CN104774841B - 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症scn1a基因新突变 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疾病相关突变基因领域，特别是遗传疾病基因突变，遗传性癫痫伴热性惊厥附加症相关基因突变，更特别是遗传性癫痫伴热性惊厥附加症相关SCN1A基因突变、其检测方法及其用途。具体而言，本发明公开了具有如下突变的SCN1A基因或蛋白：c.4442T>C/p.Val1481Ala。

Description

遗传性癫痫伴热性惊厥附加症SCN1A基因新突变

技术领域

本发明涉及疾病相关突变基因领域，特别是遗传疾病基因突变，遗传性癫痫伴热性惊厥附加症相关基因突变。

背景技术

热性惊厥(Febrile Seizure，FS)是人类最常见的惊厥事件，发生于3个月至六岁间，由于急性发热(排除中枢神经系统感染或损伤)而诱发的惊厥发作。它具有明确的遗传易感性，家族性发病常见，热性惊厥患者同胞的患病率较普通人群高19.9％-24.9％。良性FS本身不属于癫痫范畴，但复杂性或频繁发作的FS日后出现癫痫发作的概率明显高于普通人群。目前普遍认为，热性惊厥相关性癫痫发作是一种与遗传密切相关的癫痫综合征。

癫痫是神经系统第二大类疾病，为最常见的慢性疾病之一，患病率为4～7‰，其中约50％的癫痫与遗传有关。到目前为止，已明确的单基因遗传性癫痫7种，可由10种单基因病变导致，其中有9种为离子通道基因；多基因遗传性癫痫3种，涉及6种基因；另外已明确的癫痫易患基因有70多种，绝大部分表达的是离子通道或离子通道调节因子。而临床上尚有更多患者的癫痫易患基因有待确定。

全面性癫痫伴热性惊厥附加症(Generalized Epilepsy with Febrile SeizuresPlus,GEFS+)，目前已更名为遗传性癫痫伴热性惊厥附加症(Genetic Epilepsy withFebrile Seizures Plus,GEFS+)是Scheffer等人于1997年在一个热性惊厥大家系研究中首先总结的一种临床表型多样并具有显著遗传异质性特点的癫痫综合征，其发作表型谱包括热性惊厥(Febrile Seizure，FS)、热性惊厥附加症(Febrile Seizure plus，FS+)、FS+伴有其他发作形式(如FS+伴有失神、肌阵挛或者失张力性等全面发作形式)和肌阵挛猝倒发作性癫痫(myoclonic-astatic epilepsy，MAE)。进一步的基础研究发现GEFS+是呈常染色体显性方式遗传的一种儿童良性发作性癫痫综合征，并具有显著遗传异质性特点。随后，通过众多的GEFS+家系的分析和报道，癫痫学者们不断完善其发作谱。现多认为，它还包括FS+伴部分性发作、FS+相关性颞叶癫痫、顽固性儿童强直阵挛性癫痫(intractable childhoodepilepsy with generalized tonic－clonic seizures，ICEGTC)、婴儿严重肌阵挛癫痫(Severe Myoclonic Epilepsy of Infancy，SMEI/Dravet Syndrome)。从自限性的热性惊厥到难治性癫痫脑病SMEI,GEFS+综合征的病例在治疗及预后方面因临床表型的差异而大相径庭。现在认为，热性惊厥相关性癫痫是一个大范畴癫痫综合征的概念。目前，FS+相关部分性发作比率占GEFS+表型中的10％左右,其中的部分性癫痫越来越引起众多学者的重视和关注,FS+伴部分性发作在国际上已有一定报道。

癫痫学者及分子生物学家试图从遗传学和分子生物学角度来解释自限性和非自限性热性惊厥及其后癫痫发作的在临床表现、治疗和预后方面的巨大差异。在近十年的研究中，学者们依次发现GEFS+的致病基因有：电压门控性钠通道β1亚基的编码基因(voltage-gated sodium(Na+)-channelβ1 subunit gene，SCN1B)；电压门控性钠通道α1亚基的编码基因(voltage-gated sodium(Na+)-channelα1 subunit gene，SCN1A)；γ-氨基丁酸A型受体γ2亚基编码基因(gamma-aminobutyric acid(GABA)A receptor subunitgamma 2，GABRG2)；电压门控性钠通道α2亚基的编码基因(voltage-gated sodium(Na+)-channelα2subunit gene，SCN2A),分别称之为GEFS+Ⅰ型、GEFS+Ⅱ型、GEFS+Ⅲ型和GEFS+Ⅳ型。临床和遗传学研究发现，GEFS+的不同临床表型可以由同一个致病基因造成,具有表型异质性,相同的表型也可以由不同的致病基因造成,具有遗传异质性。

