CN104388553B - 肌张力障碍vps16基因的检测引物、方法和试剂盒 - Google Patents

肌张力障碍vps16基因的检测引物、方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肌张力障碍VPS16基因的检测引物，其特征在于，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物P2。本发明的上述引物，可以实现对标样DNA直接扩增得出VPS16基因进行分析判断，克服了现有TOR1A、THAP1、GCH1等突变检测的片面性，并且过程直接通过普通PCR方法即可实现，具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点；检测结果可以为肌张力障碍的早期诊断、鉴别诊断及开发肌张力障碍治疗药物提供科学辅助。

Description

肌张力障碍VPS16基因的检测引物、方法和试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物工程技术领域，具体涉及一种肌张力障碍VPS16基因的检测引物、方法和试剂盒。
背景技术
肌张力障碍是继特发性震颤、帕金森疾病的第三大常见运动障碍性疾病，其临床表现为由于主动肌和拮抗肌收缩不协调，或过度收缩引起的异常动作和姿势，具有不自主性和持续性的特点。目前针对中国肌张力障碍人群的研究中，已发现的致病基因如TOR1A、THAP1、GCH1等，但仅能解释不足5％的病例；因此通过现有致病基因的检测还不能准确地对疑似患病的患者是否患病进行准确判断。
发明内容
本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种克服现有现有TOR1A、THAP1、GCH1等突变检测的片面性的肌张力障碍VPS16基因的检测引物、方法和试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种肌张力障碍VPS16基因的检测引物，其特征在于，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物P2。
本发明的上述引物，可以实现对标样DNA直接扩增得出VPS16基因进行分析判断，克服了现有TOR1A、THAP1、GCH1等突变检测的片面性，并且过程直接通过普通PCR方法即可实现，具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点；检测结果可以为肌张力障碍的早期诊断、鉴别诊断及开发肌张力障碍治疗药物提供科学辅助。
本发明进一步还提出采用上述引物进行检测的方法，包括如下步骤：
获取待测DNA标样；
将待测DNA标样通过如具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物P2进行PCR扩增，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行测序。
本发明的另一目的还在于提出一种肌张力障碍VPS16基因的检测试剂盒，在试剂盒中包含有上述肌张力障碍VPS16基因的检测引物。
采用本发明的上述检测方法和检测的试剂盒，通过实现扩增VPS16基因然后进行测序，最终通过与正常标准基因库中的VPS16基因序列进行比对，查看第156位点的碱基是否由C突变为A；从而进行结果判断，具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例中采样的肌张力障碍遗传家系图谱；
图2为本发明肌张力障碍VPS16基因的检测方法的检测结果峰图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种肌张力障碍VPS16基因的检测方法，包括如下步骤：
S10，制备待测DNA样本；
S20，以待测DNA样本为模板，通过PCR扩增待测DNA样本的VPS16基因；
S30，将PCR扩增产物进行测序，并将测序的结果与基因库中的VPS16基因进行对比，验证第156位点的核苷酸碱基是否由C突变为A；
其中步骤S20的PCR过程中采用的引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物P2。
引物名称 序列 长度 序列号编号
上游引物P1 GAAGACAAATGGAGGCTTTAGG 22bp SEQ.ID.No.1
下游引物P2 ACTGCAGGGGAGAGAGGTTC 20bp SEQ.ID.No.2
本发明通过以一个常染色体隐性遗传的肌张力障碍家系的研究，患者III5的父母(II4和II5)为近亲结婚但表现正常，在世的四位患者均表现为早期发病，头颈不自主运动，躯体扭转，生活不能自理，经初步临床症断为原发性肌张力障碍。在家系中选取所有在世的患者作为研究样本，II4和II5作为正常样本对照，进行外显子测序。
具体测序采用利用NimbleGen SeqCap EZ Exome 64M全外显子捕获Kit结合Hiseq2000高通量测序平台，平均获得133392SNPs和10797Indels。随后通过dbSNP数据库、千人基因组数据库、HapMap数据库等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。通过比对正常样本，去掉所有已知变异，同义突变以及非编码区的变异，并利用SIFT软件进行SNP功能预测，最终得到2个可能引起致病的基因突变。
进一步运用Sanger测序的方法，对这两个基因上的侯选突变位点进一步验证，发现VPS16基因的c.156C>A纯合突变在家系中共分离，该突变导致编码的第52位氨基酸发生p.Asn52Lys错义突变。而200个正常人并不携带此纯合的基因突变，因此这个纯合的基因突变导致疾病。
最终通过自主构建了VPS16 c.156C>A杂合和纯合突变小鼠，以及VPS16杂合和纯合敲除小鼠进行对比验证。在对比缺失VPS16的小鼠肌张力及活动异常，相对于正常对照小鼠，在转轮疲劳仪运动的时间明显缩短，通过步态分析系统发现其四肢活动均有异常。因此最终确定VPS16 c.156C>A确为疾病发生关联基因。
因此在上述情形下，本发明中采用针对特异性设计的引物，扩增待测DNA样本的VPS16基因，然后对突变位点进行鉴定。
在实施过程中步骤S10中DNA样本的获取可以从采集的外周血，对外周血样本中采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA。
步骤S10完成后，将提取基因组DNA用分光光度计测DNA含量，测定浓度和纯度；进而在步骤S20中选择提取浓度和纯度较好的DNA标样进行PCR扩增，当然其中引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物P2。
最终步骤S30将步骤S20以特异性引物扩增得到的VPS16基因进行测序。当然在测序之前更加优选的步骤还可以将步骤S20的扩增产物进行纯化，纯化的方式可以采用凝胶电泳和/或millipore纯化板进行。纯化步骤可以去除RNA、盐离子等杂质，提高扩增片段纯度。虽然测序扩增产物的纯化不是实现本发明所必须，但纯化测序扩增产物可以有利于测序反应的精确度。并进一步通过测序的结果，与正常标准基因库中的VPS16基因序列进行比对，查看第156位点的碱基是否由C突变为A。
