JP2009022269A

JP2009022269A - 肥満の検査方法及び肥満の予防又は治療薬のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2009022269A
Application number: JP2008122862A
Authority: JP
Inventors: Kikuko Hotta; 紀久子堀田; Takahiro Yanagiya; 隆宏柳谷
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2007-06-21
Filing date: 2008-05-09
Publication date: 2009-02-05

Abstract

【課題】肥満を予測するための検査方法、および肥満の予防又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】ＭＴＭＲ９遺伝子上に存在する塩基の一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査する。また、ＭＴＭＲ９の発現量を変化させる物質を選択することにより肥満の予防又は治療薬のスクリーニングを行う。
【選択図】なし

Description

本発明は肥満の検査方法、及び肥満を予防又は治療するための医薬のスクリーニング方法に関する。

近年、食生活などのライフスタイルの変化に伴って、肥満の患者が増加している（非特許文献１）。肥満は糖尿病などの疾患にもつながる危険性があるため、早めに肥満発症を予測し、食生活の改善等に努めることが重要である。
肥満に寄与する要因として、遺伝的要因と環境的要因があるが、遺伝的要因として、多くの肥満関連遺伝子が報告されている（非特許文献２）。しかしながら、これらの遺伝子と肥満との関連は必ずしも明確ではなく、より正確に肥満発症を予測できる遺伝子解析法の開発が求められていた。

ＭＴＭＲ９はフォスファターゼ活性を有するミオチューブラリン関連タンパク質（myotubularin-related protein）のファミリーに分類されるタンパク質で、細胞増殖制御との関連が示唆されている（非特許文献３：なお、この文献ではＭＴＭＲ８と記載されているが、後にＭＴＭＲ９に名称が変更された）。ＭＴＭＲ９はそれ自身フォスファターゼ活性を有さず、同ファミリーに分類されるＭＴＭＲ７やＭＴＭＲ６と結合して、これらのイノシトール１，３−２リン酸フォスファターゼ活性を増加させることも報告されている（非特許文献４、５）。しかしながら、ＭＴＭＲ９の肥満への関連については全く知られていなかった。
Kopelman, P.G. Nature 404, 635-643 (2000) Snyder, E.E. et al. Obes. Res. 12, 369-439 (2004) Genomics. 2001 Jul;75(1-3):6-8 Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Aug 19;100(17):9768-73 J Cell Sci. 2006 Jul 15;119(Pt 14):2953-9

本発明は、肥満の発症や進行、さらには肥満に伴う高血圧などの合併症の発症を正確に予測するための検査方法を提供することを課題とする。本発明はまた、肥満及びその合併症の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、ＭＴＭＲ９遺伝子上に存在する塩基の一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型が肥満に関連することを見出した。さらに、ＭＴＭＲ９遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングすれば、肥満の予防・治療薬が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ＭＴＭＲ９遺伝子上に存在する塩基の一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査する方法。
（２）さらに、前記分析結果に基づいて、肥満患者における高血圧の有無を予測する、（１）の方法。
（３）前記一塩基多型が、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における多型である、（１）又は（２）の方法。
（４）配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
（５）配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
（６）ＭＴＭＲ９遺伝子またはＭＴＭＲ９遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、ＭＴＭＲ９遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、肥満の予防薬又は治療薬をスクリーニングする方法。

本発明の検査方法により、肥満の発症リスクや進行を正確に予測することができるため、肥満を予防したり、進行を抑えたりすることができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、肥満の新規な予防・治療薬を得ることができる。

＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、ミオチューブラリン関連タンパク質９（myotubularin-related protein 9）（ＭＴＭＲ９）遺伝子上に存在する塩基の一塩基多型（SNP；single nucleotide polymorphism）または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析に基づいて肥満を検査する方法である。肥満としては、例えば、ＢＭＩ（Body Mass Index；（体重kg）／（身長m）²）が２５以上の状態をいう。なお、本発明において、「検査」とは将来、肥満になるかどうかを予測するための検査、及び肥満の程度が悪化するかどうかを予測するための検査を含む。また、肥満になった場合における、高血圧などの合併症の発症の検査も含む。

