KR20050083625A

KR20050083625A - 염증성 질환의 판정방법

Info

Publication number: KR20050083625A
Application number: KR1020057002377A
Authority: KR
Inventors: 토시히로 다나카; 요조 오니시; 코이치 오자키; 아리토시 이다; 유스케 나카무라; 마사츠구 호리
Original assignee: 리켄
Priority date: 2002-08-08
Filing date: 2003-08-08
Publication date: 2005-08-26
Also published as: EP1536000B1; US20060147920A1; TWI326710B; EP1536000A4; US7754422B2; JPWO2004015100A1; WO2004015100A1; TW200406489A; AU2003254895A1; JP4688492B2; EP1536000A1

Abstract

본 발명의 목적은 심근경색과 관련이 있는 단일염기다형(SNPs)을 동정하고, 이들의 SNPs를 이용하여 심근경색을 시작으로 하는 염증성 질환을 판정하는 것이다. 본 발명에 의하면, 림포톡신-α(LT-α) 유전자, I Kappa B-like(IKBL) 유전자 및 BAT1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자에 존재하는 적어도 한 종류의 유전자 다형을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법, 전기 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드, 전기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 염증성 질환 진단용 키트 및 이들의 용도가 제공된다. 또한, 본 발명에 의하면, LT-α를 이용한 염증성 질환의 치료방법 및 염증성 질환 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

Description

염증성 질환의 판정방법{Method of Judging Inflammatory Disease}

본 발명은 LT-α(lymphotoxin-α) 유전자 등에 존재하는 유전자 다형을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법, 전기 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드, 전기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 염증성 질환 진단용 키트 및 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 LT-α를 이용한 염증성 질환의 치료방법 및 염증성 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

생활 양식의 변화 및 새로운 약리학적 접근에도 불구하고, 심근경색을 포함한 관상동맥질환은 많은 나라에서 주요한 사망원인이 되고 있다(참조: Breslow, J.L., Nature Med., 3, 600-601, 1997; Braunwald, E., N. Engl. J. Med., 337, 1360-1369, 1997). 따라서, 이들의 발증에 관한 유전적 및 환경적 인자의 동정이 강하게 요구되고 있다.

공통의 유전적 변화는 당뇨병 또는 고혈압 등의 생활 습관병에 걸릴 위험성과 현저히 관련되는 것으로 알려지고 있다(참조: Risch, N., et al., Science, 273, 1516-1517, 1996; Collins, F.S., et al., Science, 278, 1580-1581, 1997; Lander, E.S., et al., Science, 274, 536-539, 1996). 다유전자성 질환의 감수성 유전자를 동정하는 데는, 「연쇄(linkage)」를 이용하는 방법과, 「관련(association)」을 이용하는 방법이 있다. 연쇄해석에서는 질환 감수성 유전자의 좌위와 유전마커(주로, 마이크로 새털라이트)의 좌위가 연쇄하고 있는 가를 검출한다. 즉, 연쇄해석이 유전자 좌위 간의 관계를 조사하는 데 비해, 관련해석에서는 특정 유전마커(주로 단일염기다형: SNP)의 어떤 형(allele: 대립유전자)이 질환과 관계있는지를 대립유전자 간의 관계를 조사하여 검출한다. 따라서, 공통의 변이를 마커로 이용하는 관련해석은 질환관련 유전자의 국부적인 지역에 대한 연쇄해석 보다도 훨씬 강력하다고 말할 수 있다. 단일염기다형(SNPs)은 질환에 쉽게 걸리는 성질이나 약제 반응성에 관련하는 유전자를 탐색할 때 유용한 다형마커가 된다. SNPs는 유전자 산물의 질이나 양에 직접 영향을 미치거나, 어떤 질환이나 약제에 의해 중증의 부작용에 대한 위험성을 증가시키는 것이 있다. 따라서, 많은 SNPs를 탐색함으로써 질환관련 유전자의 동정이나 약제에 의한 부작용을 피할 수 있는 진단방법의 확립에 기여할 수 있다고 기대된다.

사람 염색체 6p21 상의 약 130kb의 영역에는 림포톡신-α(LT-α), 종양괴사인자-α(TNF-α), LST1, 1C7, 알로그래프트 염증인자-1(AIF-1: allograft inflammatory factor-1), I kappa B-like protein(IKBL), V-ATPase G-subunit like protein(ATP6G), BAT1, MICB 및 p5-1이 존재하고 있다. LT-α(TNF-β로도 알려짐)는 혈관염증 과정의 최초 단계에 생산되는 사이토카인의 하나이며, β시트 구조가 샌드위치 모양으로 중첩된 동형삼중체(homotrimer) 구조를 취하고, 인터루킨-1 및 접착분자와 같은 다른 매개체를 유도함으로써 사이토카인 일련반응을 활성화한다(참조: Ross, R., N. Engl. J. Med., 340, 115-126, 1999). 사이토카인과 같은 염증 매개체는 아테롬(atheroma) 형성 또는 아테롬성 손상에 관여하고, 혈관내 혈전을 유도하는 것으로 알려져 있다(참조: Ross, R., N. Engl. J. Med., 340, 115-126, 1999). IKBL은 주요 조직친화성 복합체(NHC) 클래스 I 영역의 6p21.3에 위치하고 있다. IKBL은 B세포에서의 κ경쇄유전자의 저해제(IKB) 단백질군과 유사하다고 알려져 있으며, IKB 단백질군은 B세포에서의 κ경쇄유전자 증폭자(enhancer)의 핵인자를 저해하는 작용을 가진다.

유전자 변이와 심근경색과의 관계에 대해서는 지금까지 사람 프로스타사이클린(prostacyclins) 합성효소 유전자의 다형을 분석하여 심근경색의 유전적 요인을 판정하는 방법(특개 2002-136291호 공보) 등이 있었다. 그러나, 상기의 6p21 상의 약 130kb의 영역에 존재하는 유전자 변이와 심근경색과의 관련에 대해서는 지금까지 보고된 바가 없다.

발명의 개시

본 발명의 과제는 심근경색과 관련이 있는 유전자 다형을 동정하고, 전기 유전자 다형을 이용하여 심근경색을 시작으로 하는 염증성 질환을 판정하는 방법, 전기 방법에 이용할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 염증성 질환 진단용 키트 및 염증성 질환의 치료방법 등을 제공함에 있다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위하여, 사람 LT-α, IKBL 및 BAT1 유전자 내의 SNPs를 각각 약 1,000명의 심근경색 환자군과 대조군에 대해 멀티플렉스 PCR 인베이더(multiplex PCR invader)법에 의해 분류하고, 환자-대조군 연구(case-control study)에 의한 관련해석을 수행한 결과, 이들의 SNPs의 빈도가 통계학적으로 유의하게 심근경색환자에서 많음을 동정하였다. 또한, 루시퍼라제 분석법(luciferase assay), 재조합 단백질을 이용한 실험에 의해, 이들의 SNPs가 전기 유전자의 전사활성에 영향을 미치고, 그 결과 유전자 산물량이 변화하여 전기 변화가 심근경색 등의 질환을 일으킬 가능성을 확인하였다. 본 발명은 이와 같은 관점에서 완성된 것이다.

본 발명에 의하면, 림포톡신-α(LT-α) 유전자, I Kappa B-like(IKBL) 유전자 및 BAT1 유전자로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자에 존재하는 한 종류 이상의 유전자 다형을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법이 제공된다.

아울러, 본 발명에 의하면, 림포톡신-α(LT-α) 유전자, I Kappa B-like(IKBL) 유전자 및 BAT1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자에 존재하는 한 종류 이상의 단일염기다형(SNP: single nucleotide polymorphism)을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법이 제공된다.

(1) 서열번호 1로 표시되는 LT-α유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기에서의 G/A 다형

(2) 서열번호 2로 표시되는 LT-α유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기에서의 A/G 다형

(3) 서열번호 3으로 표시되는 LT-α유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 염기에서의 C/A 다형

(4) 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 염기에서의 T/A 다형

(5) 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 염기에서의 G/C 다형

또한, 본 발명에 의하면, 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 80번째 내지 82번째의 염기 중에서 적어도 하나의 염기가 다른 염기로 치환됨에 따라 암호화된 아미노산이 트레오닌에서 아스파라긴으로 변이하는 유전자 다형을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 서열번호 1 내지 5로 표시되는 서열에서, 하기 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 부위를 포함하면서 연속하는 적어도 10염기의 서열 또는 그 상보서열에 혼성화할 수 있는, 상기 판정방법에서 탐침(probe)으로 이용하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다.

