JP4688492B2 - 炎症性疾患の判定方法 - Google Patents

Description

本発明はＬＴ−α遺伝子等に存在する遺伝子多型を検出することを含む炎症性疾患の判定方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含む炎症性疾患診断用キット、並びにそれらの利用に関する。本発明はさらに、ＬＴ−αを利用した、炎症性疾患の治療方法及び炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法にも関する。

ライフスタイルの変化及び新しい薬理学的アプローチにも関わらず、心筋梗塞を含む冠状動脈疾患は多くの国々において主要な死亡原因となっている（Ｂｒｅｓｌｏｗ，Ｊ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３，６００−６０１，１９９７；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，Ｅ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３７，１３６０−１３６９，１９９７）。従って、それらの発症における遺伝的及び環境的因子を同定することが強く望まれている。
共通の遺伝的変異は、糖尿病や高血圧症などの生活習慣病に罹患する危険性と顕著に関連していることが知られている（Ｒｉｓｃｈ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，１５１６−１５１７，１９９６；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，１５８０−１５８１，１９９７；Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，５３６−５３９，１９９６）。多遺伝子性疾患の感受性遺伝子を同定するには、「連鎖」を利用する方法と、「関連」を利用する方法がある。連鎖解析では、疾患感受性遺伝子の座位と遺伝マーカー（主としてマイクロサテライト）の座位が連鎖しているかを検出する、すなわち遺伝子座位間の関係を調べるのに対して、関連解析では特定の遺伝マーカー（主として一塩基多型：ＳＮＰ）のどの型（アレル：対立遺伝子）が疾患と関連しているかを検出する、つまり対立遺伝子間の関係を調べる。従って、共通の変異をマーカーとして用いる関連解析は疾患関連遺伝子の局在に対する連鎖解析のよりもずっと強力といえる。一塩基多型（ＳＮＰｓ）は、疾患易罹患性や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の有用な多型マーカーとなる。ＳＮＰｓは、遺伝子産物の質や量に直接影響を与えたり、ある疾患や薬剤による重篤な副作用に対する危険性を増やすことがある。よって、多くのＳＮＰｓを探索することにより、疾患関連遺伝子の同定や薬剤による副作用を避ける診断方法の確立に寄与できることを期待される。
ヒト染色体６ｐ２１上の約１３０ｋｂの領域には、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＬＳＴ１、１Ｃ７、アログラフト炎症因子−１（ＡＩＦ−１：ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ−ｆａｃｔｏｒ−１）、Ｉ ｋａｐｐａ Ｂ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＫＢＬ）、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ Ｇ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＴＰ６Ｇ）、ＢＡＴ１、ＭＩＣＢ及びｐ５−１が存在している。ＬＴ−α（ＴＮＦ−βとしても知られる）は血管炎症過程の最初の段階に生産されるサイトカインの一つで、βシート構造がサンドイッチ状に重なったホモトリマー構造をとり、インターロイキン−１及び接着分子のような他のメディエーターを誘導することによってサイトカインカスケードを活性する（Ｒｏｓｓ，Ｒ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４０，１１５−１２６，１９９９）。サイトカインのような炎症メディエーターは、アテローマ形成やアテローマ性損傷に関与し、管腔内血栓を誘導することが知られている（Ｒｏｓｓ，Ｒ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４０，１１５−１２６，１９９９）。ＩＫＢＬは主要組織親和性複合体（ＮＨＣ）クラスＩＩ領域において６ｐ２１．３に位置している。ＩＫＢＬはＢ細胞におけるκ軽鎖遺伝子のインヒビター（ＩＫＢ）ファミリータンパク質に類似していると報告されている。ＩＫＢファミリーのタンパク質はＢ細胞内におけるκ軽鎖遺伝子エンハンサーの核因子を阻害する作用を有する。
遺伝子変異と心筋梗塞との関係については、これまでヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の遺伝的要因を判定する方法（特開２００２−１３６２９１号公報）などがある。しかしながら、上記の６ｐ２１上の約１３０ｋｂの領域に存在する遺伝子変異と心筋梗塞との関連についてはこれまで報告はない。