电压门控性钠通道的分子结构是一种跨膜糖蛋白,当细胞膜去极化时,它选择性地对钠离子通透,而在静息状态下通常关闭。在中枢神经系统中对动作电位的起始和传播起着非常重要的作用，同时又是众多抗癫痫药物作用的关键靶点。钠通道通常由一个α型大亚基(260KD)和一个或多个β型小亚基(32～37KD)组成。α亚基是钠通道的功能性单位,由四个高度同源性的结构域(Ⅰ～Ⅳ)通过胞内连接环(loop)相连而成。每个结构域含有6个跨膜片段(S1～S6),其中S5和S6片段之间的连接环构成通道孔壁,其决定着通道离子选择性。S4片段富含正电荷残基,可充当通道的电压感受器(voltage sensor),当膜电位去极化时可使S4片段跨膜移动,激活通道,而当结构域上Ⅲ和Ⅳ之间的胞内连接环堵塞通道内口时,便导致通道关闭，被称为“失活闸门”。现已明确,编码α亚基的SCN1A和SCN2A基因都定位于2q24～q33,它们的基因产物均在中枢神经系统高度表达，SCN1A主要在大脑皮质和海马，SCN2A在神经元轴突处，这些部位均为癫痫发生的重要区域。SCN1A、SCN2A的突变可使钠通道失活延缓,从而在静息状态下产生持续性的钠内流,使膜电位慢性去极化,细胞兴奋性增高。不同基因位点的突变不仅产生多样的临床表型，而且影响了某些作用于该基因或某位点的抗癫痫药物的药理作用。SCN1B是最先发现在GEFS+家系中存在突变的致病基因,该基因目前与热性惊厥相关的突变共发现四个位点：C121W,I70_E74del,R85C和R85H。SCN1A是目前在热性相关性癫痫中发现突变位点最多的基因，至今国际上已报道超过900多个位点,是与热性相关性癫痫关系最密切的致病基因,而且也最不稳定,容易发生突变。目前关于SCN1A基因与热性惊厥相关性癫痫发作研究较多，从FS+、GEFS+、到SME,临床表型即从预后良好的癫痫综合征到严重癫痫性脑病，都与SCN1A基因密切相关。在GABRG2基因上，癫痫学者们陆续发现了六个位点与热性惊厥相关性儿童失神癫痫密切相关：K289M、R43Q、Q351X、IVS6+2T>G、R139G和IVS8+116C>T。在SCN2A上，目前只有三个突变位点发现于热性惊厥相关性癫痫的患者:R19K,R188W和R524Q。不同基因位点的突变不仅产生多样的临床表型，而且影响了某些作用于该基因或某位点的抗癫痫药物的药理作用。卡马西平，苯妥英钠以及拉莫三嗪都是电压依赖性钠通道特异阻滞剂。它们在钠通道开放失活状态下缓慢的结合在α2亚基的孔区内壁数个氨基酸残基上，具有频率依赖性，即对病理状态下高频放电起抑制作用。

总之，热性惊厥相关性癫痫发作多样的临床表型、显著的遗传异质性和复杂的药物反应已成为癫痫专科医师、癫痫遗传学者以及遗传药理学者们共同关注及研究的热点。探索热性惊厥相关性癫痫发作的各种临床表型与某种基因型及其药物反应性之间的关系，从而为遗传性癫痫的分子诊断奠定基础，为指导临床诊断及开展特异治疗提供理论基础。

全外显子测序技术已被证明为降低稀有单基因疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段，仅通过对几个很少的个体的全外显子进行测序来筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。

确定新的SCN1A基因的致病突变，对开展遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的分子诊断具有重要意义。

发明内容

本发明采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个中国汉族常染色体显性遗传的GEFS+家系进行了全部外显子区域的高通量测序，结合生物信息分析发现SCN1A基因上的c.4442T>C/p.Val1481Ala突变与GEFS+有关，并通过共分离实验等方法验证了这一变异，这一结果将会为GEFS+发病机制的研究奠定重要基础，也有可能为GEFS+患者治疗提供全新的理论依据，为开发有效的早期致病基因筛查和干预治疗措施提供科学依据。

因此，本发明涉及GEFS+病基因的突变，具体为：SCN1A基因上的c.4442T>C/p.Val1481Ala。

在第一方面，本发明涉及GEFS+病的生物标记物，即SCN1A的突变，所述生物标记物是具有如下的突变SCN1A基因或蛋白：c.4442T>C/p.Val1481Ala。

在一个实施方案中，本发明的突变SCN1A基因为具有以下突变的SEQ ID NO:1：c.4442T>C。

在一个实施方案中，本发明的突变SCN1A蛋白为具有以下突变的SEQ ID NO:2：p.Val1481Ala。

在一个实施方案中，本发明还涉及包含突变SCN1A基因的构建体或重组细胞，所述突变是：c.4442T>C，例如所述突变SCN1A基因为具有以下突变的SEQ ID NO:1：c.4442T>C。