(1) 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 부위

(2) 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 부위

(3) 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 부위

(4) 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 부위

(5) 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 부위

또한, 본 발명에 의하면, 서열번호 1 내지 5로 표시되는 서열에서, 하기 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 부위를 포함하면서 연속하는 적어도 10염기의 서열 및/또는 그 상보서열을 증폭시킬 수 있는, 상기 판정방법에서 프라이머(primer)로 이용하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 상기의 올리고뉴클레오티드의 1종 이상을 포함하는 염증성 질환 진단용 키트가 제공된다.

본 발명의 다른 관점에 의하면, 하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 검출하는 단계를 포함하는, LT-α, IKBL 또는 BAT1의 발현상태의 분석방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편을 세포에 도입하고, 전기 세포를 배양하여 전기 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성 측정방법이 제공된다.

본 발명의 다른 관점에 의하면, 하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편을 세포에 도입하고, LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성을 저해하는 후보물질의 존재하에서 전기 세포를 배양하여, 전기 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성 저해물질의 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 의하면, 상기 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편의 하류에 리포터 유전자를 결합시킨 전사유닛을 세포에 도입하고, 전기 세포를 배양하여 리포터 활성을 측정함으로써, 전기 유전자의 발현을 분석하는 상기의 어느 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 하기 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 포함하는 유전자 단편과 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사억제 인자의 존재가 예상되는 시료를 접촉시켜, 전기 단편과 전사억제 인자의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 LT-α의 전사억제 인자의 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 염기에서의 C/A 다형을 포함하는 유전자 단편을 접착분자 유도성 세포에 도입하여, 전기 세포의 접착분자의 유도화능을 평가하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 림포톡신-α(LT-α)의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료방법이 제공된다. 바람직하게는, 염증성 질환은 심근경색이며, 전기 방법에서 림포톡신-α(LT-α)에 대한 항체를 이용한다.

본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 림포톡신-α(LT-α)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료제가 제공된다. 바람직하게는, 림포톡신-α(LT-α)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 림포톡신-α에 대한 항체이다.

본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 세포와 후보물질을 접촉시키는 단계, 세포 내의 림포톡신-α(LT-α)를 암호화하는 유전자의 발현량을 분석하는 단계 및 후보물질의 비존재하에서의 조건과 비교하여 전기 유전자의 발현량을 저하시키는 후보물질을 염증성 질환의 치료제로 선택하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 림포톡신-α(LT-α)와 후보물질을 접촉시키는 단계, 림포톡신-α의 활성을 측정하는 단계 및 후보물질의 비존재하에서의 조건과 비교하여 림포톡신-α의 활성을 저하시키는 후보물질을 염증성 질환 치료제로 선택하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다. 바람직하게는, 림포톡신-α의 활성은 접착분자 및/또는 사이토카인을 유도하는 활성이다. 바람직하게는, 접착분자는 VCAM-1, ICAM-1 또는 E-셀렉틴이며, 사이토카인은 TNF이다.

본 발명의 한 실시예에 의하면, 림포톡신-α(LT-α)의 발현량 또는 활성의 저하는 IKBL 유전자의 발현량 또는 활성의 증가를 가져왔다.

도 1은 LT-α 유전자를 포함하는 130kb의 게놈 영역에서의 연쇄 불평형을 도시한다(위: 각 유전자의 유전자형 분석된 SNPs의 수를 표시한 전사맵, 아래: 본 영역의 D'의 분포, D'은 LT-α의 인트론1 내의 SNP대 타 SNP로 나타낸다).

도 2(A)는 LT-α의 인트론1(252 A>G), 도 2(B)는 IKBL의 프로모터 영역(-63 T>A) 내의 SNP에 의한 전사억제 활성을 각각 도시한다. *: 10G-252A와 10A-252G 사이의 비교에서 p<0.01; **: -63A 대립유전자와 -63T 대립유전자 사이의 비교에서 p<0.01(student's t test).

도 3은 LT-α의 인트론1에 대한 미지의 핵인자 결합을 나타낸다. 화살표는 핵인자가 G-대립유전자에 대해 보다 강하게 결합함을 보여주는 밴드이다.

도 4(A)는 HCASMC 만을 배양한 경우(백색 막대), HCASMC를 26T-LT-α(회색 막대) 또는 26N-LT-α(흑색 막대)(5ng/ml)를 이용하여 4시간 처리하고 배양한 경우의 VCAM-1의 상대적인 mRNA 발현량을 각각 도시한다. 도 4(B)는 HCASMC 만을 배양한 경우(백색 막대), HCASMC를 26T-LT-α(회색 막대) 또는 26N-LT-α(흑색 막대)(5ng/ml)를 이용하여 4시간 처리하고 배양한 경우의 E-셀렉틴의 상대적인 mRNA 발현량을 도시한다. 결과는 평균값±S.D.(n=3, *p<0.01, **p<0.05 대 26T)를 도시한다.

도 5는 사람 관상동맥 혈관 내피세포(HCAEC)의 LT-α(26Asn)(26N)의 TNF 유도활성 및 E-셀렉틴 유도활성(상대적인 mRNA 발현량)에 대하여, LT-α(26Thr)(26T)의 경우와 비교한 결과를 도시한다. 결과는 평균값±S.D.(*p<0.01, **p<0.05 대 26T)를 도시한다.

도 6은 혈구계 세포주(HL-60)의 LT-α(26Asn)(26N)의 TNF 유도활성 및 ICAM1 유도활성(상대적인 mRNA 발현량)에 대하여, LT-α(26Thr)(26T)의 경우와 비교한 결과를 도시한다. 결과는 평균값±S.D.(*p<0.01 대 26T)를 도시한다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

[1] 염증성 질환의 판정방법

본 발명의 방법은 염증성 질환과 관련성을 보이는 특정 유전자에 존재하는 유전자 다형, 특히 단일염기다형(SNPs)을 검출함으로써, 염증성 질환의 발증유무, 또는 염증성 질환의 발증 가능성을 판정하는 방법이다.

상기의 특정 유전자는 사람 염색체 6p21 상의 약 130kb의 영역에 존재하는 림포톡신-α(LT-α) 유전자(서열번호 6), I Kappa B-like(IKBL) 유전자(서열번호 7) 및 BAT1 유전자(서열번호 8)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자이며, 유전자 다형은 이들의 유전자를 포함하는 게놈DNA의 엑손, 인트론, 프로모터 부분에 존재한다.

본 발명에서, 「림포톡신-α(LT-α) 유전자, I Kappa B-like(IKBL) 유전자 및, BAT1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자에 존재하는 유전자 다형(단일염기다형 등)을 검출한다」라는 것은 (i) 전기 유전자 다형(유전자측 다형으로 명명)을 직접 검출하는 것 및, (ii) 전기 유전자의 상보서열측에 존재하는 유전자 다형(상보측 다형으로 명명)을 검출하고, 그 검출결과로부터 유전자측 다형을 추정하는 상기 (i)과 (ii) 모두를 가리키는 것을 의미한다. 단, 유전자측의 다형과 상보서열측의 염기가 완전히 상보적인 관계에 있다고는 단정할 수 없으므로, 유전자측 다형을 직접 검출하는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 검출대상이 되는 상보측 다형의 예로는 림포톡신-α(LT-α) 유전자의 상보서열, I Kappa B-like(IKBL) 유전자의 상보서열 및 BAT1 유전자의 상보서열로부터 선택되는 적어도 하나의 상보서열에 존재하는 유전자 다형을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는 하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 들 수 있다.

(1) LT-α 유전자의 상보서열에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째의 염기에 상보적인 염기의 C/T 다형

(2) LT-α 유전자의 상보서열에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기에 상보적인 염기의 T/C 다형

(3) LT-α 유전자의 상보서열에 있어서, 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째의 염기에 상보적인 염기의 G/T 다형

(4) IKBL 유전자의 상보서열에 있어서, 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째의 염기에 상보적인 염기의 A/T 다형

(5) BAT1 유전자의 상보서열에 있어서, 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째의 염기에 상보적인 염기의 C/G 다형

본 명세서에서, 유전자(예를 들어, LT-α 유전자)의 X번째의 염기를 그 위치를 나타내는 숫자 X와 염기를 표시한 기호의 조합으로 표시하는 경우가 있다. 예를 들어, 「10G」라는 것은 10번째 위치에 있는 G를 표시하고, 「10A」라는 것은 10번째 위치에 있는 A를 표시하며, 「10G/A」라는 것은 10번째 위치에 있는 G 또는 A를 표시한다.

본 명세서의 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기는 LT-α 유전자의 엑손1의 첫번째 염기로부터 계산하면 252번째 염기에 해당된다. 또한, 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 염기는 LT-α 유전자의 엑손1의 첫번째 염기부터 계산하면 723번째의 염기에 해당된다.