本発明の課題は、心筋梗塞と関連性のある遺伝子多型を同定し、その遺伝子多型を利用して心筋梗塞をはじめとする炎症性疾患を判定する方法、該方法に用いることのできるオリゴヌクレオチド、炎症性疾患診断用キット、並びに炎症性疾患の治療方法などを提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべくヒトＬＴ−α、ＩＫＢＬ、及びＢＡＴ１遺伝子内のＳＮＰｓをそれぞれ約１，０００人の心筋梗塞患者群と対照群についてマルチプレックスＰＣＲ−インベーダ法によりタイピングし、患者−対照研究（ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ）による関連解析を行った結果、これらのＳＮＰｓの頻度が統計学的に有意に心筋梗塞患者で多いことを同定した。さらに、ルシフェラーゼアッセイ法、リコンビナントプロテインを用いた実験により、これらのＳＮＰｓが該遺伝子の転写活性に影響を与え、その結果遺伝子産物量が変化し、この変化が心筋梗塞等の疾患を引き起こす可能性を見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
すなわち、本発明によれば、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）遺伝子、Ｉ Ｋａｐｐａ Ｂ−ｌｉｋｅ（ＩＫＢＬ）遺伝子、及びＢＡＴ１遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
すなわち、本発明によれば、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）遺伝子、Ｉ Ｋａｐｐａ Ｂ−ｌｉｋｅ（ＩＫＢＬ）遺伝子、及びＢＡＴ１遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
本発明によればまた、下記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
（１）配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基におけるＧ／Ａの多型
（２）配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型
（３）配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の塩基におけるＣ／Ａの多型
（４）配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の塩基におけるＴ／Ａの多型
（５）配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の塩基におけるＧ／Ｃの多型
本発明によればまた、配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８０番目から８２番目の塩基の少なくとも一つが他の塩基に置換されることによって、コードされるアミノ酸がスレオニンからアスパラギンに変異する遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
本発明によればまた、配列番号１から５に示される配列における、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも１つの部位を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、前記判定方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。
（１）配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の部位
（２）配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目部位
（３）配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の部位
（４）配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の部位
（５）配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の部位
本発明によればまた、配列番号１から５に示される配列における、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも１つの部位を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅することができ、前記判定方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。
（１）配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の部位
（２）配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目部位
（３）配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の部位
（４）配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の部位
（５）配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の部位
さらに、本発明によれば、上記のオリゴヌクレチドの１種以上を含む、炎症性疾患診断用キットが提供される。
本発明の別の側面によれば、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の発現状態の分析方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含むＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写活性の測定方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含むＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１遺伝子断片を細胞に導入し、ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写活性を阻害する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写活性阻害物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、前記ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する、上記いずれかの方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む遺伝子断片とＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することを含む、ＬＴ−αの転写制御因子のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基におけるＣ／Ａの多型を含む遺伝子断片を接着分子誘導性細胞に導入し、該細胞の接着分子の誘導化能を評価する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）の発現又は活性を抑制することを含む、炎症性疾患の治療方法が提供される。好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞である。上記方法において好ましくは、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）に対する抗体を用いる。
本発明のさらに別の側面によれば、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）の発現又は活性を抑制する物質を有効成分として含む、炎症性疾患の治療薬が提供される。好ましくは、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）の発現又は活性を抑制する物質は、リンホトキシン−αに対する抗体である。
本発明のさらに別の側面によれば、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるリンホトキシン−α（ＬＴ−α）をコードする遺伝子の発現量を分析する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）と候補物質とを接触させる工程、リンホトキシン−αの活性を測定する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較してリンホトキシン−αの活性を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。好ましくは、リンホトキシン−αの活性は、接着分子及び／又はサイトカインを誘導する活性である。好ましくは、接着分子は、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１又はＥ−セレクチンであり、サイトカインはＴＮＦである。
本発明の一例によれば、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）の発現量又は活性の低下は、ＩＫＢＬ遺伝子の発現量又は活性の増加を介したものである。

図１は、ＬＴ−α遺伝子座を含む１３０ｋｂのゲノム領域における連鎖不平衡を示す。
上：各遺伝子におけるゲノタイプされたＳＮＰｓの数を表す転写マップ。
下：本領域におけるＤ’の分布。Ｄ’はＬＴ−αのイントロン１内のＳＮＰ対他のＳＮＰで示す。
図２（Ａ）はＬＴ−αのイントロン１（２５２Ａ＞Ｇ）、図２（Ｂ）はＩＫＢＬのプロモーター領域（−６３Ｔ＞Ａ）内のＳＮＰによる転写制御活性をそれぞれ示す。＊１０Ｇ−２５２Ａと１０Ａ−２５２Ｇとの間の比較においてｐ＜０．０１：＊＊−６３Ａアレルと−６３Ｔアレル間の比較においてｐ＜０．０１（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｔ ｔｅｓｔ）。
図３は、ＬＴ−αのイントロン１に対する未知の核因子の結合を示す。矢印は核因子のＧ−アレルに対するより強い結合を示すバンドである。
図４（Ａ）は、ＨＣＡＳＭＣのみを培養した場合（白色バー）、ＨＣＡＳＭＣを２６Ｔ−ＬＴ−α（灰色バー）又は２６Ｎ−ＬＴ−α（黒色バー）（５ｎｇ／ｍｌ）を用いて４時間処理して培養した場合のＶＣＡＭ−１の相対的なｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示す。図４（Ｂ）は、ＨＣＡＳＭＣのみを培養した場合（白色バー）、ＨＣＡＳＭＣを２６Ｔ−ＬＴ−α（灰色バー）又は２６Ｎ−ＬＴ−α（黒色バー）（５ｎｇ／ｍｌ）を用いて４時間処理して培養した場合のＥ−セレクチンの相対的なｍＲＮＡ発現量を示す。結果は平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５対２６Ｔ）を示す。
図５は、ヒト冠動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）におけるＬＴ−α（２６Ａｓｎ）（２６Ｎ）のＴＮＦ誘導活性及びＳｅｌｅｃｔｉｎＥ誘導活性（相対的なｍＲＮＡ発現量）について、ＬＴ−α（２６Ｔｈｒ）（２６Ｔ）の場合と比較した結果を示す。結果は平均値±Ｓ．Ｄ．（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５対２６Ｔ）を示す。
図６は、血球系細胞株（ＨＬ−６０）におけるＬＴ−α（２６Ａｓｎ）（２６Ｎ）のＴＮＦ誘導活性及びＩＣＡＭ１誘導活性（相対的なｍＲＮＡ発現量）について、ＬＴ−α（２６Ｔｈｒ）（２６Ｔ）の場合と比較した結果を示す。結果は平均値±Ｓ．Ｄ．（＊ｐ＜０．０１対２６Ｔ）を示す。