在第二方面，本发明涉及一种检测GEFS+病的方法，所述方法包括检测受试者的SCN1A基因中是否存在突变位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有GEFS+病，或者其后代会患有GEFS+病或易患GEFS+病，所述突变为c.4442T>C/p.Val1481Ala。

在一个实施方案中，突变SCN1A基因的cDNA序列为SEQ ID NO:1的序列表示。

在一个实施方案中，突变SCN1A蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示。

在一个实施方案中，本发明的检测GEFS+病的方法包括如下引物扩增的步骤：

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

在一个实施方案中，本发明的检测GEFS+病的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱，基于荧光标记技术的DNA测序。

在本发明第二方面的方法中，优选检测SCN1A基因的突变c.4442T>C(即SCN1A蛋白的突变p.Val1481Ala)。

在第三方面，本发明涉及一种突变SCN1A基因的筛选系统，所述筛选系统包括检测受试者的SCN1A基因(蛋白)中是否存在SCN1A基因的突变c.4442T>C(即蛋白的突变p.Val1481Ala)。

在一个实施方案中，突变SCN1A基因为SEQ ID NO:1的序列表示。

在一个实施方案中，突变SCN1A蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示。

在一个实施方案中，本发明的突变SCN1A基因或蛋白的筛选系统包括如下引物：

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

在一个实施方案中，本发明的检测突变SCN1A基因的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱,基于荧光标记技术的DNA测序。

在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变SCN1A基因或蛋白中使用的引物对，所述突变是SCN1A基因的突变c.4442T>C(即蛋白的突变p.Val1481Ala)。

其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上前后设计，使得扩增该位置：SCN1A基因cDNA序列第4442位。

在第五方面，本发明涉及与突变SCN1A基因互补的核酸探针，所述突变是SCN1A基因的突变c.4442T>C。

所述探针与突变SCN1A基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA序列上的位置：SCN1A基因cDNA序列第4442位。

在第六方面，本发明涉及检测突变SCN1A基因的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是SCN1A基因的突变c.4442T>C(即蛋白的突变p.Val1481Ala)。

其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置：SCN1A基因cDNA序列第4442位。

在一个实施方案中，所述检测突变SCN1A基因的试剂盒包括如下引物：

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

在第七方面，本发明涉及检测突变SCN1A基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是SCN1A基因的突变c.4442T>C。

所述探针与突变SCN1A基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA序列上的区域互补：SCN1A基因cDNA序列第4442位。

本发明的SCN1A基因中的突变，可以用于GEFS+病的检测和诊断。本发明发现了GEFS+病相关基因的突变，对这些基因突变的检测可能用于GEFS+病患者的辅助诊断，并且可能有利于明确GEFS+病患者的分子诊断。因此，本发明的检测突变SCN1A基因(蛋白)的方法可以用于诊断GEFS+病或其易感性的目的，例如产前诊断、植入前遗传学诊断(PGD)、患者筛查。然而，本发明的方法并不仅限于用于诊断疾病的目的。

因此，本研究丰富了SCN1A基因的致病突变谱，对开展GEFS+的分子诊断具有重要意义。

附图说明

图1.GEFS+家系图。空白圆形：正常女性；空白方形：正常男性；四分之一阴影圆形：有FS史女性患者；四分之一阴影方形：有FS史男性患者；一半阴影方形：GEFS+男性患者；箭头所示为家族先证者。

图2.GEFS+家系内患者与正常对照测序峰图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细说明，所述的实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个中国汉族常染色体显性遗传的GEFS+家系进行了全部外显子区域的高通量测序，结合生物信息分析发现SCN1A基因上的c.4442T>C/p.Val1481Ala突变与GEFS+有关，并通过共分离实验等方法验证了这一变异。

1.样本采集

GEFS+家系包含7名成员，其中患者4名(图1)。在家系中选取2位GEFS+患者作为外显子测序样本(表1)，每个样本采集外周血样品2ml，加入EDTA抗凝，-80摄氏度保存。后又收集家系内另外2位患者和3位正常对照个体作为二次验证样本(表2)，每位采集外周血样品2ml,加入EDTA抗凝，-80摄氏度保存。

表1.GEFS+家系外显子测序样本基本情况表

编号	性别	民族	患病情况
				Ⅱ-3	女	汉	患者(FS)
Ⅲ-1	男	汉	患者(GEFS+)

表2.GEFS+家系验证样本基本情况表

编号	性别	民族	患病情况
				Ⅰ-1	男	汉	患者(FS)
Ⅰ-2	女	汉	正常
				Ⅱ-1	男	汉	正常
Ⅱ-2	女	汉	患者(FS)
				Ⅲ-2	女	汉	正常