따라서, 본 명세서의 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기에서의 G/A 다형은 LT-α 인트론1 252G/A로, 또한, 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째의 염기의 C/A 다형은 LT-α 엑손3 723C/A로 표현하는 경우가 있다.

본 명세서의 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자 프로모터 염기서열의 572번째의 염기는 634번째의 염기를 1번으로 한 경우에 하류방향으로 63번째(-63번째)의 염기에 해당된다. 또한, 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자 프로모터 염기서열의 1,228번째의 염기는 1,250번째 염기를 1번으로 한 경우에 하류방향으로 23번째(-23번째)에 해당된다.

따라서, 본 명세서의 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자 프로모터 염기서열의 572번째의 염기의 T/A 다형은 IKBL 프로모터 -63T/A로, 또한, 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자 프로모터 염기서열의 1,228번째의 염기의 G/C 다형은 BAT1 프로모터 -23G/C로 표현하는 경우가 있다.

예를 들어, 아래에 나올 표 1에 도시한 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기가 G인 경우(LT-α 엑손1 10G), 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 염기가 A인 경우(LT-α 인트론1 252A), 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 염기가 C인 경우(LT-α 엑손3 723C), 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 염기가 A인 경우(IKBL 프로모터 -63A), 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 염기가 G인 경우(BAT1 프로모터 -23G)는 염증성 질환이 발증하거나 발증 가능성이 높다고 판정할 수 있다.

이에 대해, 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기가 A인 경우(LT-α 엑손1 10A), 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 염기가 G인 경우(LT-α 인트론1 252G), 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 염기가 A인 경우(LT-α 엑손3 723A), 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 염기가 T인 경우(IKBL 프로모터 -63T), 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 염기가 C인 경우(BAT1 프로모터 -23C)는 염증성 질환이 발증하지 않거나 발증 가능성이 낮다고 판정할 수 있다.

또한, 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기와 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 염기(엑손1의 첫번째 염기로부터 계산하여 252번째 염기)의 조합의 차이(10G-252A 헤테로 접합, 10A-252G 헤테로 접합, 10A-252A 호모 접합)에 따라 LT-α 발현량이 달라진다. 따라서, 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기와 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 염기의 조합이 10G-252A 헤테로 접합, 10A-252G 헤테로 접합, 10A-252A 호모 접합인지를 검출함에 따라 염증성 질환을 판정할 수 있다.

예를 들어, 아래 실시예에 나타낸 바와 같이, 10A-252G인 경우는 염증의 신호인 LT-α의 발현량이 유의하게 많고, 염증성 질환이 발증하거나 발증 가능성이 높다고 판정할 수 있다.

또한, 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열 81번째 염기의 C/A 다형은 엑손3 중의 26번째 코돈의 변화(ACC에서 AAC)에 의해 트레오닌에서 아스파라긴으로 아미노산 변이를 초래한다. 예를 들어, 아래 실시예에 나타낸 바와 같이, 26번째의 코돈이 아스파라긴을 암호화하는 경우(26N)는, 트레오닌을 암호화하는 경우(26T) 보다 유의하게 LT-α의 발현량이 많고, 또한, 사람 관상동맥 평활근 세포(HCASMC)의 세포접착 인자인 혈관세포 접착분자-1(VCAM-1)이나 E-셀렉틴을 유도하기 때문에 염증성 질환이 발증하거나 발증 가능성이 높다고 판정할 수 있다.

본 명세서에서, 질환의 「판정」이라 함은 질환발증 유무의 판단, 질환발증 가능성의 판단(발병 위험성의 예상), 질환의 유전적 요인의 해명 등을 의미한다.

또한, 질환의 「판정」은 상기 단일염기다형의 검출법에 의한 결과뿐만 아니라, 원하는 다른 다형분석(VNTR 이나 RFLP) 및/또는 다른 검사결과와 합쳐서 판정할 수 있다.

또한, 본 명세서에서, 「염증성 질환」이라는 것은 염증성 증상과의 관계가 알려진 세포접착 인자나 사이토카인의 유도가 확인된 질환이라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 만성관절 류마티스, 전신성 에리테마토데스, 염증성 장염, 각종의 알레르기 반응, 세균성 쇼크, 심근경색이나 뇌졸중 등의 동맥경화성 질환 등을 들 수 있으며, 특히 심근경색을 들 수 있다.

(검출대상)

유전자 다형의 검출 대상은 게놈DNA가 바람직하지만 경우에 따라서는(요컨데, 다형 부위 및 그 인접 영역의 서열이 게놈과 동일 또는 완전 상보적으로 된 경우) cDNA 또는 mRNA를 사용할 수도 있다. 또한, 상기 대상을 채취하는 시료로는 임의의 생물학적 시료, 예를 들어 혈액, 골수액, 정액, 복강액, 뇨 등의 체액; 간장 등의 조직세포; 및, 모발 등의 체모 등을 들 수 있다. 게놈 DNA 등은 이들의 시료로 통상적인 방법에 따라 추출, 정제하여 조제할 수 있다.

(증폭)

유전자 다형을 검출하기에 앞서, 우선 유전자 다형을 포함하는 부분을 증폭한다. 증폭은 예를 들어, PCR법에 의해 수행하지만, 다른 공지의 증폭방법, 예를 들어 NASBA법, LCR법, SDA법, LAMP법 등으로 수행하여도 무방하다.

프라이머의 선택은 예를 들어, 서열번호 1 내지 5로 표시되는 서열에서 전기의 단일염기다형 부위를 포함하면서 연속하는 적어도 10염기 이상, 바람직하게는 10 내지 100염기, 보다 바람직하게는 10 내지 50 염기의 서열 및/또는 그 상보서열을 증폭하도록 한다.

프라이머는 상기의 단일염기다형 부위를 포함하는 소정의 염기수의 서열을 증폭하기 위한 프라이머로 기능할 수 있는 한, 전기 서열의 하나 또는 그 이상의 치환, 결실, 부가를 포함하여도 무방하다.

증폭을 위해 사용되는 프라이머는 시료가 하나의 대립유전자형의 경우에만 증폭되도록 정방향 프라이머나 역방향 프라이머의 한쪽이 단일염기다형 부위에 혼성화할 수 있게 선택하여도 좋다. 프라이머는 필요에 따라 형광물질 또는 방사성 물질 등에 의해 표지할 수 있다.

(유전자 다형의 검출)

유전자 다형의 검출은 하나의 대립유전자형에 특이적인 탐침과의 혼성화에 의해 수행할 수 있다. 탐침은 필요에 따라 형광물질 또는 방사성 물질 등의 적당한 수단에 의해 표지하여도 무방하다. 탐침은 상기의 단일염기다형 부위를 포함하고, 피험시료와 혼성화하여, 실험에 사용하는 검출조건 하에서 검출가능한 정도의 특이성을 나타내는 한, 특별한 제한은 없다. 탐침으로는 예를 들어, 서열번호 1 내지 5로 표시되는 서열에서, 상기 단일염기다형 부위를 포함하면서 연속하는 적어도 10염기 이상, 바람직하게는 10 내지 100 염기의 서열, 보다 바람직하게는 10 내지 50 염기 서열 또는 그들의 상보서열에 혼성화 할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 이용할 수 있다. 또한, 단일염기다형 부위가 탐침의 거의 중심부에 존재하도록 올리고뉴클레오티드를 선택하는 것이 바람직하다. 전기 올리고뉴클레오티드는 탐침으로 기능할 수 있는 한, 즉, 목적하는 대립유전자형의 서열과 혼성화하지만 다른 대립유전자형의 서열과는 혼성화하지 않는 조건하에서 혼성화하는 한, 전기 서열의 하나 또는 그 이상의 치환, 결실, 부가를 포함하여도 좋다. 또한, 탐침에는 RCA(rolling circle amplification)법에 의한 증폭에 사용할 수 있는 단일사슬 탐침과 같이, 게놈 DNA와 어닐링하고, 환상(環狀)이 되도록 함으로써, 상기의 탐침 조건을 만족하는 탐침이 포함된다.

본 발명에 사용되는 혼성화 조건은 대립유전자형을 구별하는 충분한 조건이다. 예를 들어, 시료가 하나의 대립유전자형의 경우에는 혼성화하지만, 다른 대립유전자형의 경우에는 혼성화하지 않도록 하는 조건, 예를 들어, 엄격한 조건(stringent condition)이다. 여기에서, 「엄격한 조건」으로서는 예를 들어, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 제 2판(Sambrook et al., 1989)에 기재된 조건 등을 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들어, 6×SSC(1×SSC의 조성: 0.15M NaCl, 0.015M 구연산나트륨, pH 7.0), 0.5% SDS, 5×Denhardt 및 100mg/ml herring sperm DNA를 포함하는 용액 중 탐침과 함께 65℃에서 하룻밤 보온하는 조건 등을 들 수 있다.