［１］炎症性疾患の判定方法
本発明の方法は、炎症性疾患と関連性を示す特定遺伝子に存在する遺伝子多型、特には一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することによって、炎症性疾患の発症の有無、あるいは炎症性疾患の発症の可能性を判定する方法である。
上記の特定遺伝子とは、ヒト染色体６ｐ２１上の約１３０ｋｂの領域に存在するリンホトキシン−α（ＬＴ−α）遺伝子（配列番号６）、Ｉ Ｋａｐｐａ Ｂ−ｌｉｋｅ（ＩＫＢＬ）遺伝子（配列番号７）、及びＢＡＴ１遺伝子（配列番号８）より成る群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子であって、遺伝子多型は、これらの遺伝子を含むゲノムＤＮＡのエキソン、イントロン、プロモーター部分に存在する。
本発明において「リンホトキシン−α（ＬＴ−α）遺伝子、Ｉ Ｋａｐｐａ Ｂ−ｌｉｋｅ（ＩＫＢＬ）遺伝子、及びＢＡＴ１遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子に存在する遺伝子多型（一塩基多型など）を検出する」とは、（ｉ）当該遺伝子多型（遺伝子側多型と称する）を直接検出すること、及び（ｉｉ）前記遺伝子の相補配列側に存在する遺伝子多型（相補側多型と称する）を検出し、その検出結果から遺伝子側多型を推定することの双方を指すものとする。ただし、遺伝子側の塩基と相補配列側の塩基とが完全に相補的な関係にあるとは限らないという理由から、遺伝子側多型を直接検出することがより好ましい。
なお、本発明において検出対象となる相補側多型としては、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）遺伝子の相補配列、Ｉ Ｋａｐｐａ Ｂ−ｌｉｋｅ（ＩＫＢＬ）遺伝子の相補配列、及びＢＡＴ１遺伝子の相補配列から選ばれる少なくとも一つの相補配列に存在する遺伝子多型が挙げられ、より具体的には、下記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型が挙げられる。
をいう。
（１）ＬＴ−α遺伝子の相補配列における、配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基に相補的な塩基のＣ／Ｔの多型
（２）ＬＴ−α遺伝子の相補配列における、配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基に相補的な塩基のＴ／Ｃの多型
（３）ＬＴ−α遺伝子の相補配列における、配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の塩基に相補的な塩基のＧ／Ｔの多型
（４）ＩＫＢＬ遺伝子の相補配列における、配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の塩基に相補的な塩基のＡ／Ｔの多型
（５）ＢＡＴ１遺伝子の相補配列における、配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の塩基に相補的な塩基のＣ／Ｇの多型
本明細書において、遺伝子（例えばＬＴ−α遺伝子）におけるＸ番目の塩基をその位置を示す数字Ｘと、塩基を表す記号との組み合わせで示す場合がある。例えば、「１０Ｇ」とは、１０番目の位置にあるＧを示し、「１０Ａ」とは、１０番目の位置にあるＡを示し、「１０Ｇ／Ａ」とは、１０番目の位置にあるＧ又はＡを示す。
本明細書において配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基は、ＬＴ−α遺伝子のエキソン１の１番目から数えて２５２番目の塩基に相当する。また、配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の塩基は、ＬＴ−α遺伝子のエキソン１の１番目の塩基から数えて７２３番目の塩基に相当する。
従って、本明細書において配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基におけるＧ／Ａ多型は、ＬＴ−αイントロン１ ２５２Ｇ／Ａと、また配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の塩基におけるＣ／Ａの多型は、ＬＴ−αエキソン３ ７２３Ｃ／Ａと表現する場合がある。
本明細書において配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の塩基は、６３４番目の塩基を１番とした場合に下流方向に向かって６３番目（−６３番目）の塩基に相当する。また、配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の塩基は、１２５０番目の塩基を１番とした場合に下流方向に向かって２３番目（−２３番目）に相当する。
従って、本明細書において配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の塩基におけるＴ／Ａの多型は、ＩＫＢＬプロモーター−６３Ｔ／Ａと、また配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の塩基におけるＧ／Ｃの多型は、ＢＡＴ１プロモーター −２３Ｇ／Ｃと表現する場合がある。
例えば、後記表１に示すように、配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基がＧである場合（ＬＴ−αエキソン１ １０Ｇ）、配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基がＡである場合（ＬＴ−αイントロン１ ２５２Ａ）、配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の塩基がＣである場合（ＬＴ−αエキソン３ ７２３Ｃ）、配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の塩基がＡである場合（ＩＫＢＬプロモーター −６３Ａ）、配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の塩基がＧである場合（ＢＡＴ１プロモーター −２３Ｇ）は、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。
これに対し、配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基がＡである場合（ＬＴ−αエキソン１ １０Ａ）、配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基がＧである場合（ＬＴ−αイントロン１ ２５２Ｇ）、配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の塩基がＡである場合（ＬＴ−αエキソン３ ７２３Ａ）、配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の塩基がＴである場合（ＩＫＢＬプロモーター −６３Ｔ）、配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の塩基がＣである場合（ＢＡＴ１プロモーター −２３Ｃ）は、炎症性疾患が発症していない、あるいは発症の可能性が低いと判定できる。
また、配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基と配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基（エキソン１の１番目の塩基から数えて２５２番の塩基）の組み合わせの違い（１０Ｇ−２５２Ａヘテロ接合、１０Ａ−２５２Ｇヘテロ接合、１０Ａ−２５２Ａホモ接合）によってＬＴ−α発現量が異なる。従って、配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基と配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基の組み合わせが、１０Ｇ−２５２Ａヘテロ接合、１０Ａ−２５２Ｇヘテロ接合、１０Ａ−２５２Ａホモ接合であるかを検出することによっても、炎症性疾患の判定ができる。
例えば後記実施例に示すように、１０Ａ−２５２Ｇである場合は炎症のシグナルであるＬＴ−αの発現量が有意に多く、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。
また、配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の塩基におけるＣ／Ａの多型は、エキソン３中の２６番目のコドンが変化（ＡＣＣからＡＡＣ）することによってスレオニンからアスパラギンへのアミノ酸変異をもたらす。例えば後記実施例に示すように、２６番目のコドンがアスパラギンをコードする場合（２６Ｎ）は、スレオニンをコードする場合（２６Ｔ）より有意にＬＴ−αの発現量が多く、またヒト冠状動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）において細胞接着因子である血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）やＥ−セレクチンを誘導することから炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。
本明細書において、疾患の「判定」とは疾患発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断（罹患危険性の予想）、疾患の遺伝的要因の解明などをいう。
また、疾患の「判定」は、上記の一塩基多型の検出法による結果と、所望により他の多型分析（ＶＮＴＲやＲＦＬＰ）及び／又は他の検査結果と合わせて行うこともできる。
また、本明細書において、「炎症性疾患」とは、炎症性病態との相関が知られている細胞接着因子やサイトカインの誘導が認められる疾患であれば特に限定はされないが、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリマトーデス、炎症性腸炎、種々のアレルギー反応、細菌性ショック、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。
（検出対象）
遺伝子多型の検出の対象は、ゲノムＤＮＡが好ましいが、場合によっては（つまり多型部位及びその隣接領域の配列がゲノムと同一または完全相補的になっている場合）ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを使用することもできる。また、上記対象を採取する試料としては、任意の生物学的試料、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液；肝臓等の組織細胞；毛髪等の体毛等が挙げられる。ゲノムＤＮＡ等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
（増幅）
遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増幅は、例えばＰＣＲ法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で行ってもよい。
