位点来确定该检测对象是否为先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征患者。
2.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，所述的GJA8基因突变位点为c.137G＞A，其突变信息为GJA8基因编码区第137位碱基由G变为A，当检测对象GJA8基因该位点的碱基由G突变为A，表明该检测对象为先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征患者。
3.一组用于检测先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的鉴定引物，其特征在于，该鉴定引物是由GJA8基因突变位点c.137G＞A开发所得，该鉴定引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求3所述的鉴定引物在先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查中的应用。
5.一种先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查试剂盒，其特征在于，该筛查试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的鉴定引物。
6.如权利要求5所述的筛查试剂盒在先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征筛查中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，该应用包含先天性无瞳孔-小眼球-白内障综合征的早期诊断或优生优育的预警。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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