탐침은 한쪽 끝을 기판에 고정하여 DNA 칩으로 이용할 수도 있다. 이 경우, DNA 칩으로는 하나의 대립유전자형에 대응하는 탐침만이 고정되어 있어도 좋고, 양쪽의 대립유전자형에 대응하는 탐침이 고정되어 있어도 좋다.

유전자 다형의 검출은 제한효소 단편 장다형 분석법(RFLP: restriction fragment length polymorphism)에 의해 수행하여도 좋다. 이 방법으로는 단일염기다형 부위가 어떤 유전자형을 취하느냐에 따라 제한효소에 의해 절단되는지, 되지않는지가 달라지는 제한효소로 시료핵산을 제한하고, 제한된 단편의 크기를 확인하고 전기 제한효소로 시료핵산이 절단되었는지의 여부를 조사함으로써 시료의 다형을 분석한다.

유전자 다형의 검출은 증폭산물을 직접 서열 결정하여도 좋다(다이렉트 시퀀싱법). 서열결정은 예를 들어, 디디옥시법, Maxam-Gilbert법 등의 공지의 방법에 따라 수행할 수 있다.

유전자 다형의 검출은 인베이더 분석법(invader assay)에 의해 수행하여도 좋다. 이 방법으로는 SNP가 있는지 어떤지 테스트하는 DNA 타겟 단편에 대하여 상보적 서열을 가지는 인베이더 올리고와 5'의 플랩(flap) 구조를 가지며 SNP를 검출하기 위한 상보적 올리고(신호 탐침)를 사용한다. 우선, 타겟 DNA에 대하여 인베이더 올리고와 신호 탐침을 혼성화시킨다. 이 때, 인베이더 올리고와 탐침은 단일염기가 겹치는 구조(invasive structure)를 가진다. 이 부분에 클리베아제(cleavase, Archaeoglobus fulgidus로부터 분리된 flap endonuclease)가 작용하고, SNP 부위의 신호탐침의 염기와 타겟의 염기가 상보적(SNP 없음)인 경우에는 신호탐침의 5' 플립(flip)이 절단된다. 절단된 5' 플립은 FRET Probe(fluorescence resonance energy transfer probe)에 혼성화한다. FRET 탐침 상에는 형광색소와 억제제(quencher)가 접근하고 있어, 형광이 억제되지만 5' 플립 DNA가 결합함에 따라 클리베아제에 의해 형광색소의 부분이 절단되어, 형광 시그널을 검출할 수 있다.

유전자 다형의 검출은 또한, 변성구배 젤 전기영동법(DGGE: denaturing gradient gel electrophoresis), 단일사슬 형태구조 다형해석(SSCP: single strand conformation polymorphism), 대립유전자 특이적 PCR(allele-specific PCR), ASO(allele-specific oligonucleotide)에 의한 혼성화법, 미스매치 부위의 화학적 절단(CCM: chemical cleavage of mismatches), HET(heteroduplex method)법, PEX(primer extension)법, RCA(rolling circle amplification)법 등을 이용할 수가 있다.

[2] 염증성 질환 진단용 키트

전기의 프라이머 또는 탐침으로서의 올리고뉴클레오티드는 이것을 포함하는 염증 질환 진단용 키트로 제공할 수 있다. 키트는 상기 유전자 다형의 분석법에 사용되는 제한효소, 중합효소, 뉴클레오티드삼인산, 표지, 완충액 등을 포함하여도 무방하다.

[3] LT-α, IKBL 또는 BAT1의 발현상태의 분석방법

본 발명에 의하면, 또한, 상기 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 검출함으로써, LT-α, IKBL 또는 BAT1의 발현상태를 분석할 수 있다.

예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기가 A이며, 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 염기(엑손1의 첫번째 염기로부터 계산하여 252번째의 염기)가 G인 경우(10A-252G 혼성화)는 LT-α의 발현량이 많다고 판단할 수 있다. 이에 대해, 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기가 G이며, 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 염기(엑손1의 첫번째 염기로부터 계산하여 252번째의 염기)가 A인 경우(10G-252A 혼성화), 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기가 A이며, 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 염기(엑손1의 첫번째 염기로부터 계산하여 252번째의 염기)가 A인 경우(10A-252A 혼성화)는 LT-α의 발현량이 적다고 판단할 수 있다.

[4] LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성 측정방법

본 발명에 의하면, 또한, 상기 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편을 세포에 도입하고, 전기 세포를 배양하여 전기 유전자의 발현을 분석함에 따라 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 의하면, 상기 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편의 하류에 리포터 유전자를 결합시킨 전사유닛을 세포에 도입하고, 전기 세포를 배양하여 리포터 활성을 측정함에 따라 전기 유전자의 발현을 분석한다.

예를 들어, 단일염기다형이 프로모터 일부에 존재하는 경우, 그 단일염기다형을 포함하는 유전자의 하류에 리포터 유전자를 삽입한 계를 도입한 세포를 배양하고, 리포터 활성을 측정하면 단일염기다형에 의한 전사효율이 달라짐을 측정할 수 있다. 여기에서, 리포터 유전자로는 루시퍼라제, 클로람페니콜 내성 유전자, 아세틸트랜스퍼라제 또는 갈락토시다제의 등의 유전자가 이용될 수 있다.

[5] LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성 저해물질의 스크리닝 방법

본 발명에서는 상기 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편을 세포에 도입하고, LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성을 저해하는 후보물질의 존재하에서 전기 세포를 배양하고, 전기 유전자의 발현을 분석함으로써 LT-α, IKBL 또는 BAT1 전사활성 저해물질을 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 의하면, 상기 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편의 하류에 리포터 유전자를 결합시킨 전사유닛을 세포에 도입하고, 전기 세포를 배양하여 리포터 활성을 측정함으로써 전기 유전자의 발현을 분석한다.

예를 들어, LT-α의 발현량이 유의하게 높다고 확인되는 단일염기다형(예를 들어, 상기 10A-252G 일배체형(haplotype))을 가지는 유전자의 하류에 리포터 유전자를 삽입한 계를 도입한 세포를 후보물질의 존재하 또는 비존재하의 양방의 경우에 대해 배양하고, 후보물질의 존재하에서 배양을 수행한 경우에 리포터 활성이 떨어지면 그 후보물질은 LT-α 전사활성 저해물질로 선택할 수 있다. 여기에서, 리포터 유전자로서는 상기에 예로 든 유전자를 사용할 수 있다.

후보물질로서는 임의의 물질을 사용할 수 있다. 후보물질의 종류는 특별히 한정되지 않고, 개개의 저분자 합성 화합물이어도 좋으며, 천연물 추출물 중에 존재하는 화합물이어도 좋고, 또는 화합물 라이브러리, 퍼지 디스플레이 라이브러리, 조합 라이브러리(combinatorial library)어도 무방하다. 후보물질은 바람직하게는 저분자 화합물이며, 저분자 화합물의 화합물 라이브러리가 바람직하다. 화합물 라이브러리의 구축은 당업자에게 공지된 사실이며, 또한, 시판되는 화합물 라이브러리를 사용할 수도 있다.

상기의 스크리닝법에 의해 수득한 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성 저해물질 역시, 본 발명의 범위내에 있다. 이러한 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성 저해물질은 심근경색 치료제, 항염증제, 면역억제제 등의 각종 약제의 후보물질로 유용하다.

[6] LT-α 전사억제인자의 스크리닝 방법

본 발명에서는 또한, 상기 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 포함하는 유전자 단편과 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사억제 인자의 존재가 예상되는 시료를 접촉시켜 상기 단편과 전사억제 인자와의 결합을 검출함으로써, LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사억제 인자를 스크리닝할 수 있다. 상기의 단일염기다형을 포함하는 유전자 단편과 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사억제 인자의 존재가 예상되는 물질과의 결합의 검출은 젤시프트법(전기영동 이동도 시프트 해석: electrophoretic mobility shift assay, EMSA), DNase I 풋프린트법 등에 의해 수행할 수 있지만, 젤시프트법이 바람직하다. 젤시프트법으로는 단백질(전사억제 인자)이 결합하면 분자크기가 크게 되어 전기영동에서의 DNA 이동도가 저하되므로, ³²P로 표지한 유전자 단편과 전사억제 인자를 혼합하여 젤 전기영동에 건다. 자가방사법(autoradiography)으로 DNA의 위치를 확인하면, 인자가 결합한 DNA는 천천히 이동하므로 통상의 밴드보다도 늦게 이동하는 밴드로 검출된다.