ＭＴＭＲ９遺伝子としては、ヒトＭＴＭＲ９遺伝子が好ましく、例えば、GenBank Accession No. AF131216に登録された配列を有する遺伝子を挙げることができる。ただし、該遺伝子は人種の違いなどによって１又は複数の塩基に置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
ＭＴＭＲ９遺伝子上に存在する塩基の一塩基多型としては、ＭＴＭＲ９遺伝子のエクソンやイントロンに存在する塩基の一塩基多型だけでなく、ＭＴＭＲ９遺伝子の５’−隣接領域や３’−隣接領域に存在する塩基の一塩基多型も含まれる。

肥満に関連するＭＴＭＲ９遺伝子の一塩基多型は特に制限されないが、例えば、以下に示すSNP-1〜SNP-25が挙げられる。

表１において、例えば、SNP-1はGenBank Accession No. AF131216.2の64422番目の塩基におけるグアニン（G）／チミン（T）の多型を意味し、この塩基がGである場合は肥満になる確率が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、SNP-1がGG＞GT＞TTの順で肥満になる確率が高い。SNP-1はＭＴＭＲ９遺伝子の５’隣接領域内に存在するSNPである。dbSNPはNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。この欄が「novel」のSNPはdbSNPデータベースに登録されていない新規SNPである。
その他のＳＮＰについても同様であるが、いずれについても左側の塩基が肥満になりやすい塩基である（例えば、SNP-2の場合、C/AのうちCの場合が肥満になりやすく、SNP-3の場合、T/AのうちTの場合が肥満になりやすい）。
なお、SNP-1〜SNP-25について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１〜２５に示した。それぞれ６１番目の塩基が多型を有する。
これらの塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」とは
、ヒトＭＴＭＲ９遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。

上記ＳＮＰの塩基の種類を調べることによって、肥満を検査することができる。検査するＳＮＰの数は、一種類でもよいし、複数（ハプロタイプ解析）でもよい。なお、SNP-1がGであれば他のＳＮＰも左側の塩基（SNP-2＝C、SNP-3＝T、SNP-4＝G、SNP-5＝T、SNP-6＝A、SNP-7＝G、SNP-8＝C、SNP-9＝C、SNP-10＝C、SNP-11＝A、SNP-12＝T、SNP-13＝A、SNP-14＝C、SNP-15＝C、SNP-16＝C、SNP-17＝C、SNP-18＝G、SNP-19＝A、SNP-20＝A、SNP-21＝A、SNP-22＝A、SNP-23＝G、SNP-24＝A、SNP-25＝T）であるというように、上記SNPのタイプは互いに相関するため、一箇所のみを解析することによっても十分正確な肥満の予測を行うことができる。なお、ＭＴＭＲ９遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ²＞０．５の関係を満たす塩基をいう。

肥満患者においては、SNP-11がAAの場合、高血圧を呈する傾向がある。したがって、肥満患者においてＭＴＭＲ９遺伝子の一塩基多型を調べることで、肥満患者が、高血圧を引き起こす可能性について予測することもできる。

ＭＴＭＲ９遺伝子の一塩基多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、細胞、毛髪等の体毛、爪などが挙げられる。一塩基多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。

ＭＴＭＲ９遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の一塩基多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。

シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。

また、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによっても解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。

また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２Ｊａｎ１；１２（１）：１３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、ＭＴＭＲ９遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。

さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料をＰＣＲで増幅し、それを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。

ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。

なお、本発明の検査法においては、ＭＴＭＲ９遺伝子の多型に加え、他の遺伝子の多型を解析し、それらの遺伝子の多型の組合わせに基いて肥満の検査を行ってもよい。他の遺伝子としては、βアドレナリンレセプター遺伝子（日本臨床、2002 Jul;60 Suppl 7:565-70.）やレプチン遺伝子（Hum Genet., 2001, vol.108(3), p233-236）、セクレトグラニン３遺伝子（WO2006/068249）などが挙げられる。

＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、肥満を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、ＭＴＭＲ９遺伝子における上記多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
また、プライマーとしては、ＭＴＭＲ９遺伝子における上記多型部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
なお、上記のようなプローブやプライマーは肥満患者が高血圧を引き起こすかどうかを予測するためにも用いることができる。

