CN104450728A - Or2w3基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离的编码OR2W3突变体的核酸，分离的多肽，筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法，筛选易感视网膜色素疾病的生物样品的系统，用于筛选易感视网膜色素变性疾病样品的试剂盒以及筛选治疗或预防视网膜色素疾病的药物的方法。其中，该分离的编码OR2W3突变体的核酸，与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感视网膜色素变性疾病。

Description

OR2W3基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及OR2W3基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码OR2W3突变体的核酸，分离的多肽，筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法，筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的系统，用于筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的方法。

背景技术

视网膜色素变性(RP，MIM#268000)，是一种异质性的遗传性眼部疾病，根据我国的调查资料，该病的人群患病率达到1/3000-1/5000。这种疾病在临床上是一种进行性视力减退、夜盲、视野缩小及眼底视网膜色素沉着的遗传性眼病，最终可能引起严重的视力衰弱甚至失明。这种疾病具有很高的临床和遗传异质性，可被常染色体显性遗传(大约30-40％的病例)，常染色体隐性遗传(大约50-60％的病例)，X染色体遗传(大约5-15％的病例)。现在，59个基因位点已经被证实和RP相关，其中30个基因和常染色体隐性遗传RP相关，24个基因和常染色体显性遗传RP相关，5个基因和伴X染色体遗传RP相关。虽然在每种遗传方式中均发现了一些致病基因，但是大量的临床案例仍然不能被这些基因解释，说明仍然存在着相当一部分未知致病的基因位点，预计在人类中可能仍然存在70多个基因位点与RP有关。因此，目前对于视网膜色素变性疾病的研究仍有待深入。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够有效筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法。

本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过全外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了视网膜色素变性疾病的新的致病基因突变(OR2W3 c.424C＞T p.R142W)。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码OR2W3突变体的核酸。根据本发明的实施例，该核酸与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变。根据本发明的实施例，发明人确定了OR2W3的新突变体，而该新突变体与视网膜色素变性疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感视网膜色素变性疾病。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的编码OR2W3突变体多肽。所述的多肽是由与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变的核苷酸翻译而成。根据本发明的实施例，该多肽与SEQ ID NO.2相比，具有p.R142W突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感视网膜色素变性疾病。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下几个步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变是所述生物样品易感视网膜色素变性的指示。通过根据本发明实施例的筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法，可以有效地筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所 述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO.1相比，是否具有c.C424T突变，判断所述生物样品是否易感视网膜色素变性疾病。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品。

根据本发明的第五个方面，本发明提出了一种用于筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测OR2W3基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO.1相比，所述OR2W3基因突变体具有c.C424T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品。

根据本发明的第六个方面，本发明提供了一种筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将能够表达OR2W3基因突变体的生物样品在存在候选试剂的情况下进行培养，其中所述OR2W3基因突变体与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变；将所述能够表达OR2W3基因突变体的生物样品在不存在所述候选试剂下培养；确定所述能够表达OR2W3基因突变体的生物样品在存在所述候选试剂和不存在所述候选试剂下培养时的细胞凋亡率，是所述候选试剂作为治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物指示。利用该筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的方法，能够有效地筛选治疗或预防视网膜色素变性的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了发明人在重庆市收集的1个四代视网膜色素变性疾病家系的谱系图，其中：□代表正常男性，○代表正常女性，■代表男性RP患者，●代表女性RP患者，带斜线的□代表已故男性，带斜线的○代表已故女性；

图2为利用眼底照相术针对RP患者和正常成员的眼底像进行检测，图2A为RP患者的眼底像，图2B为正常成员的眼底像；

图3为OR2W3 R142W突变的Sanger测序结果，control显示了正常成员的OR2W3的Sanger测序结果，case显示了RP患者的OR2W3的Sanger测序结果；

图4显示了发明人在重庆市收集到的另1个三代RP家系的系谱图，其中□代表正常男性，○代表正常女性，■代表男性RP患者，●代表女性RP患者；

图5显示了9个灵长类物种的OR2W3序列比对的结果，其中由上到下依次为：人、黑猩猩、大猩猩、猩猩、长臂猿、恒河猴、猕猴、狒狒、绿长尾猴、婴猴；

图6为HESC-RPE细胞鉴定结果，分别利用Mitf，Pax6和ZO-1这3种RPE细胞标记物标记人胚胎干细胞，验证诱导产生的细胞是否为视网膜色素上皮细胞；

图7为运用逆转录PCR实验验证HESC-RPE细胞可以表达OR2W3基因的电泳图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