[7] 염증성 질환의 치료방법 및 염증성 질환의 치료제

본 발명에서는 이하의 실시예 5에 설명된 바와 같이, LT-α 단백질의 동맥벽 융기성 병변부에서의 발현상태를 조사한 결과, 심근경색환자 유래의 동맥벽 융기성 병변부 내 혈관 평활근 세포 및 매크로파지에서의 LT-α 단백질이 강하게 염색되어 있으며, 병변의 발생, 촉진에 관련하고 있을 가능성을 나타내었다. 따라서, LT-α 단백질의 발현 또는 활성을 억제하면 병변의 개선, 예방을 기대할 수 있다.

또한, 심근경색 감수성 유전자 산물인 LT-α의 26Asn 변이체는 야생형(26Thr)에 비하여 혈관 평활근 세포로부터의 접착분자(VCAM-1, E-selectin)의 유도능이 강하다고 알려져 있다(참조: Ozaki K. et al. Nature Genetics, 32, 650-654, 2002). 본 발명에서는 이하의 실시예 6에서 설명한 바와 같이, 사람 관상동맥 혈관내피세포(HCAEC) 및 혈구계 세포주(HL-60)의 LT-α 변이체(26Asn)의 사이토카인 유도활성 및 접착분자 유도활성에 대하여, 26Thr의 활성과 비교하였다. 그 결과, 도 5 및 도 6에 도시한 바와 같이, LT-α(Asn26)는 LT-α(Thr26)에 비해 혈관내피세포로부터의 종양괴사인자(Tumor necrosis factor-α: TNF-α), E-셀렉틴 mRNA를 2배 높게, HL-60 세포로부터는 TNF, ICAM-1(intracellular cell adhesion molecule-1) mRNA를 3배 높게 유도하였다. 이들의 결과는 LT-α(26Asn)가 심근경색 등의 염증성 질환의 발증, 촉진에 관여하고 있음을 시사함과 더불어, LT-α의 활성을 억제함으로 인한 심근경색 등의 염증성 질환의 치료를 기대할 수 있다. 또한, LT-α의 활성을 억제하기 위한 수단으로는, 예를 들어, 림포톡신-α(LT-α)에 대한 항체를 이용할 수 있다.

또한, 림포톡신-α(LT-α)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료제도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 여기에서, 사용하는 림포톡신-α(LT-α)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질로는, 림포톡신-α에 대한 항체를 들 수 있다. 또한, 림포톡신-α에 대한 항체로는 인간항체 또는 인간화 항체를 사용할 수도 있다.

림포톡신-α에 대한 항체는 정법에 따라 제작할 수 있다. 예를 들어, 림포톡신-α에 대한 폴리클로날 항체는 림포톡신-α를 항원으로 포유동물(예를 들어, 마우스, 랫, 토끼, 산양, 양, 소 등)을 당업자에 공지된 방법으로 면역감작하고, 전기 포유동물로부터 혈액을 채취하여 채취한 혈액으로부터 항체를 분리, 정제함으로써 수득할 수 있다. 혈액에서 항체의 분리, 정제는 예를 들어, 원심분리, 황산암모늄 또는 폴리에틸렌글리콜을 사용한 침전, 젤여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 통상의 방법에 따라 수행할 수 있다.

림포톡신-α에 대한 모노클로날 항체는 하이브리도마를 이용하여 제작할 수 있다. 림포톡신-α에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 항체생산세포(면역동물에서 채취한 비장세포, 림프절 세포, B림프구 등)와 골수종(myeloma) 세포(예를 들어, 마우스로는 P3X63Ag8, P3U1 주, Sp2/0 주 등)를 폴리에틸렌글리콜 또는 센다이 바이러스 등의 융합촉진제를 사용하여 세포융합시킴으로써 제작할 수 있다. 세포융합 후의 하이브리도마의 선발에는 HAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine) 배지를 통상의 방법에 따라 사용할 수 있다. 수득한 하이브리도마로부터 목적하는 모노클로날 항체의 제조는 통상의 세포배양법 또는 복수(腹水)형성법에 따라, 전기 하이브리도마를 배양하고 배양 상등액 또는 복수로부터 전기 모노클로날 항체를 정제하면 좋다.

[8] 염증성 질환 치료제의 스크리닝 방법

상술한 바와 같이, 본 발명에서는 염증성 질환으로 림포톡신-α의 발현 또는 활성의 항진이 관여하고 있음이 보여짐에 따라, 림포톡신-α의 발현 또는 활성을 저하시키는 물질은 염증성 질환의 치료제로 유용하다고 판명하였다. 본 발명에 의하면, 또한, 림포톡신-α의 발현 또는 활성을 저하시키는 물질을 스크리닝하는 방법이 제공된다. 상기 스크리닝의 한 예로는 세포와 후보물질을 접촉시키는 단계, 세포 내에서 림포톡신-α(LT-α)를 암호화하는 유전자의 발현량을 분석하는 단계 및 후보물질의 비존재하의 조건과 비교하여 전기 유전자의 발현량을 저하시키는 후보물질을 염증성 질환의 치료제로 선택하는 단계에 의해 스크리닝할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝의 각 예로서는, 림포톡신-α(LT-α)와 후보물질을 접촉시키는 단계, 림포톡신-α의 활성을 측정하는 단계 및 후보물질의 비존재하의 조건과 비교하여 림포톡신-α의 활성을 저하시키는 후보물질을 염증성 질환의 치료제로 선택하는 단계에 의해 수행할 수 있다. 여기에서, 림포톡신-α의 활성이라는 것은 예를 들어, 접착분자 및/또는 사이토카인을 유도하는 활성을 의미하며, 접착분자의 구체적인 예로서는 VCAM-1, ICAM-1 또는 E-셀렉틴을 들 수 있고, 사이토카인의 구체적인 예로서는 TNF를 들 수 있다.

후보물질로서는 임의의 물질을 사용할 수 있다. 후보물질의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 본 명세서 중 상기 [5]에 기재한 각종의 라이브러리 등을 사용할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1: 관련성 연구

1. 방법

(1) 피험자

일반적으로, 심근경색의 진단에는 다음에 예를 드는 3개의 기준 중 2개를 필요로 한다:

① 흉부의 압박, 통증 또는 억압이 30분이상 지속되는 임상병력, ② 적어도 하나의 표준 또는 두 개의 흉부유도에서 0.1mV 보다 큰 ST-세그먼트 상승, ③ 통상 실험값의 2배보다도 큰 혈청 크레아틴키나아제 농도의 상승. 이들의 기준에 따라 심근경색으로 판단된 환자 1,133명을 피험자로 하였다. 심근경색 환자의 피험자 연령범위는 28 내지 85세이며, 평균연령은 62.5세였다. 한편, 몇 개의 의료기관을 통하여 지원한 건강한 보통인 1,006명을 대조군으로 하였다. 대조군의 피험자 연령범위는 5세부터 88세이며, 평균연령은 38.5세였다. 또한, 전체의 피험자는 일본인이었다.

(2) SNP 발견 및 제노타이핑(genotyping)

전체 게놈 관련성 연구를 위해, 웹사이트(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp) 상에서 이용할 수 있는 SNP 데이터베이스를 이용하였다. SNPs의 스크리닝은 기존의 정보(참조: Iida, A., et al., J. Hum. Genet., 46, 668-683, 2001)를 따라 수행하였다. LT-α, TNF-α, LST1, 1C7, 알로그래프트 염증인자-1(allograft inflammatory factor-1(AIF-1)), I Kappa B-like protein(IKBL), V-ATPase G-subunit like protein(ATP6G), BAT1, MICB 및 p5-1을 포함하는 약 130kb의 6p21 상의 관련영역(도 1의 윗부분)을 스크리닝하였다. 스크리닝에 앞서, GenBank 데이터베이스로부터 서열 Y14768, AP000506 및 AC004184를 조합하여 약 130KB의 참조서열을 작성하였다. PCR 프라이머 디자인, PCR 실험, DNA 추출, DNA 서열 및 SNP 발견을 위한 프로토콜은 [Iida, A., et al., J. Hum. Genet., 46, 668-683, 2001]의 기재사항을 따랐다. 130kb 영역의 SNPs는 인베이더 분석법 또는 PCR 산물의 다이렉트 시퀀싱에 따라 모세관 서열분석기(capillary sequencer, ABI3700, Applied Biosystems)를 이용하여 기존의 정보(참조: Ohnishi, Y., et al., J. Hum. Genet., 46, 471-477, 2001; Iida, A., et al., J. Hum. Genet., 46, 668-683, 2001)를 따라 수행하였다.

본 실시예로 사용한 프라이머 및 탐침을 이하에 기재한다.