プライマーの選択は、例えば、配列番号１から５に示される配列における、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅するように行う。
プライマーは、前記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
増幅のために用いるプライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるようにフォワードプライマー又はリバースプライマーの一方が一塩基多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質等により標識することができる。
（遺伝子多型の検出）
遺伝子多型の検出は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の一塩基多型部位を含み、被検試料とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限り何等限定はない。プローブとしては、例えば配列番号１から５に示す配列における、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、又はそれらの相補配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、一塩基多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。また、プローブには、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による増幅に用いられる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）のように、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になることによって上記のブロープの条件を満たすプローブが含まれる。
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）に記載の条件等が挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の対立遺伝子型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。
遺伝子多型の検出は、制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）により行うこともできる。この方法では、一塩基多型部位がいずれの遺伝子型をとるかによって制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断されたか否かを調べ、それによって試料の多型を分析する。
遺伝子多型の検出は、増幅産物を直接配列決定することによって行ってもよい（ダイレクトシークエンシング法）。配列決定は、例えばジデオキシ法、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法等の公知の方法により行うことができる。
遺伝子多型の検出は、インベーダーアッセイにより行ってもよい。この方法では、ＳＮＰがあるかどうかテストするＤＮＡターゲットフラグメントに対して相補的配列を持つインベーダーオリゴと５’のフラップ構造を持ち、ＳＮＰを検出するための相補的オリゴ（シグナルプローブ）を使用する。まずターゲットＤＮＡに対してインベーダーオリゴとシグナルプローブをハイブリダイズさせる。この時、インベーダーオリゴとプローブは１塩基がオーバーラップする構造（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を持つ。この部分にＣｌｅａｖａｓｅ（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓから分離されたフラップ・エンドヌクレアーゼ）が作用し、ＳＮＰ部位のシグナルプローブの塩基とターゲットの塩基が相補的（ＳＮＰなし）の場合にはシグナルプローブの５’フリップが切断される。切断された５’フリップはＦＲＥＴ Ｐｒｏｂｅ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｂｅ）にハイブリダイズする。ＦＲＥＴプローブ上には蛍光色素とクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が近接しており、蛍光が抑制されるが、５’フリップＤＮＡが結合することによりＣｌｅａｖａｓｅによって蛍光色素の部分が切断され、蛍光シグナルが検出できる。
遺伝子多型の検出はまた、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ：ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ：ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、ＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）によるハイブリダイーゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断（ＣＣＭ：ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ＨＥＴ（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｍｅｔｈｏｄ）法、ＰＥＸ（ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を用いることができる。
［２］炎症性疾患診断用キット
前記のプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、これを含む炎症疾患診断用キットとして提供できる、キットは、上記遺伝子多型の分析法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液等を含んでいてもよい。
［３］ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の発現状態の分析方法
本発明によればまた、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することによって、ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の発現状態を分析することができる。
例えば、配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基がＡで、配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基（エキソン１の１番目の塩基から数えて２５２番の塩基）がＧである場合（１０Ａ−２５２Ｇハプロタイプ）は、ＬＴ−αの発現量が多いと判断できる。これに対し、配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基がＧで、配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基（エキソン１の１番目の塩基から数えて２５２番の塩基）がＡである場合（１０Ｇ−２５２Ａハプロタイプ）、配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基がＡで、配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基（エキソン１の１番目の塩基から数えて２５２番の塩基）がＡである場合（１０Ａ−２５２Ａハプロタイプ）は、ＬＴ−αの発現量が少ないと判断できる。
［４］ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写活性の測定方法
本発明によればまた、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含むＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写活性を測定することができる。
本発明の好ましい態様によれば、前記ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、一塩基多型がプロモーター部位に存在する場合は、その一塩基多型を含む遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を培養し、レポーター活性を測定すれば、一塩基多型による転写効率に違いを測定することができる。
ここでリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。
［５］ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写活性阻害物質のスクリーニング方法
本発明においては、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含むＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１遺伝子断片を細胞に導入し、ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写活性を阻害する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１転写活性阻害物質をスクリーニングすることできる。
本発明の好ましい態様によれば、前記ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、ＬＴ−αの発現量が有意に高いことが認められる一塩基多型（例えば上記１０Ａ−２５２Ｇハプロタイプ）を有する遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について培養し、候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、その候補物質はＬＴ−α転写活性阻害物質として選択することができる。
ここでリポーター遺伝子としては、上記に挙げた遺伝子が用いられる。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
上記のスクリーニング法により得られるＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写活性阻害物質もまた本発明の範囲内である。このようなＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写活性阻害物質は、心筋梗塞治療剤、抗炎症剤、免疫抑制剤などの各種薬剤の候補物質として有用である。
［６］ＬＴ−α転写制御因子のスクリーニング方法