＜３＞スクリーニング方法
本発明者の研究により、ＭＴＭＲ９は食欲調節に深く関与することが知られている弓状核、室傍核、視床下部外側野に局在することが明らかとなり、ＭＴＭＲ９はこれらの部位において食欲の調節に関与するペプチドホルモンの分泌に関与していることが強く示唆された。以上のことから、ＭＴＭＲ９遺伝子の発現を調節する物質をスクリーニングすることにより、肥満の予防薬又は治療薬となりうる候補物質を得ることができる。また、ＭＴＭＲ９の発現している室傍核は自律神経の中枢でもあり血圧調節にも関与していることから肥満に伴う、高血圧症などの合併症の予防薬又は治療薬となりうる候補物質を得ることもできる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、ＭＴＭＲ９遺伝子またはＭＴＭＲ９遺伝子
のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、ＭＴＭＲ９遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、肥満またはその合併症の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法である。

ＭＴＭＲ９遺伝子を発現する細胞としては、神経系の細胞が好ましく、SH-SY5Y細胞（ATCC CRL-2266）やBE(2)-C細胞（ATCC CRL-2268）、HIT-T15細胞（ATCC CRL-1777）などを用いることができる。また、骨格筋や脂肪細胞にも発現しているので、C2C12細胞や3T3L-1細胞なども使用できる。

ＭＴＭＲ９遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を用いる場合、ＭＴＭＲ９遺伝子のプロモーターとしては、該遺伝子の転写開始点の上流の約１０ｋｂｐを含む領域が好ましい。
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが例示できる。これらのレポーター遺伝子をＭＴＭＲ９遺伝子のプロモーターに連結し、これを哺乳類細胞に遺伝子を導入するために用いられるプラスミドに組み込み、リポフェクションなどの通常の方法にて細胞にトランスフェクションする。
上記のようなＭＴＭＲ９遺伝子を発現する神経細胞、又はレポーター遺伝子が導入された細胞に医薬候補物質を添加し、ＭＴＭＲ９遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する。

医薬候補物質としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドであってもよい。スクリーニングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。候補物質の中からＭＴＭＲ９遺伝子又はレポーター遺伝子の発現量を変化させるものを選択することにより、肥満薬の候補物質を得ることができる。なお、「変化」とは、医薬候補物質が、非添加時に比べて、ＭＴＭＲ９遺伝子の発現量を増加させること、および減少させることを含む。

ＭＴＭＲ９遺伝子の発現量はＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ、Western blotting、In situ hybridization、免疫組織染色などの方法により測定することができる。
レポーター遺伝子の発現量はレポーター遺伝子の種類にもよるが、蛍光強度などによって測定することができる。
ＭＴＭＲ９遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を変化させた物質を抗肥満薬の候補物質として選択することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。

（１）多型解析
以下のようにして、肥満に関連するＳＮＰの探索を行った。
日本各地の医療施設の外来患者から選ばれた肥満患者（ＢＭＩ≧３０）を解析の対象とした。各被検者より書面のインフォームドコンセントを得たうえで、各施設の倫理委員会及び理化学研究所の承認を得たプロトコルに基づいて解析を行った。

ＢＭＩが３０以上の日本人肥満患者（男性３９名、女性５５名の計９４名：平均年齢４７±２歳、ＢＭＩ３６．３±０．５ｋｇ／ｍ²）をケース１とした。
ＪＳＮＰデータベース（IMS-JST: Institute of Medical Science-Japan Science and Technology Agency Japanese SNP database：Nucleic. Acids. Res., 30, 158-162）に登録された一般的な日本人の群６５８名をコントロール１とした。
ＢＭＩが３０以上の日本人肥満患者（男性２８９名、女性２７５名の計５６４名：平均年齢５０±１歳、ＢＭＩ３４．４±０．２ｋｇ／ｍ²）をケース２とした。
ＢＭＩが２５未満の日本人健常人（男性２３１名、女性３３３名の計５６４名：平均年齢５６±１歳、ＢＭＩ２１．６±０．１ｋｇ／ｍ²）をコントロール２とした。
ＢＭＩが３０以上の日本人肥満患者（男性１５６名、女性２４０名の計３９６名：平均年齢４８±１歳、ＢＭＩ３４．４±０．３ｋｇ／ｍ²）をケース３とした。
ＢＭＩが２５未満の日本人健常人（男性４５６名、女性５１４名の計９７０名：平均年齢４４±１歳、ＢＭＩ２１．７±０．１ｋｇ／ｍ²）をコントロール３とした。
２次的肥満や遺伝的肥満の患者は解析対象から除いた。投薬による肥満の患者も除いた。