A. LT-α(인베이더법에 의한 분석)

PCR 프라이머

정방향 프라이머: ACTCAGCCAAGGGTGCAGAG (서열번호 9)

역방향 프라이머: CTTCCTCAGGGATTGAGACCTC (서열번호 10)

탐침(괄호안은 SNP)

엑손1 10G>A

TCCAAAGCACGAAGCACGGGCAGCCCAAGGAGATGGGGCAGGAGAGCCTCACCTGCTGTG[CT]GGAGCC

CCTGGGCCCGGACGCTCAGGTCCCTTTATAGAGGAAGCGGCAGTGGCAGCGTGG (서열번호 11 및 12)

인트론1 90A>G

AGAGAAACCCCAAGGTGAGCAGAGGGAGACAGAGAGAGACAGGAAGGGAACAGAGAGGAA[TC]CATGGC

AGAAACAGAGAATGTGTGACAGAGACAATGAGACTGACAGATGGAGAGTCAGAG (서열번호 13 및 14)

엑손3 81C>A

TCACACCTTCAGCTGCCCAGACTGCCCGTCAGCACCCCAAGATGCATCTTGCCCACAGCA[CA]CCTCAA

ACCTGCTGCTCACCTCATTGGTAAACATCCACCTGACCTCCCAGACATGTCCCC (서열번호 15 및 16)

B. IKBL(시퀀싱법에 의한 분석)

PCR 프라이머

정방향 프라이머: TTTAAGGCTCAGGAGCCCAG (서열번호 17)

역방향 프라이머: TCCCTGTTGTTGTCCCACTG (서열번호 18)

시퀀스 프라이머: ATATCATGTACCCGGCAGAC (서열번호 19)

C. BAT1 (인베이더법에 의한 분석)

PCR 프라이머

정방향 프라이머: TGGTCTCACATCACTGTTACGC (서열번호 20)

역방향 프라이머: TCTTCCCGCTCGGATTCAG (서열번호 21)

탐침

AAGCTTACCTAAACAGGGAGAGCGCGTATGGCGGCAGCAACAGCGACGAAGGAGGGAAAT[GC]TGCCTT

CACTTCCGGTTGCAGGCTTCCCTCTACTCCAGCCTCCCGCCTTCTTGGCTGCAA (서열번호 22 및 23)

(3) 통계학적 분석

관련성 연구를 위한 통계학적 분석, 일배체형 빈도 및 Hardy-Weinberg 평형 및 LD계수(D')의 계산은 기존의 정보(참조: Yamada, R., et al., Am. J. Hum. Genet., 68, 674-485, 2001)에 따라 수행하였다.

2. 실험결과

관련성 연구의 제 1 단계로서, 고효율 멀티플렉스 PCR-인베이더 분석법(참조: Ohnishi, Y., et al., J. Hum. Genet., 46, 471-477, 2001)을 사용하여 94명의 심근경색환자를 제노타이핑하여, 그 결과를 건강인 집단에 확인된 대립유전자 빈도와 비교하였다. 약 75,000의 유전자를 베이스로 한 SNPs의 스크리닝 결과, 염색체 6p21 상의 LT-α 유전자 내에 있는 하나의 SNP(인트론1; 252A>G)의 심근경색에 대한 약한 관련성을 동정할 수 있었다(χ²=9.4, p=0.0022; 열성 대립유전자(minor allele)에 대한 호모 접합체 대 기타). 이어서, 전체 1,133명의 심근경색환자와 1,006명의 대조군을 제노타이핑한 결과, χ²값이 18.0(p=0.000022; 열성 대립유전자에 대한 호모 접합체 대 기타) 및 OR(odd ratio)이 1.69(95% 신뢰구간(CI); 1.32-2.15, 표 1)로 되어, 그 관련성은 매우 높아졌다. 상기 데이터들은 심근경색 감수성 유전자가 이 영역 내에 존재함을 보여주었다.

LD맵핑을 위한 고밀도 SNP 맵을 16명의 심근경색환자와 16명의 대조군으로부터 DNA 다이렉트 시퀀싱에 의해 구축하였다. TNF-α, LT-β, I Kappa B-like protein(IKBL) 및 BAT1(도 1의 윗부분)과 관련한 분자를 암호화하는 몇 개의 다른 분자를 포함하고 있는 약 130kb의 6p21 상의 관련영역을 스크리닝하였다. 전기 영역에 전부 187개의 SNPs를 동정하고, 이어 94명의 심근경색환자와 일반적인 집단의 94명의 대조를 120개의 마커에 대하여 제노타이핑하고, 염기서열분석표(electropherogram) 상에서 뉴클레오티드 시그널의 피크레벨을 비교함으로써 대략적으로 추정된 약 10% 이상의 대립유전자 빈도에 근거하여 선택하였다. 최종적으로, 질환 관련성 유전자로 결정하기에 충분히 높은 대립유전자 빈도를 가지는 26SNPs(>25%, 열성 대립유전자)가 p5-1 및 AIF-1의 근처에서 D'drop off를 수반하는 강한 LD의 영역이 있는 하나의 블록을 도시하였다(도 1의 아랫부분). 따라서, 심근경색 감수성 유전자가 이들 두 개의 유전자좌 사이에 위치한다는 결론을 얻었으며, 시료 크기를 확대함에 따라 이들 26개의 SNPs를 분석하였다. 이들의 거의 대부분은 심근경색 표현형과의 현저한 관련성은 보이지 않았지만 이들 26개의 SNPs 중 4개는 심근경색환자와 대조군 사이에서 열성 대립유전자에 대한 호모 접합성의 빈도를 비교하였을 때, 심근경색과의 강한 관련성을 나타내었다(표 1). 이들 SNPs는 LT-α의 엑손1 내의 10G>A 및 엑손3 내의 723C>A(Thr26Asn), IKBL의 프로모터 영역 내의 -63T>A 및 BAT1의 프로모터 영역 내의 -23G>C였다. 4개 전부는 거의 완전히 서로 연쇄해 있으며, 그 영역 내의 특정한 일배체형(haplotype)은 각각의 SNP 단독보다도 심근경색과의 관련성에 대해 보다 높은 통계학적 유의한 차이를 보였다. 각 SNP에 대한 제노타이프의 분포에 관한 Hardy-Weinberg 평형은 환자군과 대조군 양쪽에 대한 χ² 시험에 따라 평가하고, 현저한 편차를 보이지 않았다(p>0.01). 이들의 SNP 유전자좌는 거의 같은 정도의 심근경색과의 관련성을 가지고 있어서, LT-α, IKBL 및 BAT1의 전체가 심근경색 감수성에 영향을 미치는 후보로 생각할 수 있었다.

LT-α, IKBL, BAT1 에서의 심근경색과 SNPs의 관련성

제노타이프	심근경색(N=1,133)	대조군(N=1,006)	χ²[p value]	OR(95% CI)
LT-α 엑손1 10G>A
GG	416(36.7%)	378(37.6%)	AA vs. GG+GA21.6[0.0000033]	1.78(1.39-2.27)
GA	504(44.5%)	512(50.9%)
AA	213(18.8%)	116(11.5%)
LT-α 인트론1 252A>G
AA	413(36.5%)	371(36.9%)	GG vs. AA+AG18.0[0.000022]	1.69(1.32-2.15)
AG	511(45.1%)	516(51.3%)
GG	209(18.4%)	119(11.8%)
LT-α 엑손3 723C>A, T26N
CC	414(36.5%)	374(37.2%)	AA vs. CC+CA21.6[0.0000033]	1.78(1.39-2.27)
CA	506(44.7%)	516(51.3%)
AA	213(18.8%)	116(11.5%)
IKBL 프로모터 -63T>A
TT	406(35.8%)	374(37.2%)	AA vs. TT+TA14.5[0.000129]	1.6(1.25-2.03)
TA	521(46.0%)	509(50.6%)
AA	206(18.2%)	123(12.2%)
BAT1 프로모터 -23G>C
GG	411(36.3%)	374(37.2%)	CC vs. GG+GC14.7[0.000129]	1.6(1.26-2.04)
GC	517(45.6%)	510(50.7%)
CC	205(18.1%)	122(12.1%)

실시예 2: LT-α의 인트론1 내의 SNP에 의해 가져오는 전사활성의 증가

1. 실험방법

LT-α의 -307부터 268까지, IKBL의 -635부터 15까지 및 BAT1의 -1231부터 30까지에 대응하는 DNA 단편을 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 증폭하고, pGL3-basic vector(Promega)에 5'-3' 방향으로 클로닝하였다. Jurkat 세포(RIKEN Cell Bank로부터 입수; RCB0806)는 10% 소 태아 혈청을 첨가한 PRMI1640 배지 내에서 성장시켰다. LT-α 유전자에서의 두 개의 SNPs, 엑손1 내의 10G>A 및 인트론1 내의 252A>G가 그 발현레벨에 영향을 미치는가의 여부를 결정하기 위해 양방의 SNPs(각각 10G-252A, 10A-252G 및 10A-252A 일배체형)를 포함한 게놈 단편을 루시퍼라제 유전자 전사유닛의 상류에 포함하는 3종류의 플라스미드를 구축하였다.