OR2W3基因突变体 

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码OR2W3基因突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO.1相比，该核酸具有c.C424T突变。在本文所使用的表达方式″编码OR2W3突变体的核酸″，是指与编码OR2W3突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受限制，可以是任何包含与OR2W3突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的实施例，发明人确定了OR2W3基因的新突变体，这些突变体与视网膜色素变性疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感视网膜色素变性疾病，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感视网膜色素变性疾病。

该编码OR2W3突变体的核酸，是发明人通过全外显子组测序联合突变验证的方法确定的视网膜色素变性疾病的致病基因上的新突变。虽然有关于视网膜色素变性疾病的基因的报道，但本发明人首次证实了OR2W3基因与视网膜色素变性疾病有关，且本次发现的突变位点是新的，在现有技术中并未被提到。野生型的OR2W3基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，共含有945个碱基。OR2W3基因位于1q44，有一个内含子免费阅读框，其编码嗅觉感受器蛋白，该蛋白含有314个氨基酸，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

发明人发现的新突变体与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变，即相对野生型OR2W3基因，本发明的OR2W3基因突变体的cDNA中第424位的C突变为T，由此所编码的产物与蛋白(SEQ ID NO.2)相比，具有p.R142W突变，即142位的R(精氨酸)突变为W(色氨酸)。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种分离的多肽。根据本发明 的实施例，与SEQ ID NO.2相比，该分离的多肽具有p.R142W突变。根据本发明一些具体示例，该多肽是由前所述的分离的编码OR2W3突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感视网膜色素变性疾病，也可以通过检测这些多肽在生物体中的存在，可以有效地预测生物体是否易感视网膜色素变性疾病。

筛选视网膜色素变性疾病的生物样品的方法

根据本发明的第三个方面，本发明提出了一种筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法可以包括以下步骤：

首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品OR2W3是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语″核酸样本″应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中OR2W3是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含OR2W3编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的效率。另外根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本构成的核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选 易感视网膜色素变性疾病的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序的方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因此能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及所得到的核酸序列文库进行测序，以便获得多个测序数据构成的数据结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730和单分子测序测序装置中的至少一种对所得到的核酸序列进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，该筛选可以在构建测序文库之前，构建测序文库的过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用OR2W3特异性引物，对核酸样本进行扩增，进一步提高筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的效率。根据本发明的实施例，OR2W3的特异性引物不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些OR2W3的特异性引物具有SEQ ID NO.3和4所示的核苷酸序列：

TCCTGTTCCTGGGTCTGG(SEQ ID NO.3)

TGGGAGTCGTGGGCTAAT(SEQ ID N O.4)

发明人惊奇的发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中通过显著有效地完成对OR2W3基因的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO.3和4所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当的选择，关于流程的细节，可以参照测序仪器厂商例如ABI公司所提供的规程，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的的术语″核酸序列″应作广义的理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核苷酸样本进行测序所得到的测序数据作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应OR2W3的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO.1的序列比对。如果在所获得的核酸序列中具有c.C424T突变，则指示生物样品易感视网膜色素变性疾病。由此，通过根据本发明实施例的筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法，可以有效的筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO.1进行比对的方法和设备并不受特别的限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAPaligner(soap2.21)软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的″筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法″的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的的系统和试剂盒。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法的系统。

根据本发明的实施例，该筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的系统包括核酸提取装置、核酸序列确定装置以及判断装置。

根据本发明的实施例，核酸提取装置用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸的样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元和反转录单元，其中RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA样本，反转录单元与RNA提取单元相连，用于对RNA样品进行反转录，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置与核酸提取装置相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸的序列。由此根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置可以进一步包括：文库构建单元以及测序单元。文库构建单元用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元与文库构建单元相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增进一步提高筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的效率。由此，文库构建单元可以进一步包括PCR扩增模块，在PCR扩增模块设置扩增OR2W3特异性引物，以便利用OR2W3特异性引物对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，OR2W3特异性引物如SEQ ID NO.3和4所示。根据本发明的实施例，测序单元可以包括选自HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点， 进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确度和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置与核酸序列确定装置相连，适于核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO.1的区别判断生物样品是否易感视网膜色素变性疾病。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO.1相比，是否具有c.C424T突变，是生物样品易感视网膜色素变性疾病的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO.1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAPaligner(soap2.21)软件进行比对。