本発明においてはまた、前記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む遺伝子断片とＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することによって、ＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写制御因子をスクリーニングすることができる。前記の一塩基多型を含む遺伝子断片とＬＴ−α、ＩＫＢＬ、又はＢＡＴ１の転写制御因子の存在が予想される物質との結合の検出は、ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解析：ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ，ＥＭＳＡ）、ＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法等によって行うことがきるが、ゲルシフト法が好ましい。ゲルシフト法では、タンパク質（転写制御因子）が結合すると、分子サイズが大きくなり電気泳動におけるＤＮＡの移動度が低下するので、^３２Ｐで標識した遺伝子断片と転写制御因子を混ぜ、ゲル電気泳動にかける。オートラジオグラフィーでＤＮＡの位置を見ると、因子の結合したＤＮＡはゆっくり動くので、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出される。
［７］炎症性疾患の治療方法及び炎症性疾患の治療薬
本発明においては、以下の実施例５で示す通り、ＬＴ−αタンパク質の動脈壁隆起性病変部での発現状態を調べた結果、心筋梗塞患者由来の動脈壁隆起性病変部内血管平滑筋細胞およびマクロファージにおいてＬＴ−αタンパク質が強く染色されており、病変の発生、進展に関連している可能性が示唆された。従って、ＬＴ−αタンパク質の発現や活性を抑制すれば病変の改善、再発又は予防が期待できる。
さらに、心筋梗塞感受性遺伝子産物であるＬＴ−αの２６Ａｓｎ変異体は、野生型（２６Ｔｈｒ）に比べて血管平滑筋細胞からの接着分子（ＶＣＡＭ−１，Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）の誘導能が強いことが知られている（Ｏｚａｋｉ ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３２，６５０−６５４，２００２）。本発明では、以下の実施例６で示す通り、ヒト冠動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）および血球系細胞株（ＨＬ−６０）におけるＬＴ−α変異体（２６Ａｓｎ）のサイトカイン誘導活性及び接着分子誘導活性について、２６Ｔｈｒの活性と比較した。その結果、図５及び６に示したように、ＬＴ−α（Ａｓｎ２６）はＬＴ−α（Ｔｈｒ２６）に比べて血管内皮細胞からのＴｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ）、ｓｅｌｅｃｔｉｎ−Ｅ ｍＲＮＡを２倍高く、ＨＬ−６０細胞からはＴＮＦ，ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）ｍＲＮＡを３倍高く誘導した。これらの結果は、ＬＴ−α（２６Ａｓｎ）が心筋梗塞等の炎症性疾患の発症、進展に関与していることを示していると共に、ＬＴ−αの活性を抑制することによる心筋梗塞等の炎症性疾患の治療が期待できる。また、ＬＴ−αの活性を抑制するための手段としては、例えば、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）に対する抗体を用いることができる。
また、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）の発現又は活性を抑制する物質を有効成分として含む、炎症性疾患の治療薬も本発明の範囲内に含まれる。ここで用いるリンホトキシン−α（ＬＴ−α）の発現又は活性を抑制する物質としては、リンホトキシン−αに対する抗体が挙げられる。また、リンホトキシン−αに対する抗体としては、ヒト抗体又はヒト化抗体を使用することもできる。
リンホトキシン−αに対する抗体は、定法により作製することができる。例えば、リンホトキシン−αに対するポリクローナル抗体は、リンホトキシン−αを抗原として哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等）を当業者に公知の方法で免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。抗原を投与する際には、適当なアジュバントを使用することもできる。血液からの抗体の分離・精製は、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって行うことができる。
リンホトキシン−αに対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを用いて作製することができる。リンホトキシン−αに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、抗体産生細胞（免疫動物から採取した脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等）とミエローマ細胞（例えば、マウスでは、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株など）とをポリエチレングリコール又はセンダイウイルスなどの融合促進剤を用いて細胞融合させることにより作製することができる。細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。
［８］炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法
上記の通り、本発明では、炎症性疾患では、リンホトキシン−αの発現又は活性の亢進が関与していることが示されたことにより、リンホトキシン−αの発現又は活性を低下させる物質は、炎症性疾患の治療薬として有用であることが判明した。本発明によればさらに、リンホトキシン−αの発現又は活性を低下させる物質をスクリーニングする方法が提供される。上記スクリーニングの一例としては、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるリンホトキシン−α（ＬＴ−α）をコードする遺伝子の発現量を分析する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。また、上記スクリーニングの別の例としては、リンホトキシン−α（ＬＴ−α）と候補物質とを接触させる工程、リンホトキシン−αの活性を測定する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較してリンホトキシン−αの活性を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。ここで言うリンホトキシン−αの活性とは、例えば、接着分子及び／又はサイトカインを誘導する活性であり、接着分子の具体例としては、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１又はＥ−セレクチンであり、サイトカインの具体例としてはＴＮＦである。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、例えば、本明細書中上記［５］に記載した各種のライブラリー等を使用することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１（関連性研究）
（１）方法
▲１▼被験者
一般に、心筋梗塞の診断には、次に挙げる３つの基準のうち２つを必要とする：（１）胸の圧迫、痛み、又は締め付けが３０分以上継続する臨床歴、（２）少なくとも一の標準又は二の胸部誘導において０．１ｍＶより大きいＳＴ−セグメント上昇、（３）通常の実験値の２倍よりも大きい血清クレアチンキナーゼ濃度における上昇。これらの基準によって心筋梗塞と診断された患者１，１３３名を被験者とした。心筋梗塞患者の被験者の年齢範囲は２８〜８５才で、平均年齢は６２．５才であった。一方、幾つかの医療機関を通じて志願した健常者１，００６名を対照とした。対照の被験者の年齢範囲は５才から８８才で、平均年齢は３８．５才であった。なお、すべての被験者は日本人であった。
▲２▼ＳＮＰ発見及びゲノタイピング
全ゲノム関連性研究のために、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ）上で利用できるＳＮＰデータベースを用いた。ＳＮＰｓのスクリーニングは既報（Ｉｉｄａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４６，６６８−６８３，２００１）に従って行った。ＬＴ−α、ＴＮＦ−α、ＬＳＴ１、１Ｃ７、アログラフト炎症因子−１（ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ−ｆａｃｔｏｒ−１（ＡＩＦ−１））、Ｉ ｋａｐｐａ Ｂ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＫＢＬ）、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ Ｇ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＴＰ６Ｇ）、ＢＡＴ１、ＭＩＣＢ及びｐ５−１を含む約１３０ｋｂの６ｐ２１上の関連領域（図１、上パネル）をスクリーニングした。スクリーニングに先立って、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースからの配列Ｙ１４７６８、ＡＰ０００５０６及びＡＣ００４１８４をアセンブリングすることによって約１３０ｋｂの参照配列を作成した。ＰＣＲプライマーデザイン、ＰＣＲ実験、ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ配列及びＳＮＰ発見のためのプロトコルはＩｉｄａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４６，６６８−６８３，２００１に記載に従った。１３０ｋｂ領域におけるＳＮＰｓはインベーダーアッセイ又はＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスによってｃａｐｉｌｌａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ３７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて既報（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４６，４７１−４７７，２００１；Ｉｉｄａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４６，６６８−６８３，２００１）に従って行った。
本実施例で使用したプライマー及びプローブを以下に記載する。
（１）ＬＴ−α（インベーダー法によりタイピング）