＜ＤＮＡの調製とＳＮＰジェノタイピング＞
試料として、各被検者の血液サンプルから染色体ＤＮＡを、通常の手順にて調製した。
ＪＳＮＰデータベースに登録されたSNPsに対して設計された約100000個のインベーダープローブ（Third Wave Technologies）を用い、94人の日本人の肥満患者（ケース１）において、インベーダーアッセイ（Ohnishi, Y. et al. J. Hum. Genet. 46, 471-477 (2001)）によりジェノタイピングを行った。これらのSNPｓのジェノタイプとアレル頻度を一般的な日本人からなる６５８人（コントロール１）と比較した。

マイナーアレルホモザイゴートまたはメジャーアレルホモザイゴートを用いた独立性の試験でＰ＜０．０１を示したＳＮＰｓを選択した。なお、コントロール１のマイナーアレル頻度が１０％未満、あるいは、ＨＷＥテストのＰ値が０．０１未満であるＳＮＰは除いた。
これらのスクリーニングによって得られた９２０のＳＮＰｓをさらに、ケース２とコントロール２とで比較した。９２０のＳＮＰｓのうち、９１８個のＳＮＰｓのジェノタイピングに成功したが、Ｐ＜０．００１を示したＳＮＰｓはＭＴＭＲ９遺伝子のイントロン９に位置するＳＮＰ（rs2293855）のみであった。このＳＮＰをさらに、ケース３とコントロール３とで比較したところ、Ｐ値は低く、肥満と有意に関連するＳＮＰであると考えられた（表２）。

ジェノタイプ分布、アレル頻度はχ２乗検定又はFisher's exact testによって解析した。ａのHWEテストはHardy-Weinberg equilibrium test（Nealsen, D.M., Ehm, M.G. & Weir,B.S. Am. J. Hum. Gent. 63, 153-1540 (1998)）を示す。ｂの相関テストは３種類のモードで行った。（１）ジェノタイプモード：２×３の分割表を用いた、ケースとコントロール間の３種類のジェノタイプの比較、（２）アレル頻度モード：２×２の分割表を用い
た、ケースとコントロール間のアレル頻度の比較、（３）メジャーアレルホモザイゴートモード：２×２の分割表を用いた、メジャーアレルホモザイゴートの頻度の比較。ｃ：危険率（Odds ratio）及び95%信頼区間（c.i.）はWoolfの方法に従った。

次に、上記ＳＮＰの周辺領域について、ＭＡＦ（マイナーアレル頻度）＞０．１５としてｄｂＳＮＰｓを検索した。インベーダーアッセイにより、約５７０ｋｂのゲノム領域に全部で６７個のＳＮＰｓがジェノタイプできた。ＬＤ分析により、ＳＮＰｓは７０ｋｂのＬＤブロックに存在することがわかった（図１）。
これらのＳＮＰｓの中から、肥満に相関が高いＳＮＰｓを上記表１に示した。
これらのいずれかのＳＮＰｓの多型を解析することにより、肥満を予測できることが示唆された。

なお、この領域にはＭＴＭＲ９のほかに、Acyl-malonyl condensing enzyme 1-like 2（ＡＭＡＣ１Ｌ２）、スレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）も含まれていた。しかしながら、AMAC1L2はイントロンがなくpolyA tractがゲノム上に存在しているのでpusudogeneである可能性が高く、また、相同性の高い配列があと3ヶ所に認められ、この領域のSNPを特定することは困難である。また、ヒトのＴＤＨはＣ末端領域とＮＡＤ⁺結合モチーフが欠損しており機能的なタンパク質が発現していないこと、ＴＤＨ遺伝子上のＳＮＰｓのＰ値は０．０１よりも大きかったことなどから、この領域の中ではＭＴＭＲ９が肥満に機能的に関連する分子であることが示唆された。