2实验技术流程

2.1.DNA提取

采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA,所涉及试剂均由试剂盒提供，操作标准参考试剂盒说明书(http://omegabiotek.com/store/wp-content/uploads/2013/04/D3494-Blood-DNA-Midi-Kit.pdf)，具体提取步骤如下：

(1)取2ml全血样本，加入150ul OB Protease，2.1ml Buffer BL(Blood LysisBuffer)和20ul RNase A，最大速度漩涡1分钟，彻底混匀。

(2)65摄氏度水浴15-20分钟，并在水浴过程中漩涡5次。

(3)加入2.2ml无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀。

(4)将3.5ml裂解液移入带过滤柱(DNA Midi Column，试剂盒提供)的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(6)加入3ml HB Buffer，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(7)加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(8)再次加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(9)4000转离心15分钟，甩干过滤柱。

(10)将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的Elution Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

(11)再次将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的ElutionBuffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

2.2.外显子捕获与测序

我们收集到一个GEFS+家系，主要表现为首次无诱因下突发意识丧失、双目上翻、四肢抽搐，持续2-3分钟缓解。此后类似发作2-3次/月，大部分于发热>38℃时诱发，且逢发热均有发作，家族中疾病呈常染色体显性遗传。我们挑选了两名患者进行外显子组测序及数据分析，具体做法如下。

首先，发明人用Agilent SureSelect All Exon(38M)全外显子捕获平台，结合高通量测序技术，对上述这个GEFS+患者家系中的2个样本均进行了全外显子捕获测序，具体步骤如下：

(1)样品制备

取上述家系中2名患者外周血，利用上述2.1方法抽提基因组DNA，并利用分光光度计及凝胶电泳法测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg，备用。

(2)文库构建及测序

利用自适应高聚焦超声技术(Covaris)将各基因组DNA样本随机打断成150-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库(可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文)。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂Agilent SureSelect All Exon(38M)array进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的protocol进行测序，测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，样本的平均测序深度为50X。

(3)变异检测及注释

将上述测序产出数据依次进行初步统计分析、SNP检测和注释及氨基酸替换的预测，主要步骤如下：

①基本数据分析统计：

将测序产出数据进行基本数据分析统计：测得的序列reads长度分析、统计reads数量和数据的产量、reads序列与参考基因组序列的比对、统计目标区域比对到所要参考的基因组reads的覆盖度(Coverage)与测序深度(Depth)等。然后，根据以上基本数据的统计结果，得到通过外显子捕获的样本基本信息，并判断捕获的数据是否符合要求。

②SNP检测：

将各样本的高质量的原始reads通过SOAPaligner比对软件比对到参考基因组(hg19)上。然后，将比对到参考基因组上的reads用于后续的SNP标注等的分析。然后，利用SOAPsnp软件将SOAP aligner(Version:2.21)比对软件比对之后的reads结果进行一致序列组装，以得到每个位点的基因分型情况，进而进行SNP的检测。通过SOAPsnp软件组装可得到组装后的一致性序列CNS文件(*.cns)文件，其中包含位点的基因分型等详细信息的*.snp文件与按一定过滤标准(如深度、质量值等)进行过滤后所得到的具有高可信度的SNP结果*.snp.filter文件。其中，前述过滤的标准为：1)质量值≥20(Q20)；2)总测序深度4≤depth≤500；3)位点附近区域平均拷贝数约<2；4)相邻两个SNPs的距离≥5b。

对于最终所检测出的*.snp.fllter结果，进行注释分类，包括SNP类型、质量值、碱基位置、可信度等，最后得到包含SNP详细信息的*.gff文件。

③Indel检测：

将各样本的高质量的原始reads通过bwa比对软件比对到参考基因组(hg18)上。在允许存在gap的情况下比对到参考基因组上的reads用于后续的Indel的分析。然后，将Bwa(Version:0.5.9-r16)比对软件比对之后的reads结果进行过滤，之后利用GATK(Version：v1.0.4705)软件对过滤后的结果进行Indel检测。其中，过滤的标准为：1)支持数≥4；2)支持indel的reads比例≥70％定义为纯合突变，否则为杂合突变。

④Sanger测序：

Sanger测序被用于验证SCN1A基因上全外显子测序检出的突变，扩增突变所在区域的PCR引物采用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计。扩增的片段使用ABI3100(Applied Biosystems,Foster City,CA)遗传分析仪，采用ABI BigDyeTerminator cycle sequencing kit v3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行测序。

然后，针对患者检测出的变异结果进行分析，并将发现的突变在尽可能多的先证者的家庭成员中进行测序，其中的罕见突变还要在家系外正常人中进一步评估。突变采用序列变异的方式描述(HGVS:http://www.hgvs.org/mutnomen)。突变位点的保守性采用Phastcons_score(http://varianttools.sourceforge.net/Annotation/PhastCons)评估，错义突变的功能危害性预测采用SIFT(http://sift.jcvi.org/)和Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)进行分析。剪切位点变化采用BerkeleyDrosophila Genome Project(BDGP)(http://www.fruitfly.org/)进行预测。