由此，利用该系统能有效地实施前述筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品。

根据本发明的第五个方面，本发明提供了一种用于筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，改用于筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的试剂盒：包括适于检测OR2W3基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO.1相比，该OR2W3基因突变体具有c.C424T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品。在本文中，所使用的术语″适于检测OR2W3基因突变体的试剂″应做广义理解，既可以是检测OR2W3编码基因的试剂，也可以是检测OR2W3突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针，由此，可以高效地筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的方法

根据本发明的第六个方面，本发明首先提出了一种筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的方法。根据本发明的实施例，该筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的方法可以包括以下步骤：

首先，将能够表达OR2W3基因突变体的生物样品在存在候选试剂的情况下进行培养，其中OR2W3基因突变体与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变。这里所使用的术语″培养″应做广义理解，是指生物样品以有活性的状态存在。根据本发明的实施例，生物样品的类型不受特别的限制，只要该生物样品能够表达这一种OR2W3突变体即可，该突变体与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变。根据本发明的一些具体示例，生物样品可以为选自细菌、酵母、人体视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞中的至少一种。

其次，将上述生物样品在不存在该候选试剂的情况下进行培养。

接着，确定上述生物样品在存在该候选试剂和不存在该候选试剂的情况下，细胞凋亡率的变化，其中存在所述候选试剂时，所述细胞凋亡率低于不存在所述候选试剂时的细胞凋亡率，是所述候选试剂作为治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的指示。

利用本发明的筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的方法，能够有效地筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟悉的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明 的内容相同。

发明人在重庆市收集到1个四代视网膜色素变性疾病的家系，如图1所示，该家系成员共46人，其中患者7人(包括两个已经去世的I-1和II-5成员在内)，正常人员39人。其中家系中第二代9名成员中有6名成员患有视网膜色素变性疾病。参与本发明研究的共17人，其中，患者5人，正常成员12人，所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。

所有参与本发明研究的参与者都经历了全面的眼科检查，包括裂隙灯活组织显微镜检、基底检查、视野测试、全磁场闪光视网膜电描记术(ERG)；血液衍生DNA分别从5名患者(II-1、II-2、II-3、II-4、II-7)和12名正常成员(II-8、II-9、III-1、III-2、III-3、III-15、III-16、IV-1、IV-2、IV-4、IV-5、IV-6)中获得。这项研究是经过第三军医大学道德伦理委员会认可的。外周小静脉血样的采集是在参与者签署了志愿者通知书后才进行的。

该家系的7名患者中，2名已故成员(I-1和II-5)和另外的5名患病成员(II-1、II-2、II-3、II-4、II-7)均表现出相似的临床症状和发病机制。患者在20岁左右出现夜盲症，之后视力逐渐下降，最终在后半生完全失明。

表1为5名RP患者的个人临床资料。这5名患者均表现出双侧视力逐渐下降、周边视力下降和畏光等临床症状。并且具有眼底视盘颜色苍白、视网膜血管衰减等现象，ERG记录显示也没有在RP患者身上探测到锥或者杆反应。

图2显示的眼底检查结果也有同样的临床症状。图2A显示了RP患者的眼底像，可以看到，与正常成员的眼底像图2B相比，RP患者表现出视网膜血管衰减、骨针色素沉着、视网膜脉络膜变性与视乳头周围萎缩、视盘苍白、视杯扩大等明显的临床症状。