次に、上記肥満（ケース）群及びコントロール群において、ＢＭＩ、空腹時血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、血中コレステロール値、血中トリグリセリド値、血中ＨＤＬ−コレステロール値及び血圧を測定し、それらのパラメーターとSNP-11（rs2293855）の多型との関連を調べた。結果を表３に示す。
その結果、ＢＭＩ、空腹時血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、血中コレステロール値、血中トリグリセリド値、血中ＨＤＬ−コレステロール値とジェノタイプとの有意な相関はいずれの群においても見出せなかったが、肥満患者ではＳＮＰ−１１のジェノタイプがＡＡの場合に血圧（収縮時血圧、拡張時血圧のいずれも）が高い傾向を示した。

a：肥満群（ケース２，３）とコントロール群（コントロール２，３）の間でAAと（AG+GG）を比較した。
ｂ：カッコ内の数字は解析に使用した検体の数を示す。
ｃ：AG+GGと比較したときのAAのP値。
ｄ：有意差なし

さらに、血圧に関して他のパラメーターとの重回帰分析を行った。その結果（表４）、性別、年齢、ＢＭＩ、AAは血圧と有意な相関が見られた。一方で、GGは血圧と有意な関連が見られなかった。
これらの結果から、SNP-11のジェノタイプは性別、年齢などの他の変数の影響を受けることなく、血圧に相関することが示唆された。

ハプロタイプ解析〜１
表１の２５個のＳＮＰｓについて全てのＳＮＰｓがメジャーアレルであるハプロタイプの頻度を、ケース群とコントロール群とで比較した。その結果、当該ハプロタイプの頻度はケース群で０．６１、コントロール群で０．５５となり、χ²＝２０．７、Ｐ＝５．４×１０^-6で優位な差を示した。
また、２５個のＳＮＰｓのうちのSNP-3、SNP-7、SNP-8、SNP-10、SNP-13、SNP-14、SNP-19の７つのＳＮＰについて全てのＳＮＰｓがメジャーアレルであるハプロタイプのホモザイゴートの頻度を、ケース群（２，３）とコントロール群（２，３）とで比較した。その結果（表５）、全てのＳＮＰｓがメジャーアレルであるハプロタイプのホモザイゴート
はケース群において有意に（Ｐ＝７．１×１０^-8）高いことが判明した。

さらに、このハプロタイプの頻度と、年齢、ＢＭＩ、血圧の各パラメーターの関連をケース群とコントロール群とで重回帰分析によって調べた。結果を表６に示す。
それによると、このハプロタイプの頻度は、ＢＭＩおよび血圧と有意に関連することがわかった。以上より、ハプロタイプ解析によっても肥満やそれに伴う高血圧を判定できることが示唆された。

a：肥満群（ケース２，３）とコントロール群（コントロール２，３）の間で全てのＳＮＰｓがメジャーアレルであるハプロタイプのホモザイゴートの頻度をそれ以外の頻度と比
較した。
ｂ：カッコ内の数字は解析に使用した検体の数を示す。
ｃ：ハプロタイプのホモザイゴートをその他と比較したときのP値。
ｄ：有意差なし

ハプロタイプ解析〜２
次に、MTMR9遺伝子上のSNPでアレル頻度が0.15以上の６SNPｓ（表１のSNP No. 3, 7, 10, 11, 13, および19）でハプロタイプを検討した。SNPを組み合わせて肥満とコントロールでP値が最小となるハプロタイプを見いだした。その結果は表７の通りである。肥満症例、コントロールは上記と同様であり、計算はHaploView4.0で行った。

各ハプロタイプの塩基は、左から、表１のSNP No. 3, 7, 10, 11, 13, および19を示す。
*P値はそれぞれのハプロタイプとそれ以外に分けて、2(2のカイ検定を行った。
**Permutated Pはpermutation test（10,000,000回）を行った結果である。これは多重検定の補正のため使用した。

いずれの場合も、非常に低いP値を示し、Haplotype-1が肥満感受性ハプロタイプであることが示された。頻度は低いがHaplotype-7、Haplotype-8、Haplotype-10は肥満に対して防御的に作用することが示唆された。