3实验结果

全外显子组捕获测序及生物信息分析筛选分析出两名患者共有的变异中有1086个属于位于编码区或者剪切位点等位置的非同义罕见突变及86个插入/缺失。结合已知的GEFS+致病基因及dbSNP、千人、HapMap、YH1等数据库筛选出候选的致病位点。在此基础上，为了去除外显子测序的假阳性结果，通过sanger测序的方法得到变异位置的真实序列，并在更多的家系成员中进行验证，结果表明在家系成员内部疾病表型与突变位点共分离，且在100个随机正常人群中均没有检测到该致病突变，证实SCN1A基因上的c.4442T>C/p.Val1481Ala突变与GEFS+有关。

本发明对GEFS+相关的SCN1A基因上c.4442T>C(p.Val1481Ala)突变进行了验证，并通过进行现有的病例对照研究，获得结论证明。验证结果发现，其中SCN1A基因上存在c.4442T>C(p.Val1481Ala)新的潜在致病位点。以此为基础，可以发明一种GEFS+检测技术，快速检测受试者是否携带有致病基因，早期筛查GEFS+致病突变基因携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗；对有家族史等情况的患者进行夫妻双方检测，指导优生优育，在孕妇生产之前对胎儿是否罹患遗传性疾病检测；也可用于先天性白内障患者的分子诊断和鉴别。该技术具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点，检测结果可以为早期诊断、鉴别诊断及开发治疗药物提供科学依据。

实施例2

作为对实施例1的进一步验证，提供了如下的实施例。

1样本制备

采集GEFS+家系中7个样本(4名患者3名对照)的外周血，按照实施例1中2.1的方法提取基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/ul，总量不少于30μg。

2致病突变基因检测

分别对家系中表1的2个样本(均是患者)进行全外显子组测序以及对7个样本(家系内4例患者及3例对照，具体信息可见表1、表2)的SCN1A基因突变位点进行检测，针对这个已知基因检测出的新突变位点附近序列设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得这个缺失位点附近有关序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证这个已知基因的新突变与GEFS+之间相关性。具体方法步骤如下：

2.1DNA提取

取家系内7个样本的外周静脉血按照实施例1中2.1的方法提取基因组DNA，分光光度计测DNA含量。

2.2引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库GRCh36.3/hg18，采用Primer5.0分别设计得到SCN1A基因外显子特异性引物，具体见下表：

接着，于96孔反应板中，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应。

反应体系：15μl

然后，于PerkinElmer9700热循环仪上，采用Touchdown方法将配制获得各PCR反应体系按照以下反应条件分别进行PCR反应(不同的突变位点采用相同的反应条件：

反应条件：

1)预变性：94℃5分钟；

2)前12个循环：变性94℃，30秒，

退火63℃，30秒(退火温度每个循环降0.5℃)，

延伸72℃，50秒；

3)后26个循环：变性94℃，30秒，

退火57℃，30秒，

延伸72℃，50秒；

4)最后延伸：72℃，10分钟；

5)4℃保存。

由此，获得上述各受试者的PCR扩增产物。

2.3测序：

将步骤2中获得各受试者的PCR扩增产物，采用sanger测序法进行DNA测序。

基于测序结果，对家系中7个样本SCN1A进行测序，通过家系内患者与正常个体的序列结果比较，证明SCN1A基因上的c.4442T>C(p.Val1481Ala)为GEFS+的致病变异的。图2显示了患者家系内的患者以及其家系正常人对照的在SCN1A上c.4442T>C(p.Val1481Ala)突变位点的Sanger测序验证峰图，从峰图可以看出位点突变在患者中存在，且突变位点在家系内与疾病表型共分离。

实施例3

试剂盒1：检测突变SCN1A基因的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是SCN1A基因的突变c.4442T>C(即蛋白的突变p.Val1481Ala)，所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置：SCN1A基因cDNA序列第4442位，所述检测突变SCN1A基因或蛋白的试剂盒包括如下引物：

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

试剂盒2：检测突变SCN1A基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是SCN1A基因的突变c.4442T>C，所述探针与突变SCN1A基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA序列上的区域互补：SCN1A基因cDNA序列第4442位。

利用上述试剂盒1检测突变SCN1A基因或蛋白的具体步骤为：按照实施例2的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述SCN1A基因的外显子特异性引物进行PCR反应，反应体系和反应条件如实施例2所示，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后基于测序序列是否具有c.4442T>C突变，有效地检测本发明的SCN1A基因突变的生物标志物在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患遗传性癫痫伴热性惊厥附加症。

SEQ ID No.1:

ATGGAGCAAACAGTGCTTGTACCACCAGGACCTGACAGCTTCAACTTCTTCACCAGAGAATCTCTTGCGGCTATTGAAAGACGCATTGCAGAAGAAAAGGCAAAGAATCCCAAACCAGACAAAAAAGATGACGACGAAAATGGCCCAAAGCCAAATAGTGACTTGGAAGCTGGAAAGAACCTTCCATTTATTTATGGAGACATTCCTCCAGAGATGGTGTCAGAGCCCCTGGAGGACCTGGACCCCTACTATATCAATAAGAAAACTTTTATAGTATTGAATAAAGGGAAGGCCATCTTCCGGTTCAGTGCCACCTCTGCCCTGTACATTTTAACTCCCTTCAATCCTCTTAGGAAAATAGCTATTAAGATTTTGGTACATTCATTATTCAGCATGCTAATTATGTGCACTATTTTGACAAACTGTGTGTTTATGACAATGAGTAACCCTCCTGATTGGACAAAGAATGTAGAATACACCTTCACAGGAATATATACTTTTGAATCACTTATAAAAATTATTGCAAGGGGATTCTGTTTAGAAGATTTTACTTTCCTTCGGGATCCATGGAACTGGCTCGATTTCACTGTCATTACATTTGCGTACGTCACAGAGTTTGTGGACCTGGGCAATGTCTCGGCATTGAGAACATTCAGAGTTCTCCGAGCATTGAAGACGATTTCAGTCATTCCAGGCCTGAAAACCATTGTGGGAGCCCTGATCCAGTCTGTGAAGAAGCTCTCAGATGTAATGATCCTGACTGTGTTCTGTCTGAGCGTATTTGCTCTAATTGGGCTGCAGCTGTTCATGGGCAACCTGAGGAATAAATGTATACAATGGCCTCCCACCAATGCTTCCTTGGAGGAACATAGTATAGAAAAGAATATAACTGTGAATTATAATGGTACACTTATAAATGAAACTGTCTTTGAGTTTGACTGGAAGTCATATATTCAAGATTCAAGATATCATTATTTCCTGGAGGGTTTTTTAGATGCACTACTATGTGGAAATAGCTCTGATGCAGGCCAATGTCCAGAGGGATATATGTGTGTGAAAGCTGGTAGAAATCCCAATTATGGCTACACAAGCTTTGATACCTTCAGTTGGGCTTTTTTGTCCTTGTTTCGACTAATGACTCAGGACTTCTGGGAAAATCTTTATCAACTGACATTACGTGCTGCTGGGAAAACGTACATGATATTTTTTGTATTGGTCATTTTCTTGGGCTCATTCTACCTAATAAATTTGATCCTGGCTGTGGTGGCCATGGCCTACGAGGAACAGAATCAGGCCACCTTGGAAGAAGCAGAACAGAAAGAGGCCGAATTTCAGCAGATGATTGAACAGCTTAAAAAGCAACAGGAGGCAGCTCAGCAGGCAGCAACGGCAACTGCCTCAGAACATTCCAGAGAGCCCAGTGCAGCAGGCAGGCTCTCAGACAGCTCATCTGAAGCCTCTAAGTTGAGTTCCAAGAGTGCTAAGGAAAGAAGAAATCGGAGGAAGAAAAGAAAACAGAAAGAGCAGTCTGGTGGGGAAGAGAAAGATGAGGATGAATTCCAAAAATCTGAATCTGAGGACAGCATCAGGAGGAAAGGTTTTCGCTTCTCCATTGAAGGGAACCGATTGACATATGAAAAGAGGTACTCCTCCCCACACCAGTCTTTGTTGAGCATCCGTGGCTCCCTATTTTCACCAAGGCGAAATAGCAGAACAAGCCTTTTCAGCTTTAGAGGGCGAGCAAAGGATGTGGGATCTGAGAACGACTTCGCAGATGATGAGCACAGCACCTTTGAGGATAACGAGAGCCGTAGAGATTCCTTGTTTGTGCCCCGACGACACGGAGAGAGACGCAACAGCAACCTGAGTCAGACCAGTAGGTCATCCCGGATGCTGGCAGTGTTTCCAGCGAATGGGAAGATGCACAGCACTGTGGATTGCAATGGTGTGGTTTCCTTGGTTGGTGGACCTTCAGTTCCTACATCGCCTGTTGGACAGCTTCTGCCAGAGGTGATAATAGATAAGCCAGCTACTGATGACAATGGAACAACCACTGAAACTGAAATGAGAAAGAGAAGGTCAAGTTCTTTCCACGTTTCCATGGACTTTCTAGAAGATCCTTCCCAAAGGCAACGAGCAATGAGTATAGCCAGCATTCTAACAAATACAGTAGAAGAACTTGAAGAATCCAGGCAGAAATGCCCACCCTGTTGGTATAAATTTTCCAACATATTCTTAATCTGGGACTGTTCTCCATATTGGTTAAAAGTGAAACATGTTGTCAACCTGGTTGTGATGGACCCATTTGTTGACCTGGCCATCACCATCTGTATTGTCTTAAATACTCTTTTCATGGCCATGGAGCACTATCCAATGACGGACCATTTCAATAATGTGCTTACAGTAGGAAACTTGGTTTTCACTGGGATCTTTACAGCAGAAATGTTTCTGAAAATTATTGCCATGGATCCTTACTATTATTTCCAAGAAGGCTGGAATATCTTTGACGGTTTTATTGTGACGCTTAGCCTGGTAGAACTTGGACTCGCCAATGTGGAAGGATTATCTGTTCTCCGTTCATTTCGATTGCTGCGAGTTTTCAAGTTGGCAAAATCTTGGCCAACGTTAAATATGCTAATAAAGATCATCGGCAATTCCGTGGGGGCTCTGGGAAATTTAACCCTCGTCTTGGCCATCATCGTCTTCATTTTTGCCGTGGTCGGCATGCAGCTCTTTGGTAAAAGCTACAAAGATTGTGTCTGCAAGATCGCCAGTGATTGTCAACTCCCACGCTGGCACATGAATGACTTCTTCCACTCCTTCCTGATTGTGTTCCGCGTGCTGTGTGGGGAGTGGATAGAGACCATGTGGGACTGTATGGAGGTTGCTGGTCAAGCCATGTGCCTTACTGTCTTCATGATGGTCATGGTGATTGGAAACCTAGTGGTCCTGAATCTCTTTCTGGCCTTGCTTCTGAGCTCATTTAGTGCAGACAACCTTGCAGCCACTGATGATGATAATGAAATGAATAATCTCCAAATTGCTGTGGATAGGATGCACAAAGGAGTAGCTTATGTGAAAAGAAAAATATATGAATTTATTCAACAGTCCTTCATTAGGAAACAAAAGATTTTAGATGAAATTAAACCACTTGATGATCTAAACAACAAGAAAGACAGTTGTATGTCCAATCATACAGCAGAAATTGGGAAAGATCTTGACTATCTTAAAGATGTAAATGGAACTACAAGTGGTATAGGAACTGGCAGCAGTGTTGAAAAATACATTATTGATGAAAGTGATTACATGTCATTCATAAACAACCCCAGTCTTACTGTGACTGTACCAATTGCTGTAGGAGAATCTGACTTTGAAAATTTAAACACGGAAGACTTTAGTAGTGAATCGGATCTGGAAGAAAGCAAAGAGAAACTGAATGAAAGCAGTAGCTCATCAGAAGGTAGCACTGTGGACATCGGCGCACCTGTAGAAGAACAGCCCGTAGTGGAACCTGAAGAAACTCTTGAACCAGAAGCTTGTTTCACTGAAGGCTGTGTACAAAGATTCAAGTGTTGTCAAATCAATGTGGAAGAAGGCAGAGGAAAACAATGGTGGAACCTGAGAAGGACGTGTTTCCGAATAGTTGAACATAACTGGTTTGAGACCTTCATTGTTTTCATGATTCTCCTTAGTAGTGGTGCTCTGGCATTTGAAGATATATATATTGATCAGCGAAAGACGATTAAGACGATGTTGGAATATGCTGACAAGGTTTTCACTTACATTTTCATTCTGGAAATGCTTCTAAAATGGGTGGCATATGGCTATCAAACATATTTCACCAATGCCTGGTGTTGGCTGGACTTCTTAATTGTTGATGTTTCATTGGTCAGTTTAACAGCAAATGCCTTGGGTTACTCAGAACTTGGAGCCATCAAATCTCTCAGGACACTAAGAGCTCTGAGACCTCTAAGAGCCTTATCTCGATTTGAAGGGATGAGGGTGGTTGTGAATGCCCTTTTAGGAGCAATTCCATCCATCATGAATGTGCTTCTGGTTTGTCTTATATTCTGGCTAATTTTCAGCATCATGGGCGTAAATTTGTTTGCTGGCAAATTCTACCACTGTATTAACACCACAACTGGTGACAGGTTTGACATCGAAGACGTGAATAATCATACTGATTGCCTAAAACTAATAGAAAGAAATGAGACTGCTCGATGGAAAAATGTGAAAGTAAACTTTGATAATGTAGGATTTGGGTATCTCTCTTTGCTTCAAGTTGCCACATTCAAAGGATGGATGGATATAATGTATGCAGCAGTTGATTCCAGAAATGTGGAACTCCAGCCTAAGTATGAAGAAAGTCTGTACATGTATCTTTACTTTGTTATTTTCATCATCTTTGGGTCCTTCTTCACCTTGAACCTGTTTATTGGTG[T->C]ATCATAGATAATTTCAACCAGCAGAAAAAGAAGTTTGGAGGTCAAGACATCTTTATGACAGAAGAACAGAAGAAATACTATAATGCAATGAAAAAATTAGGATCGAAAAAACCGCAAAAGCCTATACCTCGACCAGGAAACAAATTTCAAGGAATGGTCTTTGACTTCGTAACCAGACAAGTTTTTGACATAAGCATCATGATTCTCATCTGTCTTAACATGGTCACAATGATGGTGGAAACAGATGACCAGAGTGAATATGTGACTACCATTTTGTCACGCATCAATCTGGTGTTCATTGTGCTATTTACTGGAGAGTGTGTACTGAAACTCATCTCTCTACGCCATTATTATTTTACCATTGGATGGAATATTTTTGATTTTGTGGTTGTCATTCTCTCCATTGTAGGTATGTTTCTTGCCGAGCTGATAGAAAAGTATTTCGTGTCCCCTACCCTGTTCCGAGTGATCCGTCTTGCTAGGATTGGCCGAATCCTACGTCTGATCAAAGGAGCAAAGGGGATCCGCACGCTGCTCTTTGCTTTGATGATGTCCCTTCCTGCGTTGTTTAACATCGGCCTCCTACTCTTCCTAGTCATGTTCATCTACGCCATCTTTGGGATGTCCAACTTTGCCTATGTTAAGAGGGAAGTTGGGATCGATGACATGTTCAACTTTGAGACCTTTGGCAACAGCATGATCTGCCTATTCCAAATTACAACCTCTGCTGGCTGGGATGGATTGCTAGCACCCATTCTCAACAGTAAGCCACCCGACTGTGACCCTAATAAAGTTAACCCTGGAAGCTCAGTTAAGGGAGACTGTGGGAACCCATCTGTTGGAATTTTCTTTTTTGTCAGTTACATCATCATATCCTTCCTGGTTGTGGTGAACATGTACATCGCGGTCATCCTGGAGAACTTCAGTGTTGCTACTGAAGAAAGTGCAGAGCCTCTGAGTGAGGATGACTTTGAGATGTTCTATGAGGTTTGGGAGAAGTTTGATCCCGATGCAACTCAGTTCATGGAATTTGAAAAATTATCTCAGTTTGCAGCTGCGCTTGAACCGCCTCTCAATCTGCCACAACCAAACAAACTCCAGCTCATTGCCATGGATTTGCCCATGGTGAGTGGTGACCGGATCCACTGTCTTGATATCTTATTTGCTTTTACAAAGCGGGTTCTAGGAGAGAGTGGAGAGATGGATGCTCTACGAATACAGATGGAAGAGCGATTCATGGCTTCCAATCCTTCCAAGGTCTCCTATCAGCCAATCACTACTACTTTAAAACGAAAACAAGAGGAAGTATCTGCTGTCATTATTCAGCGTGCTTACAGACGCCACCTTTTAAAGCGAACTGTAAAACAAGCTTCCTTTACGTACAATAAAAACAAAATCAAAGGTGGGGCTAATCTTCTTATAAAAGAAGACATGATAATTGACAGAATAAATGAAAACTCTATTACAGAAAAAACTGATCTGACCATGTCCACTGCAGCTTGTCCACCTTCCTATGACCGGGTGACAAAGCCAATTGTGGAAAAACATGAGCAAGAAGGCAAAGATGAAAAAGCCAAAGGGAAATAA