（２）ＩＫＢＬ（シークエンス法によりタイピング）

（３）ＢＡＴ１（インベーダー法によりタイピング）

▲３▼統計学的分析
関連性研究のための統計学的分析、ハプロタイプ頻度及びＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡、及びＬＤ係数（Ｄ’）の計算は既報（Ｙａｍａｄａ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，６８，６７４−４８５，２００１）に従って行った。
（２）実験結果
関連性研究の第１のステップとして、ハイスループットマルチプレックスＰＣＲ−インベーダーアッセイ法（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４６，４７１−４７７，２００１）を用いて９４名の心筋梗塞患者をゲノタイピングし、その結果を健常人集団に見出されるアレル頻度と比較した。約７５，０００の遺伝子をベースとしたＳＮＰｓのスクリーニングの結果、染色体６ｐ２１上のＬＴ−α遺伝子内にあるひとつのＳＮＰ（イントロン１；２５２Ａ＞Ｇ）の心筋梗塞に対する弱い関連性を同定することができた（χ^２＝９．４、ｐ＝０．００２２；マイナーアレルに対するホモ接合体対その他）。続いて全部で１，１３３名の心筋梗塞患者と１，００６の対照者をゲノタイピングした結果、χ^２値が１８．０（ｐ＝０．００００２２；マイナーアレルに対するホモ接合体対その他）及びオッズ比が１．６９（９５％コンフィデンスインターバル（ＣＩ）；１．３２−２．１５、表１）となり、その関連性はずっと顕著になった。これらのデータは、心筋梗塞感受性遺伝子がこの領域内に存在することを示した。
ＬＤマッピングのための高密度ＳＮＰマップを１６名の心筋梗塞患者と１６名の対照者からのＤＮＡのダイレクトシークエンシングによって構築した。ＴＮＦ−α、ＬＴ−β、Ｉ ｋａｐｐａＢ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＫＢＬ）、及びＢＡＴ１（図１、上パネル）に関連する分子をコードするいくつかの他の分子を含んでいる約１３０キロベースの６ｐ２１上の関連領域をスクリーニングした。該領域に全部で１８７個のＳＮＰｓを同定し、そして９４名の心筋梗塞患者と一般的な集団からの９４名の対照を１２０個のそれらのマーカーに対してゲノタイピングし、エレクトロフェログラム上でヌクレオチドシグナルのピークレベルを比較することによって大まかに推定された約１０％以上のアレル頻度に基づいて選択した。最終的に、疾患関連性遺伝子と決定するに十分に高いアレル頻度を有する２６ＳＮＰｓが（＞２５％、マイナーアレル）、ｐ５−１及びＡＩＦ−１の近くにＤ’ｄｒｏｐ ｏｆｆを伴う強いＬＤの広がりのある一つのブロックを示した（図１、下パネル）。よって心筋梗塞感受性遺伝子がこれらの２つの遺伝子座の間に位置すると結論し、試料サイズを拡大することによってこれらの２６個のＳＮＰｓをタイピングした。それらのほとんどは心筋梗塞表現型との顕著な関連性は示さなかったが、これらの２６個のＳＮＰｓのうちの４個は心筋梗塞患者と対照との間でマイナーアレルに対するホモ接合性の頻度を比較したとき、心筋梗塞との強い関連性を表した（表１）。これらのＳＮＰｓはＬＴ−αのエキソン１内の１０Ｇ＞Ａ及びエキソン３内の７２３Ｃ＞Ａ（Ｔｈｒ２６Ａｓｎ）、ＩＫＢＬのプロモーター領域内の−６３Ｔ＞Ａ、及びＢＡＴ１のプロモーター領域内の−２３Ｇ＞Ｃであった。４つの全てはほとんど完全に互いに連鎖しており、その領域内の特定のハプロタイプはそれぞれのＳＮＰ単独よりも心筋梗塞との関連性に対してより高い統計学的有意差を示した。各ＳＮＰに対するゲノタイプの分布に関するＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡は、患者群と対照群両方に対するχ^２試験によって評価し、顕著な偏差を示さなかった（ｐ＞０．０１）。これらのＳＮＰ遺伝子座はほとんど同じ程度の心筋梗塞との関連性を有しているので、ＬＴ−α、ＩＫＢＬ及びＢＡＴ１のすべてが心筋梗塞感受性に影響を及ぼす候補と考えることができた。