ＭＴＭＲ９の組織分布の解析
次に、ＭＴＭＲ９の組織分布を調べるため、In situハイブリダイゼーション及び２重ラベル免疫組織化学を行った。
オスのマウス（B57BL/6、８週齢）をクレアジャパンより購入した。ペントバルビタール（100mg/kg）で麻酔した後、マウスを10%ホルマリン中性緩衝液を用いて還流した。視床下部領域を脳から切除し、Tissue Fixative (Genostaff)を用いて固定化し、パラフィンで包埋し、組織片を作製した。組織片（６μm）を脱パラフィン化し、ＲＮＡプローブをハイブリダイズさせた。
プローブは、マウスＭＴＭＲ９のｃＤＮＡ（GenBank Accession No. NM_177594）の７４８〜１１７６番目に相当する４２８ｂｐのＤＮＡ断片をｐＧＥＭ-Ｔ-Ｅａｓｙベクター（Promega）に組み込んで作製した。ＭＴＭＲ６とＭＴＭＲ７についても、それぞれ、GenBank Accession No. NM_144843の４８〜６２１およびGenBank Accession No. NM_001040699の９０〜７１５をｐCRII-TOPO（Invitrogen）組み込んだ。
これらのプラスミドからセンスとアンチセンスのＲＮＡプローブを生成させ、これをDIG RNAラベリングミックス（Roche）を用いて標識することにより調製した。
ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを、上記組織片に50℃で18時間ハイブリダイズさせた。結合した標識物質は、DIG Nucleic Acid Detection Kit （Roche）を用い、アルカリフォスファターゼ標識ＤＩＧ抗体及びアルカリフォスファターゼの基質であるNBT-BCIPを用いて検出した。
その結果、ＭＴＭＲ９のｍＲＮＡは弓状核（ＡＲＣ）、室傍核（ＰＶＮ）、視床下部外側野（ＬＨＡ）および視索上核（ＳＯＮ）のいずれにも検出された（図２）。また、ＭＴＭＲ９と相互作用することが知られているＭＴＭＲ６およびＭＴＭＲ７も同様の発現パターンを示した。

次に免疫組織染色を行った。オスのWisterラット（６週齢：クレアジャパン）から上記と同様の手順で得られた組織切片（厚さ４μｍ）を、オレキシンＢ（１：５００ Chemicon）、ＭＣＨ（melanin-concentrating hormone）（１：５００ Phenix Pharmaceuticals）、ＮＰＹ（neuro peptide Y）（１：５００ PROGEN Bioteknik）、ＰＯＭＣ（proopiomelanocortin）（１：５０００ Phenix Pharmaceuticals）、またはＭＴＭＲ７（１：２００ ABGENT）のいずれかに対するウサギポリクローナル抗体と、ＭＴＭＲ９に対するヤギポリクローナル抗体（１：２００ Abcam）の組み合わせのそれぞれと４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、蛍光標識された２次抗体（ヤギIgGに対するAlexa Fluor568ロバポリクローナル抗体、及びウサギIgGに対するAlexa Fluor488ロバポリクローナル抗体；いずれも１：２０００ Molecular Probe）を加え、室温で2時間インキュベートした。２重免疫蛍光をオリンパスのBX51顕微鏡にて観察した。

その結果（図３）、ＭＴＭＲ９タンパク質は主にＡＲＣとＬＨＡに検出された。
ＡＲＣニューロンは食欲調節に関与しており、ＮＰＹやＰＯＭＣを発現し、レプチンによって制御されてＬＨＡやＰＶＮのオレキシン発現ニューロンに神経シグナルを伝達する。２重免疫染色の結果、ＡＲＣ内では、ＭＴＭＲ９タンパク質はＮＰＹと同じ部位に局在していることが確かめられた。
一方、ＬＨＡは、食欲抑制に関与するオレキシンやＭＣＨが存在する部位である。２重免疫染色の結果、オレキシン発現ニューロンやＭＣＨ発現ニューロンはＭＴＭＲ９を共発現していることが確かめられた。
また、ＬＨＡやＡＲＣにおいてＭＴＭＲ９はＭＴＭＲ７と同じ細胞に検出できたことから、ＭＴＭＲ９は視床下部においてＭＴＭＲ７と一緒になって機能していることが示唆された。なお、ＭＴＭＲ６については適当な抗体がなかったためこの実験を行っていないが、ＭＴＭＲ７と同様、ＭＴＭＲ９と共存する可能性が示唆された。