该家系中视网膜色素变性的表型垂直传递，患者的双亲中有1名患病，符合常染色体显性遗传特征。

表1.四代RP家系中5个患病成员的个人特征

实施例1已知位点的突变筛查

发明人为了寻找致病突变基因并排除已知的基因，对家系中的患病成员进行了突变筛查。分别在RP患者(II-1)和健康对照(II-8)之中，采集外周小静脉血液，利用TIANamp血液DNA提取试剂盒从外周粒细胞中提取DNA，对所有先前已知的致RP的基因的外显子和侧翼内含子的剪接位点进行测序，再利用Sanger测序技术进一步证实。之前的研究结果已经表明与RP有关的基因有：RP1、RPGR、RP2、RHO、PRPH2、ROM1/PRPH2、RP9、IMPDH1、PRPF31、CRB1、PRPF8、TULP1、CA4、PRPF3、ABCA4、RPE65、EYS、CERKL、NRL、FAM161A、FSCN2、TOPORS、SNRNP200、SEMA4A、PRCD、NR2E3、MERTK、USH2A、PDE6B、PROM1、KLHL7、PDE6A、RGR、CNGB1、IDH3B、SAG、GUCA1B、CNGA1、BEST1、TTC8、RDH12、C2orf71、ARL6、IMPG2、PDE6G、ZNF513、DHDDS、PRPF6、CLRN1、MAK、CDHR1、RBP3、RPGR、CC2D2A、FLVCR1、TTPA、OFD1、RLBP1、 FLVCR1、CYP4V2、SPATA7、AIPL1、LRAT、TULP1和BEST1共65个基因。为了验证这个家族的RP患者是否由未知基因引起，首先在以健康患者(II-8)为对照，屏蔽RP患者(II-1)中上述已知的基因，运用靶基因捕获，通道由BGI显影，然后利用Sanger测序技术仿制阳性结果。根据外显子测序和Sanger测序的实验结果显示所有的已知的基因均没有表现出致病突变，该研究结果指示这个家庭的疾病可能是由未知的基因突变引起的。外显子测序工作在深圳华大基因研究院完成。

实施例2利用全外显子组测序鉴别致病相关基因

选取家系中的5名成员，包括4名RP患者(II-2，II-3，II-4，II-7)和1名正常成员(II-9)。分别从每名参与者的外周小静脉血液中提取30μg人基因组DNA，检测合格后，用于后续实验。按照Covaris Acoustic系统的操作指南，将基因组DNA打断成随机片段，随后利用适配器连接片段，制备杂交文库。将人基因组DNA进行ligation-mediated PCR(LM-PCR)扩增、纯化，和Nimblegen SeqCap EZ实验室v3.0(Roche/NimbleGen，Madison，WI)杂交强化，LM-PCR捕获和未捕获的产物利用Q-PCR评估强化程度。每个被捕获的程序库在Hiseq2500平板(Illumina，San Diego，CA)负载，完成了每一个捕获的基因库的高通量测序以确保每一个样品满足所需要的平均测序深度(90×)。原始的图像文件用Illumina base calling Software 1.7处理以系统设定参数为依据，为每个个体生成90bp双端读取。全外显子组测序工作在深圳华大基因研究院完成。

利用生物信息学分析获得的原始数据。平均11747个MB原始数据产生一个目标区域的平均深度101.74褶。大约98.64％的定向基底(64,482,551bp长)被充分通过，作为单核苷酸多态性(SNPs)与插入/缺失(Indels)的阈值。分别针对II-2、II-3、II-4、II-7和II-9依次鉴定了144701-150367SNPs 与15368-16173Indels。

由于罕见的遗传性疾病在健康人群可能的致病突变的频率很低，发明人将获得的结果用公共变异数据库进行过滤，排除所有先前已被报道的变异。只专注于非同义的变异、剪接位点的变异、缩短、移码插入或缺失。

表2和表3表示将5名受测者的基因组中发现的单核苷酸多态性与插入/缺失通过dbSNP数据库(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg 19/database/snp 132.txt.gz.)，千人基因组数据库(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，HapMap数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知变异，最终发明人在RP患者中发现72个SNPs和15个Indels而正常对照不存在。进一步，利用2个内部数据库用来过滤剩下的变异，最终获得10个SNPs分别是：OR2W3 R142W、DNM2 R297H、ROBO2 P1106S、CSMD3 K3075Q、ZHX2 G799R、PALM3 E658Q、HAP1 E269Q、BRIP1 N775S、INTS2 I775L和TSSC4H81R。

表2.利用公共变异数据库滤过5名成员基因Indels

¹总Indels检测是定向的在100bp之内的外显子区和侧翼区完成。Indel类型包括移码突变，cds缺失，剪接位点，5-UTR，3-UTR，内含子，启动子，基因区间。