本发明中在发现VPS16 c.156C>A这一关联基因后，通过引物对标样DNA直接扩增得出VPS16基因进行分析判断，克服了现有TOR1A、THAP1、GCH1等突变检测的片面性，并且过程直接通过普通PCR方法即可实现，具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点；检测结果可以为肌张力障碍的早期诊断、鉴别诊断及开发肌张力障碍治疗药物提供科学辅助。
本发明进一步提出一种肌张力障碍VPS16基因的检测的引物、以及试剂盒。其中检测的引物当然为具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物P2。
试剂盒中除了可以具有上述引物之外，还可以包含PCR反应缓冲液如2×GCBuffer、酶液如LA Taq酶、以及标准正常VPS16基因测序峰图的阳性对照等等。
为使本发明上述引物、方法和试剂盒使用的细节更容易被技术人员理解和实施，以下通过具体实施案例进行举例说明：
实施例1
将从取家系中正常人fatherIV4、daughterV18、以及患者V5(其中家系图谱如附图1所示)的外周血样进行如下步骤：
S10，提取全基因组DNA：
S11，取2ml外周血样本、150ul OB Protease、2.1ml Buffer BL和20ul RNase A加入EP管中，然后最大速度漩涡1分钟彻底混匀后；于65摄氏度水浴15～20分钟，并在水浴过程中漩涡5次；
S12，再向EP管中加入2.2ml无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀，进行裂解，得裂解液；
S13，将3.5ml裂解液移入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；
将步骤S12剩余裂解液加入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。
S14，加入3ml HB Buffer，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；
S15，加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；
S16，再次加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；4000转离心15分钟，甩干过滤柱；
S17，将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的Elution Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液；
S18，再次将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的ElutionBuffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液；
S19，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/ul，总量不少于30μg。
然后步骤S20，将步骤S19所得到的DNA标样进行PCR，过程采用如下体系进行：当然下述PCR过程中引物采用本发明中所描述的具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物P2；
95℃预变性变性5min；
然后进行变性-退火-延伸循环：
S30，将上述扩增的产物进行测序，所得测序的峰图如图2所示。
从与标准对照的结果中可以看出，fatherIV4、daughterV18的156位点的碱基为C，而患者V5发生156C>A纯合突变。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种肌张力障碍VPS16基因的检测引物在用于制备肌张力障碍的检测试剂盒中的用途，其特征在于，包括如下步骤：
获取待测DNA标样；
将待测DNA标样通过肌张力障碍VPS16基因的检测引物进行PCR扩增，得到扩增产物，其中，肌张力障碍VPS16基因的检测引物包括序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物P1和序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物P2，其中，所述肌张力障碍VPS16基因相较于基因库VPS16基因存在c.156C>A；
将所述扩增产物进行测序。
2.如权利要求1所述的肌张力障碍VPS16基因的检测引物在用于制备肌张力障碍的检测试剂盒中的用途，其特征在于，在将所述扩增产物进行测序步骤之后还包括将测序结果与正常标准基因库中的VPS16基因序列进行比对的步骤。
3.如权利要求1或2所述的肌张力障碍VPS16基因的检测引物在用于制备肌张力障碍的检测试剂盒中的用途，其特征在于，在将所述扩增产物进行测序步骤之前还包括将所述扩增产物进行纯化的步骤。
4.如权利要求3所述的肌张力障碍VPS16基因的检测引物在用于制备肌张力障碍的检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述纯化采用凝胶电泳和/或millipore纯化板进行。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104388553B (zh) * 2014-11-03 2017-07-11 深圳市第二人民医院 肌张力障碍vps16基因的检测引物、方法和试剂盒
CN112029844B (zh) * 2020-07-30 2021-10-19 中国医学科学院病原生物学研究所 肠道微生物在诊断肌张力障碍症中的应用
CN115184501A (zh) * 2022-07-20 2022-10-14 中国医学科学院病原生物学研究所 血清代谢物组合筛查在诊断肌张力障碍症中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103725687B (zh) * 2012-10-16 2015-07-15 中南大学湘雅医院 多巴反应性肌张力障碍相关基因突变、其检测方法及其用途
CN104388553B (zh) * 2014-11-03 2017-07-11 深圳市第二人民医院 肌张力障碍vps16基因的检测引物、方法和试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Homo sapiens vacuolar protein sorting protein 16 (VPS16) mRNA, complete cds;Huizing,M.等;《GenBank: AF308801.1》;20010315;全文 *
Molecular cloning and characterization of human VPS18, VPS 11, VPS16, and VPS33;Marjan Huizing等;《Gene》;20011231;第264卷;摘要，第242页第2.2节，第244页第3.3节，图5 *
原发性肌张力障碍分子遗传学研究进展;马凌燕 等;《中国现代神经疾病杂志》;20130731;第13卷(第7期);561-567 *
肌张力障碍遗传学发病机制及诊断策略;吴逸雯 等;《中国现代神经疾病杂志》;20130731;第13卷(第7期);568-573 *

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