SEQ ID No.2:

Claims (6)

1. GEFS+病的生物标记物，即突变的SCN1A基因，所述生物标记物是具有如下的突变SCN1A基因： c.4442T>C；

所述突变SCN1A基因为具有以下突变的SEQ ID NO:1：c.4442T>C。

2.GEFS+病的生物标记物，即突变的SCN1A蛋白，所述生物标记物是具有如下的突变SCN1A蛋白：p.Val1481Ala。

3.权利要求2的生物标记物，所述突变SCN1A蛋白为具有以下突变的SEQ ID NO:2：p.Val1481Ala。

4.与突变SCN1A基因互补的核酸探针，所述突变是SCN1A基因的突变c.4442T>C，所述探针与突变SCN1A基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA序列上的位置：SCN1A基因cDNA序列第4442位。

5.检测突变SCN1A基因或蛋白的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是SCN1A基因的突变c.4442T>C，所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置：SCN1A基因cDNA序列第4442位；

所述检测突变SCN1A基因的试剂盒包括如下引物：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

其中，所述试剂盒包含一个或多个核酸探针，所述突变是SCN1A基因的突变c.4442T>C，所述探针与突变SCN1A基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA序列上的区域互补：SCN1A基因cDNA序列第4442位。

6.包含突变SCN1A基因的构建体或重组细胞，所述突变是：c.4442T>C，所述突变SCN1A基因为具有以下突变的SEQ ID NO:1：c.4442T>C。