実施例２（ＬＴ−αのイントロン１内のＳＮＰによってもたらされる転写活性の増加）
（１）実験方法
ＬＴ−αの−３０７から２６８まで、ＩＫＢＬの−６３５から１５まで、及びＢＡＴ１の−１２３１から３０までに対応するＤＮＡ断片を、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲによって増幅し、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に５’−３’方向にクローニングした。Ｊｕｒｋｕｔ細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから入手；ＲＣＢ０８０６）は１０％ウシ胎児血清を添加したＰＲＭＩ１６４０培地内で成長させた。ＬＴ−α遺伝子における２つのＳＮＰｓ、エキソン１内の１０Ｇ＞Ａ及びイントロン１内の２５２Ａ＞Ｇがその発現レベルに影響を与えるかどうかを決定するために、両方のＳＮＰｓ（それぞれ１０Ｇ−２５２Ａ，１０Ａ−２５２Ｇ及び１０Ａ−２５２Ａハプロタイプ）を含むゲノム断片をルシフェラーゼ遺伝子転写ユニットの上流に含む３種のプラスミドを構築した。
上記Ｊｕｒｋｕｔ細胞（２×１０^６）に、１０ｕｇの上記プラスミド構築物と２．５ｕｇのｐＲＬ−ＴＫベクター（トランスフェクション効率のための内部制御）をＬｉｐｏＴＡＸＩトランスフェクション試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてトランスフェクトした。６時間後、細胞をＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びイソノミシン（１ｕＭ）（Ｓｉｇｍａ）で刺激した。２４時間後、細胞を集め、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
また、ＩＫＢＬ及びＢＡＴ１遺伝子のプロモーター領域におけるＳＮＰｓの転写効率に与える影響を同様にして調べた。
（２）実験結果
図２Ａに示すように、１０Ａ−２５２Ｇハプロタイプを含むクローンは他の２つのハプロタイプを含むクローンよりも１．５倍の転写活性を示し、エキソンにおける一つの置換ではなく、イントロン１における置換がＬＴ−α遺伝子の転写に影響を与えることを示した。すなわち、心筋梗塞に強い関連性を示すＬＴ−α遺伝子におけるこれら２つのＳＮＰｓはその発現レベルに影響を与えることがわかった。
一方、同じく心筋梗塞と顕著な関連性を示すＩＫＢＬ（−６３Ｔ＞Ａ）のプロモーター領域におけるＳＮＰは転写活性の適度な減少が認められた（図２Ｂ）。ＩＫＢＬはＩｋＢファミリーのメンバーで、ＮＦ ｋａｐｐａＢ（ＮＦ−κＢ）／ｒｅｌ ｐｏｔｅｉｎのような転写因子に対する阻害分子である（Ａｌｂｅｒｔｅｌｌａ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，３，７９３−７９９，１９９４）。ＬＴ−αプロモーター領域におけるＤＮＡ配列はＮＦ−κＢ，ＳＰ−１及びＡＰ−１／ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎを含む数種の核因子に対する結合モチーフを含むという事実から判断すると（Ｍｅｓｓｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，２０９−２１９，１９９１）、ＩＫＢＬはこれらの核因子の阻害を通じてＬＴ−αの転写を制御すると考えられる。
実施例３（ＬＴ−αのイントロン１に対する未知の核因子の結合）
（１）実験方法
Ｊｕｒｋａｔ細胞からの核抽出物が２５２Ａ又は２５２Ｇアレルを含むゲノム配列に対応するオリゴヌクレオチドに結合できるかどうかを調べた。Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ，Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１１，２４９９，１９９１に記載したように、Ｊｕｒｋａｔ細胞から調製した核抽出物をジオキシゲニン（ＤＩＧ）−１１−ｄｄＵＴＰにて標識した３３ｂｐのオリゴヌクレオチドとＤＩＧ−ｇｅｌ ｓｈｉｆｔ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてインキュベートした。競合研究のために、未標識のオリゴヌクレオチド（１００倍過剰）をＤＩＧ−標識オリゴヌクレオチドの添加前に核抽出物と前培養した。タンパク質／ＤＮＡ複合体を０．５×Ｔｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中、未変性７％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルをニトロセルロース膜に移し、シグナルの検出を化学発光検出システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて製造者の指示に従って行った。
（２）実験結果
図３に示すように、Ｇアレルに対応するオリゴヌクレオチドを用いたとき現れるバンドはＡアレルに対応するバンドよりも強く、これはＪｕｒｋａｔ細胞に存在する幾つかの核因子がＡアレルに対するよりもＧアレルに対してより強固に結合したことを示す。実験は３回行い同様な結果を得た。この結果はこの領域に結合することによってＬＴ−αの転写を制御する一つ又はそれ以上の核抽出物における未同定の分子が心筋梗塞に関連しているかもしれないことを示す。
実施例４（ＬＴ−αタンパク質内のＴ２６Ｎ変異による接着分子の誘導）
（１）実験方法
ＬＴ−α産物は、その炎症プロセスへの寄与のように、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び種々の白血球から接着分子及びサイトカインを誘導することができる（（Ｒｏｓｓ，Ｒ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４０，１１５−１２６，１９９９；Ｗａｒｅ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８，１７５−２１８，１９９５）。これらの生物学的活性が遺伝子産物におけるアミノ酸置換によって影響されるかどうかを調べた。コドン２６におけるＳＮＰはスレオニンからアスパラギンへのアミノ酸変化をもたらす。従って、各アレル（２６Ｎ−ＬＴ−αは２６Ｔ−ＬＴ−α）について接着分子及びサイトカインの発現を誘導する能力を培養したヒト冠状動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）及びヒト冠状動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）を用いて次のようにして調べた。
まず、精製した大腸菌由来組み換え体２６Ｎ−ＬＴ−α及び２６Ｔ−ＬＴ−αをｐＥＴ４３ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて調製した。ＨＣＡＥＣ及びＨＣＡＳＭＣ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．）を５ｎｇ／ｍｌのＬＴ−αタンパク質（２６Ｎ−ＬＴ−α又は２６Ｔ−ＬＴ−α）で４時間処理した。全ＲＮＡをトリゾール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離した。ｃＤＮＡを２μｇの全ＲＮＡからｄＴ１５プライミングによって調製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて合成した。ｍＲＮＡをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量した。各試験は３回繰りかえし、各試料は三重に試験した。
（２）実験結果
変異タンパクである２６Ｎ−ＬＴ−αは２６Ｔ−ＬＴ−αよりもＨＣＡＳＭＣにおいて血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）及びＥ−セレクチンｍＲＮＡについて２倍高い転写活性レベルを示した（図４）。
実施例５（ＬＴ−αタンパク質の動脈壁隆起性病変部での発現状態）
（１）実験方法
動脈壁隆起性病変部位のパラフィン包埋切片をシランコーティングスライド上に貼り付け、キシレンを用いて脱パラフィン操作を行った。その後、マイクロウェーブにより抗原性を賦活し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害するために３％過酸化水素水／エタノールで１５分処理し、非特異的反応を抑えるために５％スキムミルク液でブロッキング反応を行った。５μｇ／ｍｌの抗ＬＴ−α抗体（Ｒ ＆ Ｄ社）を用いて、４０℃、一晩反応し、洗浄後、２次抗体（ｒａｂｂｉｔ ＥＮＶＩＳＩＯＮ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ；ＤＡＫＯ社）を加え、室温で１時間反応した。ペルオキシダーゼ基質を用いて発色後、顕微鏡下でＬＴ−αタンパク質のシグナルを観察した。ネガティブコントロールとして、非免疫正常ヒツジＩｇＧ（ＤＡＫＯ社）を用いて同様に染色した。
（２）実験結果
上記の免疫染色の結果、心筋梗塞患者由来、動脈壁隆起性病変部内血管平滑筋細胞およびマクロファージにおいてＬＴ−αタンパク質が強く染色されることが確認された。この結果より、ＬＴ−αタンパク質が病変の発生、進展に関連している可能性が示唆された。
実施例６（ＬＴ−α変異体（Ａｓｎ２６）による血管内皮細胞、血球系細胞株からのサイトカイン、接着分子の誘導）
（１）実験方法
冠動脈血管内皮細胞（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社）は血管内皮細胞専用培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＨＬ−６０（ＲＩＫＥＮ ｃｅｌｌ ＢＡＮＫ）はＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）で培養した。ＬＴ−αタンパク質の作製、サイトカイン、接着分子ｍＲＮＡの誘導の評価は既報（Ｏｚａｋｉ ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３２，６５０−６５４，２００２）に従って行った。
（２）実験結果
ヒト冠動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）および血球系細胞株（ＨＬ−６０）でのＬＴ−α（２６Ａｓｎ）のサイトカイン、接着分子誘導活性について、ＬＴ−α（２６Ｔｈｒ）の場合と比較した。結果を図５及び図６に示す。図５及び図６に示した通り、ＬＴ−α（Ａｓｎ２６）はＬＴ−α（Ｔｈｒ２６）に比べて血管内皮細胞からのＴｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ）、ｓｅｌｅｃｔｉｎ−Ｅ ｍＲＮＡを２倍高く、ＨＬ−６０細胞からはＴＮＦ、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）ｍＲＮＡを３倍高く誘導した。これらの結果から、ＬＴ−α（２６Ａｓｎ）が心筋梗塞等の炎症性疾患の発症、進展に関与していることを示された。