摂食によるＭＴＭＲ９の発現量の変動
摂食のＭＴＭＲ９発現への影響を調べるために、オスのC57BL/6Jマウス（７週齢：クレアジャパン）を一晩絶食させた。一方、高脂肪食負荷のＭＴＭＲ９発現への影響を調べるため、オスのC57BL/6Jマウス（７週齢：クレアジャパン）に、４週間、通常餌（CRF-1、オリエンタル酵母）または高脂肪食（CLEA Rodent Diet Quick Fat、クレアジャパン）を与えた。通常餌は３．５９kcal/g（脂肪１４％、炭水化物６１％、タンパク質２５％）で、高脂肪食は４．２５kcal/g（脂肪３３％、炭水化物４４％、タンパク質２３％）であった。
その後、マウスをペントバルビタール（100mg/kg）で麻酔し、視床下部領域を切除し、ＲＮＡ調製のために直ちに凍結させた。
ＭＴＭＲ９、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、オレキシン、ＰＯＭＣ、およびβ−アクチンのｍＲＮＡの量を定量リアルタイムＰＣＲで調べた。Superscript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を用いて１μｇのトータルＲＮＡから逆転写反応を行った。定量ＰＣＲはABI PRISM 7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用い、SYBE
R green I dyeの二本鎖ＤＮＡへの結合によって生じる蛍光を測定することによって行った。
用いたプライマーセットは以下のとおりである。
MTMR9; 5'-GCTTATGCCTCACAGTTCGGGACA-3' （配列番号２６）
5'-TGAACTTACTCAGCTCGCCGGGCCG-3' （配列番号２７）
NPY; 5'-GTTTGGGCATTCTGGCTGAGGG -3' （配列番号２８）
5'-GTGTCTCAGGGCTGGATCTCTTGC-3' （配列番号２９）
AGRP; 5'-GTCTAAGTCTGAATGGCCTCAAG-3' （配列番号３０）
5'-GACTCGTGCAGCCTTACACAG-3' （配列番号３１）
POMC; 5'-ATAGATGTGTGGAGCTGGTGCC-3' （配列番号３２）
5'-TCATCTCCGTTGCCAGGAAACAC-3' （配列番号３３）
β-actin; 5'-GAATGGGTCAGAAGGACTCCTATG-3' （配列番号３４）
5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3' （配列番号３５）

結果を図４に示した。各遺伝子の発現量は恒常的な発現を示すβ−アクチンのｍＲＮＡ量で標準化した。
その結果、ＭＴＭＲ９のｍＲＮＡ量は一晩の絶食により上昇した。一方、1ヶ月の高脂肪食の負荷によってマウスの体重はあまり変わらなかったが（通常餌２５．６±０．３ｇ、高脂肪食２６．５±０．７ｇ）、ＭＴＭＲ９のｍＲＮＡ量は顕著に減少した。
ＮＰＹやＡＧＲＰのｍＲＮＡ量も既報のとおり絶食で増加し、高脂肪食負荷で減少したことから、ＭＴＭＲ９の発現もこれらの因子と同様に食事によって調節を受けることが示唆された。

ＭＴＭＲ６やＭＴＭＲ７はフォスファチジルイノシトール3リン酸を脱リン酸化する。フォスファチジルイノシトール3リン酸はエンドソームの機能に重要で、エンドソーム膜にエフェクタータンパク質を誘引する。ＮＰＹ結合後にＮＰＹ受容体が内在化することや、ＡＧＲＰ結合後にＡＧＲＰ受容体が内在化することが知られている。
今回、ＭＴＭＲ９が視床下部のＡＲＣ、ＬＨＡ、ＰＶＮなどに発現し、ＭＴＭＲ７（おそらくＭＴＭＲ６も）と共発現していることがわかったので、ＭＴＭＲ９はＭＴＭＲ７やＭＴＭＲ６と相互作用することにより、フォスファチジルイノシトール3リン酸の濃度を調節し、ＮＰＹなどの食欲に関係する神経ペプチドの受容体の内在化を調節し、それによって肥満と関係していることが示唆された。