상기 Jurkat 세포(2×10⁶)에 10㎍의 상기 플라스미드 구축물과 2.5㎍의 pRL-TK 벡터(형질전이(transfection) 효율을 위한 내부제어)를 LipoTAXI 형질전이 시약(Stratagene사 제품)을 사용하여 형질전이하였다. 6시간 후, 세포를 PMA(20ng/ml) 및 이소노미신(1μM)(Sigma사 제품)으로 자극하였다. 24시간 후, 세포를 모아, 루시퍼라제 활성을 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega사 제품)을 이용하여 측정하였다. 또한, IKBL 및 BAT1 유전자의 프로모터 영역에서의 SNPs의 전사효율에 미치는 영향을 동일하게 하여 조사하였다.

2. 실험결과

도 2A에 나타낸 바와 같이, 10A-252G 일배체형을 포함하는 클론은 다른 2 개의 일배체형을 포함하는 클론보다도 1.5배의 전사활성을 보이고, 엑손에서의 하나의 치환이 아닌, 인트론1에서의 치환이 LT-α 유전자의 전사에 영향을 미치는 것을 보였다. 즉, 심근경색에 강한 관련성을 보이는 LT-α 유전자에서 이들 두개의 SNPs는 그 발현레벨에 영향을 미친다는 것을 알게 되었다.

한편, 동일하게 심근경색과 현저한 관련성을 보이는 IKBL(-63T>A)의 프로모터 영역에서 SNP는 전사활성의 적당한 감소가 확인되었다(도 2B). IKBL은 IkB 단백질군에 속하며, NF kappaB(NF-κB)/rel potein와 같은 전사인자에 대한 저해분자이다(참조: Albertella, M.R., et al., Hum. Mol. Genet., 3, 793-799, 1994). LT-α 프로모터 영역에서의 DNA 서열은 NF-κB, SP-1 및 AP-1/c-fos/jun을 포함하는 수 종의 핵인자에 대한 결합 모티프를 포함한다는 사실로부터 판단하면(참조: Messer, G. et al., J. Exp. Med., 173, 209-219, 1991), IKBL은 이들 핵인자의 저해를 통해 LT-α의 전사를 제어한다고 사료되었다.

실시예 3: LT-α의 인트론1에 대한 미지의 핵인자의 결합

1. 실험방법

Jurkat 세포로부터의 핵추출물이 252A 또는 252G 대립유전자를 포함하는 게놈서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있는지를 조사하였다. [Andrew, N.C. et al., Nucleic, Acid Res., 11, 2499, 1991]에 기술된 바와 같이, Jurkat 세포로부터 조제한 핵추출물을 디옥시게닌(DIG)-11-ddUTP으로 표지한 33bp의 올리고뉴클레오티드와 DIG-gel shift kit(Roche사 제품)을 이용하여 배양하였다. 경합연구를 위해, 미표지의 올리고뉴클레오티드(100배 과잉)를 DIG-표지 올리고뉴클레오티드의 첨가전에 핵추출물과 전배양하였다. 단백질/DNA 복합체를 0.5×Tris/붕산/EDTA(TBE)완충액 중, 미변성 7% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다. 겔을 니트로셀룰로즈 막으로 옮기고, 신호의 검출을 화학발광 검출 시스템(Roche사 제품)을 이용하여 제조자의 지시대로 수행하였다.

2. 실험결과

도 3에 도시한 바와 같이, G 대립유전자에 대응하는 올리고뉴클레오티드를 이용하였을 때 나타나는 밴드는 A 대립유전자에 대응하는 밴드보다도 강하고, 이것은 Jurkat 세포에 존재하는 몇 개의 핵인자가 A 대립유전자에 대응하는 것 보다도 G 대립유전자에 대하여 보다 강하게 결합하였음을 보여준다. 실험은 3회 수행하였으며, 동일한 결과를 얻었다. 이 결과는 이 영역에 결합함으로써 LT-α의 전사를 억제하는 하나 또는 그 이상의 핵 추출물의 미동정 분자가 심근경색에 관련하고 있을지 모름을 보여준다.

실시예 4: LT-α 단백질 내의 T26N 변이에 의한 접착분자의 유도

1. 실험방법

LT-α 산물은 그 염증 기작에 기여하는 것과 같이, 혈관내피세포, 혈관평활근세포 및 각종의 백혈구로부터 접착분자 및 사이토카인을 유도할 수 있다(참조: Ross, R., N. Engl. J. Med., 340, 115-126, 1999; Ware, C.F., et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 198, 175-218, 1995). 이들의 생물학적 활성이 유전자 산물에서의 아미노산 치환에 따라 영향을 받을지를 조사하였다. 코돈 26에서의 SNP는 트레오닌에서 아스파라긴의 아미노산 변화를 가져온다. 따라서, 각 대립유전자(26N-LT-α또는 26T-LT-α)에 대하여 접착분자 및 사이토카인의 발현을 유도하는 능력을 배양한 사람 관상동맥 혈관내피세포(HCAEC) 및 사람 관상동맥 평활근세포(HCASMC)를 이용하여 다음과 같이 조사하였다.

우선, 정제한 대장균 유래 재조합체 26N-LT-α 및 26T-LT-α를 pET43 system(Novagen사 제품)을 이용하여 제조하였다. HCAEC 및 HCASMC(BioWhittaker사 제품)를 5ng/ml의 LT-α 단백질(26N-LT-α 또는 26T-LT-α)로 4시간 처리하였다. total RNA를 트리졸(Life Technologies사 제품)을 이용하여 단리하였다. cDNA를 2㎍의 total RNA로부터 dT15 priming에 따라 제조하고, SuperScript 역전사효소(Life Technologies사 제품)를 이용하여 합성하였다. mRNA를 QuantiTect SYBR Green PCR kit(QIAGEN사 제품) 및 ABI Prism 7700 sequence detector(Applied Biosystems사 제품)를 사용하여 정량하였다. 각 시험은 3회 반복하고, 각 시료는 3중으로 시험하였다.

2. 실험결과

변이 단백질인 26N-LT-α는 26T-LT-α보다도 HCASMC의 혈관세포 접착분자-1(VCAM-1) 및 E-셀렉틴 mRNA에 대해 2배 높은 전사활성 수준을 보였다(도 4).

실시예 5: LT-α 단백질의 동맥벽 융기성 병변부에서의 발현상태

1. 실험방법

동맥벽 융기성 병변부위의 파라핀 절편을 실란코팅 슬라이드 상에 붙이고, 크실렌을 이용하여 탈 파라핀 조작을 수행하였다. 그 후, 마이크로웨이브에 의해 항원성을 다시 살리고, 내인성 페록시다제 활성을 저해하기 위해 3% 과산화수소수/에탄올로 15분 처리하고 비특이적 반응을 억제하기 위해 5% 스킴밀크액으로 블로킹 반응을 수행하였다. 5㎍/ml의 항 LT-α 항체(R&D사 제품)를 이용하여, 40℃, 하룻밤 반응하고 세정 후, 2차항체(rabbit ENVISION Polymer Reagent; DAKO사 제품)를 가하여 실온에서 1시간 반응하였다. 페록시다제 기질을 이용하여 발색 후, 현미경 하에서 LT-α 단백질의 신호를 관찰하였다. 음성 대조군으로, 비면역 정상 양 IgG(DAKO사 제품)를 이용하여 동일하게 염색하였다.

2. 실험결과

상기의 면역염색의 결과, 심근경색 환자유래 동맥벽 융기성 병변부내 혈관 평활근 세포 및 매크로파지에서 LT-α 단백질이 강하게 염색됨이 확인되었다. 이 결과에 의해 LT-α 단백질이 병변의 발생, 촉진에 관련하고 있을 가능성이 시사되었다.

실시예 6: LT-α 변이체(Asn26)에 의한 혈관내피세포, 혈구계 세포주로부터의 사이토카인, 접착분자의 유도

1. 실험방법

관상동맥 혈관내피세포(Bio Whittaker사 제품)는 혈관내피세포 전용배지(Bio Whittaker사 제품), HL-60(RIKEN Cell Bank)은 RPMI-1640 배지(Sigma사 제품)에서 배양하였다. LT-α 단백질의 제작, 사이토카인, 접착분자 mRNA 유도의 평가는 기존의 정보(참조: Ozaki k. et al., Nature Genetics, 32, 650-654, 2002)를 따라 수행하였다.