産業上の利用の可能性

本発明の方法によれば、心筋梗塞を初めとする炎症性疾患の発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断を正確にかつ迅速に行うことができる。

Claims (7)

1. 下記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、動脈硬化性疾患の罹患危険性の予想方法。
   （１）配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基におけるＧ／Ａの多型
   （２）配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型
   （３）配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の塩基におけるＣ／Ａの多型
   （４）配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の塩基におけるＴ／Ａの多型
   （５）配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の塩基におけるＧ／Ｃの多型
2. 配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の塩基と配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目の塩基の組み合わせが、Ｇ−Ａヘテロ接合体であるか、Ａ−Ｇヘテロ接合体であるか、Ａ−Ａホモ接合体であるかを検出することを含む、動脈硬化性疾患の罹患危険性の予想方法。
3. 配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８０番目から８２番目の塩基の少なくとも一つが他の塩基に置換されることによって、コードされるアミノ酸がスレオニンからアスパラギンに変異する遺伝子多型を検出することを含む、動脈硬化性疾患の罹患危険性の予想方法。
4. 動脈硬化性が心筋梗塞である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 配列番号１から５に示される配列における、下記の（１）から（５）よりなる群から選ばれる少なくとも１つの部位を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅することができる、１９塩基以上のフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法において用いるプライマーセット。
   （１）配列番号１に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン１の塩基配列の１０番目の部位
   （２）配列番号２に示すＬＴ−α遺伝子のイントロン１の塩基配列の９０番目部位
   （３）配列番号３に示すＬＴ−α遺伝子のエキソン３の塩基配列の８１番目の部位
   （４）配列番号４に示すＩＫＢＬ遺伝子のプロモーターの塩基配列の５７２番目の部位
   （５）配列番号５に示すＢＡＴ１遺伝子のプロモーターの塩基配列の１２２８番目の部位
6. 請求項５に記載のプライマーセットを含む、動脈硬化性疾患診断用キット。
7. 動脈硬化性疾患が心筋梗塞である請求項６に記載のキット。

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