SNPがmRNAの安定性に及ぼす影響の解析
表７のハプロタイプ解析によりrs2293855（SNP No. 11）のみでなく、ハプロタイプとして肥満発症に関連していることが示唆された。このハプロタイプに含まれるrs6996368（SNP No. 19）はエクソン10の非翻訳領域に存在する。また、このSNPとほぼ絶対連鎖不平衡にあるSNPが複数存在している（rs6995404（SNP No. 15）, rs7016671（SNP No. 18）, rs3779891（SNP No. 21）, rs3174048（SNP No. 24））。非翻訳領域はmRNAの安定性に関連しているのでmRNAの安定性について検討した。
ヒトMTMR9（GenBank Accession No. MN_015458, 1-7406）の配列をもとに上記5個のSNPｓのmajorアレルを持つ全長cDNA（5'非翻訳領域、3'非翻訳領域を含む）とminorアレルを持つ全長cDNAをRT-PCRにて増幅した。PCR産物をpcDNA3.1/myc-HIS(-)（Invitrogen）のNheIとXhoI制限酵素切断部位に挿入した。プラスミドをNotIで切断し、RiboMax T7 Express
System (Promega)を使用し、T7からRNAを合成しDNase処理した。SH-SY5Y細胞からM-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (PIERCE)にてcell lysateを調製した（1 mg protein/ml）。cell lysateを500倍に希釈し（200 (g protein/ml）、合成RNA10(g（10(l）に対して、cell lysate 10(lを混合し室温で120分反応した。サンプルバッファー20(l（最終濃度20mM MOPS[pH 7.0], 5mM sodium acetate, 1mM EDTA,2.2M formladehyde, 50% formamide）で反応を終了し、65(Cで１０分間加熱、変性した。それを2.2 M formaldehyde
を含む1％アガロースで電気泳動し、SYBER Greenで染色し、蛍光強度をTyphoon（Amersham）で測定した。0分の蛍光強度を100%として30分、60分、120分後の２個のハプロタイプmRNA量を比較した。独立した実験（細胞調節から）を３回行い、分解されずに残ったmRNA量の差をt-検定で解析した。

結果を図5に示す。それによると、30分、60分、120分でp<0.05の有意差を持って、Major（ハプロタイプ１）（疾患感受性ハプロタイプ）のmRNAの方が安定性が悪いことが示された。

ＭＴＭＲ９遺伝子周辺のＬＤマッピング、多型、Ｐ値を示す図。Ｐ値はケース２，３とコントロール２，３を用いたメジャーアレル頻度のＰ値を対数で示してある。SNP-11（rs2293855）周辺の全てのＳＮＰｓについてＬＤ係数（D'）を計算した。この分析で用いた全てのＳＮＰｓのマイナーアレル頻度は１５％以上であった。各ＳＮＰは４つの新規ＳＮＰｓを除いてｄｂＳＮＰの番号で示してある。真ん中にゲノム構造を示してある。＊はrs2293855である。rs2293855のＰ値を矢印で示した。弓状核（ＡＲＣ）、室傍核（ＰＶＮ）、視床下部外側野（ＬＨＡ）および視索上核（ＳＯＮ）における、ＭＴＭＲ６、ＭＴＭＲ７、ＭＴＭＲ９のIn situ hybridization の結果を示す図（写真）。ＬＨＡにおける、ＭＴＭＲ９、ＭＣＨ、ＯｒｅｘｉｎＢ、ＭＴＭＲ７の発現、およびＡＲＣにおける、ＭＴＭＲ９、ＮＰＹ、ＰＯＭＣ、ＭＴＭＲ７の発現を示す図（写真）。絶食（Ａ）または高脂肪食負荷時（Ｂ）のＭＴＭＲ９、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、ＰＯＭＣのｍＲＮＡの発現を示す図。各群ｎ＝６で行い、データは平均値±SEで示した。＊はｐ<0.05、**はｐ<0.01である。 majorアレルを有するハプロタイプとminorアレルを有するハプロタイプから合成されたmRNAの安定性を示すグラフ。データは平均値±標準偏差で示した。縦軸はarbitrary unitを、横軸は時間（分）を示す。

Claims

ＭＴＭＲ９遺伝子上に存在する塩基の一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査する方法。
さらに、前記分析結果に基づいて、肥満患者における高血圧の有無を予測する、請求項１に記載の方法。
前記一塩基多型が、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における多型である、請求項１又は２に記載の方法。
配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
ＭＴＭＲ９遺伝子またはＭＴＭＲ９遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、ＭＴＭＲ９遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、肥満の予防薬又は治療薬をスクリーニングする方法。