²功能Indels包括移码突变，cds缺失和剪接位点。

表3.利用公共变异数据库滤过5名成员基因SNPs

¹总SNPs检测是定向的在200bp之内的外显子区和侧翼区完成。SNP类型包括无义突变，错义突变，剪接位点，5-UTR，3-UTR，NR_外显子，同义编码，内含子，基因区间。

²功能SNPs包括无义突变，错义突变和剪接位点。

实施例3de novo SNP位点在家系内及正常人群对照组中的Sanger法测序验证

为了确定这个家庭里是否有任何剩余变异体与疾病表型共分离，发明人利用家族其他成员的DNA样本做了Sanger测序来证实这个突变。直接的PCR产物用ABI3730基因分析仪测序，得到的数据与人类基因组数据库比对(GRCh37，UCSChg19)以检测突变。可能的致病突变再进一步运用深圳华大基因研究院的RP族谱数据库进行验证，这个数据库包含了几个RP家系的全外显子组序列数据。

分别以每名参与者的外周小静脉血液为样本，利用TIANamp血液DNA提取试剂盒提取30μg人基因组DNA，检测合格后，用于后续实验。

PCR反应引物设计参考人类基因组序列

表4.鉴定10个基因的引物

PCR反应体系

体系组成	体积
		10×PCR缓冲液(含镁离子)	2.5μl
10mM dNTP	1.0μl
		10μM上游引物	1.0μl
10μM下游引物	1.0μl
		DNA模板	0.5μl
E×Taq酶(5U/μl)	0.2μl
		ddH2O	18.8μl

反应条件

上述10个保留的突变随后在另外的20个家族成员中被证实，DNA样本是可用的通过Sanger测序与疾病表型共分离。

遗传分析表明只有OR2W3(Olfactory receptor 2，W3)R142W在患者中携带而健康对照不存在。图3显示了Sanger法测序验证OR2W3(c.424C＞Tp.R142W)这种错义突变与RP之间相关性的部分代表性结果。

然后，在另一个三代RP家庭中也观察到OR2W3 R142W突变(图4)，包括3个病例(II-1、II-2、III-1)和1个对照(I-1)；3名RP患者被发现携带有相同的突变而健康对照却没有。

图4显示了发明人在重庆市收集到的另1个三代RP家系的系谱图，致RP疾病的OR2W3 R142W突变在这个三代家族中得到验证。

实施例4OR2W3 p.R142W物种保守性分析

OR2W3 R142W突变的病原性鉴定是通过氨基酸进化守恒和硅片预测研究完成的。图5显示了对这9个灵长类物种的OR2W3R142W序列进行比对的结果，结果表明，突变在9个灵长类物种(人、黑猩猩、大猩猩、猩猩、长臂猿、恒河猴、猕猴、狒狒、绿长尾猴、婴猴)具有很高的保守性并且被预言突变测试有危害影响。EVA数据检索没有发现这个变异体。

实施例5检测OR2W3 p.R142W在视神经细胞中的表达

1、利用免疫荧光技术鉴定视网膜色素上皮细胞

按照常规方法，培养HESC-H1细胞。将诱导分化后的视网膜色素上皮细胞(HESC-RPE)在加有营养液的35mm皿中培养，营养液是含有10％胎牛血清的DMEM和F12(1∶1)培养液。取生长5周的HESC-RPE细胞，加入胰蛋白酶(0.25％胰岛素/2mM EDTA)消化，37℃培养箱放置5min，研磨，37℃培养箱再放置5min，1200rcf离心5min，HBSS液重悬制成HESC-RPE单细胞悬液。细胞计数，之后离心去掉上清，用DMEM培养基重悬细胞制成浓度为5X10⁴个/μl的细胞悬液，置于冰上备用。手术前，所有实验动物腹腔注射氯胺酮(5mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)混合物进行麻醉。随后注射新福林和托品酰胺的混合物使其瞳孔扩张。向每个宿主的左眼视网膜下方注射1X10⁵个细胞(2μl悬液)，右眼作为正常对照。免疫组织化学实验的材料准备过程均为常规操作。将细胞或组织切片用0.3％Triton PBS(TX-PBS)溶液悬浮，加入5％驴血清封闭1h，加入含有一抗(含有1％NDS)的TX-PBS溶液，室温下过夜孵育。缓冲液洗涤样品后，加入免疫荧光抗体溶液(按照1∶200的比例稀释)，室温下孵育30min。待反应完毕后，进行荧光检测。