2. 실험결과

사람 관상동맥 혈관내피세포(HCAEC) 및 혈구계 세포주(HL-60)에서의 LT-α(26Asn)의 사이토카인, 접착분자 유도활성에 대하여, LT-α(26Thr)의 경우와 비교하고, 결과를 도 5 및 도 6에 도시하였다. 도 5 및 도 6에 도시한 대로, LT-α(Asn26)는 LT-α(Thr26)에 비하여 혈관내피세포로부터 Tumor necrosis factor-α(TNF-α), E-셀렉틴 mRNA를 2배 높게, HL-60 세포로부터는 TNF, ICAM-1(intracellular cell adhesion molecule-1) mRNA를 3배 높게 유도하였다. 이들의 결과로부터, LT-α(26Asn)가 심근경색 등의 염증성 질환의 발증, 진전에 관여하고 있음을 알게 되었다.

본 발명의 방법에 의하면, 심근경색을 시작으로 하는 염증성 질환의 발증 유무, 질환 발증 가능성을 정확하면서 신속하게 판단할 수 있다.

서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims

림포톡신-α(LT-α) 유전자, I Kappa B-like(IKBL) 유전자 및 BAT1 유전자로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자에 존재하는 한 종류 이상의 유전자 다형을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법.
림포톡신-α(LT-α) 유전자, I Kappa B-like(IKBL) 유전자 및 BAT1 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자에 존재하는 한 종류 이상의 단일염기다형(SNP: single nucleotide polymorphism)을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법.
하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법:

(1) 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기에서의 G/A 다형;

(2) 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기에서의 A/G 다형;

(3) 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 염기에서의 C/A 다형;

(4) 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 염기에서의 T/A 다형; 및,

(5) 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 염기에서의 G/C 다형.
서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기와 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 염기의 조합이 G-A 헤테로 접합체인지, A-G 헤테로 접합체인지, A-A 호모 접합체인지를 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법.
서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 80번째 내지 82번째의 염기 중에서 적어도 하나의 염기가 다른 염기로 치환됨에 따라 암호화된 아미노산이 트레오닌에서 아스파라긴으로 변이하는 유전자 다형을 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 판정방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 염증성 질환은 심근경색인 것을 특징으로 하는

염증성 질환의 판정방법.
서열번호 1 내지 5로 표시되는 서열에 있어서, 하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 부위를 포함하면서 연속하는 적어도 10염기의 서열 또는 그 상보서열에 혼성화할 수 있는, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 방법에서 탐침(probe)으로 이용하는 올리고뉴클레오티드:

(1) 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 부위;

(2) 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 부위;

(3) 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 부위;

(4) 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 부위; 및,

(5) 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 부위.
서열번호 1 내지 5로 표시되는 서열에 있어서, 하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 부위를 포함하면서 연속하는 적어도 10염기의 서열 또는 그 상보서열을 증폭시킬 수 있는, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 방법에서 프라이머로 이용하는 올리고뉴클레오티드:

(1) 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 부위;

(2) 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째 부위;

(3) 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 부위;

(4) 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 부위; 및,

(5) 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 부위.
제 8항에 있어서,

상기 프라이머는 정방향 프라이머(forward primer) 및/또는 역방향 프 라이머(reverse primer)인 것을 특징으로 하는

올리고뉴클레오티드.
제 7항 내지 제 9항의 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 중, 한 종류 이상을 포함하는 염증성 질환 진단용 키트.
제 10항에 있어서,

상기 염증성 질환은 심근경색인 것을 특징으로 하는

염증성 질환 진단용 키트.
하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 검출하는 단계를 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 발현상태의 분석방법:

(1) 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기에서의 G/A 다형;

(2) 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기에서의 A/G 다형;

(3) 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 염기에서의 C/A 다형;

(4) 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 염기에서의 T/A 다형; 및,

(5) 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 염기에서의 G/C 다형.
하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편을 세포에 도입하고, 전기 세포를 배양하여 전기 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성 측정방법:

(1) 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기에서의 G/A 다형;

(2) 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기에서의 A/G 다형;

(3) 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 염기에서의 C/A 다형;

(4) 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 염기에서의 T/A 다형; 및,

(5) 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 염기에서의 G/C 다형.
하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편을 세포에 도입하고, LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성을 저해하는 후보물질의 존재하에서 전기 세포를 배양하여, 전기 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성 저해물질의 스크리닝 방법:

(1) 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기에서의 G/A 다형;

(2) 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기에서의 A/G 다형;

(3) 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 염기에서의 C/A 다형;

(4) 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 염기에서의 T/A 다형; 및,

(5) 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 염기에서의 G/C 다형.
제 14항에 기재된 스크리닝 방법에 의하여 수득되는 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사활성 저해물질.
제 13항 또는 제 14항에 있어서,

상기 LT-α, IKBL 또는 BAT1 유전자 단편의 하류에 리포터 유전자를 결합시킨 전사유닛을 세포에 도입하고, 전기 세포를 배양하여 리포터 활성을 측정함으로써, 전기 유전자의 발현을 분석하는 것을 특징으로 하는

방법.
제 16항에 있어서,

상기 리포터 유전자는 루시퍼라제(luciferase) 유전자인 것을 특징으 로 하는

방법.
하기의 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 한 종류의 단일염기다형을 포함하는 유전자 단편과 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사억제 인자의 존재가 예상되는 시료를 접촉시켜, 전기 단편과 전사억제 인자의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 LT-α, IKBL 또는 BAT1의 전사억제 인자의 스크리닝 방법:

(1) 서열번호 1로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손1 염기서열의 10번째 염기에서의 G/A 다형;

(2) 서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기에서의 A/G 다형;

(3) 서열번호 3으로 표시되는 LT-α 유전자의 엑손3 염기서열의 81번째 염기에서의 C/A 다형;

(4) 서열번호 4로 표시되는 IKBL 유전자의 프로모터 염기서열의 572번째 염기에서의 T/A 다형; 및,

(5) 서열번호 5로 표시되는 BAT1 유전자의 프로모터 염기서열의 1,228번째 염기에서의 G/C 다형.
제 18항에 있어서,

상기 검출은 젤 시프트 분석법(gel shift assay)에 의해 수행되는 것 을 특징으로 하는

스크리닝 방법.
서열번호 2로 표시되는 LT-α 유전자의 인트론1 염기서열의 90번째의 염기에서의 C/A 다형을 포함하는 유전자 단편을 접착분자 유도성 세포에 도입하여, 전기 세포의 접착분자의 유도화능을 평가하는 방법.
제 20항에 있어서,

상기 세포는 사람 관상동맥 평활근세포(HCASMC)인 것을 특징으로 하 는

접착분자의 유도화능을 평가하는 방법.
제 20항에 있어서,

상기 접착분자는 혈관세포 접착분자-1(VCAM-1) 또는 E-셀렉틴(E- selectin)인 것을 특징으로 하는

평가방법.
림포톡신-α(LT-α)의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료방법.
제 23항에 있어서,

상기 염증성 질환은 심근경색인 것을 특징으로 하는

치료방법.
제 23항 또는 제 24항에 있어서,

림포톡신-α(LT-α)에 대한 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는

치료방법.
림포톡신-α(LT-α)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료방법.
제 26항에 있어서,

상기 림포톡신-α(LT-α)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 림포톡 신-α(LT-α)에 대한 항체인 것을 특징으로 하는

치료방법.
세포와 후보물질을 접촉시키는 단계;

세포 내에서의 림포톡신-α(LT-α)를 암호화하는 유전자의 발현량을 분석하는 단계; 및,

후보물질의 비존재하에서의 조건과 비교하여 전기 유전자의 발현량을 저하시키는 후보물질을 염증성 질환 치료제로 선택하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료제의 스크리닝 방법.
림포톡신-α(LT-α)와 후보물질을 접촉시키는 단계;

림포톡신-α(LT-α)의 활성을 측정하는 단계; 및,

후보물질의 비존재하에서의 조건과 비교하여 림포톡신-α(LT-α)의 활성을 저하시키는 후보물질을 염증성 질환 치료제로 선택하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료제의 스크리닝 방법.
제 29항에 있어서,

상기 림포톡신-α(LT-α)의 활성은 접착분자 및/또는 사이토카인을 유 도하는 활성임을 특징으로 하는

스크리닝 방법.
제 30항에 있어서,

상기 접착분자는 VCAM-1, ICAM-1 또는 E-셀렉틴이며, 사이토카인은 TNF임을 특징으로 하는

스크리닝 방법.
제 28항 또는 제 29항에 있어서,

림포톡신-α(LT-α)의 발현량 또는 활성의 저하는 IKBL 유전자의 발현 량 또는 활성의 증가를 가져오는 것을 특징으로 하는

스크리닝 방법.