2、反向PCR

(1)参照生工生物RNA提取试剂盒说明书，分别提取培养60天、80天和100天的HESC-RPE细胞总RNA。

(2)反转录RT-PCR扩增cDNA

参照日本Takara公司RT-PCR试剂盒说明书进行。

RNA抽提物	1μg
		Oligo(dT)引物	1μg
ddH2O稀释至总体积	5μl

混匀，70℃保温5min，立即放入冰浴。

RT-PCR反应体系(25μl)

MgCl2(25mM)	2.0μl
		5×RT缓冲液	4.0μl
dNTP(25mM)	1.0μl
		RNAsin	0.5μl
逆转录酶	1.0μl
		总RNA	1.0μg
ddH2O	16.5μl

快速离心一次混匀，反应条件如下：

温度(℃)	时间(min)
		30	10
42	30
		99	5
5	5

-20℃冰箱冻存。 

取反转录反应物的0.5μl为模板，用如下的特异引物行PCR反应。上游引物序列为，TGGTGTTTATCCTGCTCTCTTAC，SEQ ID NO.23所示；下游引物序列为CTCTGTTTCTGAGGGTGTAGATG，SEQ ID NO.24所示。引物由上海生工生物股份有限公司合成，采取上述引物通过PCR反应扩增后可以获得255bp碱基的片段。

(3)PCR扩增目的基因(25μl)

PCR反应体系

体系组成	体积
		10×PCR缓冲液(含镁离子)	2.5μl
10mM dNTP	1.0μl
		10μM上游引物	1.0μl
10μM下游引物	1.0μl
		cDNA	0.5μl
E×Taq酶(5U/μl)	0.2μl
		ddH2O	18.8μl

PCR扩增条件

反应结束后取8μl PCR产物和2μl溴酚蓝混匀，进行电泳检测。

根据图6所显示的结果，通过利用Mitf，Pax6和ZO-1这3种RPE细胞标记物进行免疫组织化学实验可以证实诱导人胚胎干细胞所产生的细胞正是视网膜色素上皮细胞。根据图7所显示的结果，利用逆转录PCR实验进一步证实了HESC-RPE细胞可以表达OR2W3基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分离的编码OR2W3突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO.1相比具有c.C424T突变。

2.一种分离的编码OR2W3突变体的多肽其特征在于，与SEQ ID NO.2相比，所述分离的多肽具有p.R142W突变。

3.一种筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的系统，其特征在于，包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核苷酸序列与SEQ ID NO.1相比是否具有c.C424T突变，判断所述生物样品是否易感视网膜色素变性疾病。

4.根据权利要求3所述的筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的系统，其特征在于，所述核酸提取装置包括：RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转录，以便获得cDNA样本。

5.根据权利要求3所述的筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的系统，其特征在于，所述核苷酸确定装置包括：文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元，所述测序单元与文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。

6.根据权利要求5所述的筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的系统，其特征在于，所述文库构建单元包括：PCR扩增模块，所述PCR扩 增模块中设置有OR2W3基因的特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。

7.根据权利要求6所述的筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的系统，其特征在于，所述特异性引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

8.一种用于筛选易感视网膜色素变性疾病的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有：适于检测OR2W3基因突变体的试剂，其中所述OR2W3基因突变体与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变。

9.一种筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的方法，其特征在于，包括：将能够表达OR2W3基因突变体的生物样品在存在候选试剂的情况下进行培养，其中所述OR2W3基因突变体与SEQ ID NO.1相比，具有c.C424T突变；将所述能够表达OR2W3基因突变体的生物样品在不存在所述候选试剂的情况下进行培养；确定所述能够表达OR2W3基因突变体的生物样品在存在所述候选试剂和不存在候选试剂的情况下，细胞凋亡率的变化，其中存在所述候选试剂时，所述细胞凋亡率低于不存在所述候选试剂时的细胞凋亡率，是所述候选试剂作为治疗或预防视网膜色素变性疾病药物的指示。

10.根据权利要求9所述的筛选治疗或预防视网膜色素变性疾病的药物的方法，其特征在于，所述生物样品为选自细菌、酵母、人体视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞中的至少一种。