CN112029844B - 肠道微生物在诊断肌张力障碍症中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药生物领域，涉及肠道微生物在诊断肌张力障碍症中的应用。本发明的目的在于提供检测肠道微生物表达水平的试剂在制备诊断肌张力障碍的试剂盒中的应用，其中所述肠道微生物包括：霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，涉及肠道微生物在诊断肌张力障碍症中的应用。
背景技术
肌张力障碍是一种复杂的高度可变的神经运动障碍，其特征是持续或间断的肌肉收缩。据统计，肌张力障碍的患病率为10万分之16，是仅次于原发性震颤和帕金森病，是第三大最常见的运动障碍性疾病。肌张力障碍可以是许多神经系统疾病的表现，也可能是孤立性肌张力障碍或者其它疾病的合并症状。孤立性肌张力障碍是除了震颤外，以肌张力障碍为唯一表型的肌张力综合征。目前，一些基因被证明与儿童和青少年发病的肌张力障碍有关，但大多数常见的成人发病的肌张力障碍患者往往是偶发的，没有明确的病因。
肠道微生物组是生活在人体胃肠道内的一个复杂的微生物群落。肠道微生物通过神经、内分泌和免疫信号机制与中枢神经系统沟通。脑-肠-微生物轴允许大脑控制肠道功能，但也为肠道微生物群影响大脑提供了机会。大量证据表明，肠道微生物在神经发育以及脑疾病如帕金森(PD)，阿尔茨海默病(AD)和多发性硬化症中扮演着重要角色。据报道，在一例肌阵挛性肌张力障碍的散发病例中，抗梭菌抗生素能够逆转胃肠道和神经系统症状，明显改善肌张力障碍患者症状，这为肌张力障碍的驱动机制和可能含有肠道微生物成分的其他神经系统疾病提供了线索。然而，肠道微生物种群与肌张力障碍之间的关系尚处于未知。
发明内容
本发明使用16S rRNA基因组靶向扩增测序和鸟枪法宏基因组测序相结合的方法，首次鉴定出了与肌张力障碍密切相关的几种菌株；同时，我们利用代谢组学技术研究了肌张力障碍患者血清中代谢组学的变化，进一步证实几种菌株与参与神经递质代谢相关的多种物质高度相关。这些微生物菌群的鉴定和发现，为下一步体外实验，进而进行微生态药物和保健产品的开发提供了宝贵的候选菌株。
本发明的目的在于提供检测肠道微生物表达水平的试剂在制备诊断肌张力障碍的试剂盒中的应用，其中所述肠道微生物包括：霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)。
上述五种菌株都属于已知菌株，可以根据现有方法得到。
本发明检测肠道微生物表达水平的方法为16S rRNA基因组靶向扩增测序和宏基因组测序相结合的方法。
本发明的另一个目的在于提供一种诊断肌张力障碍的产品，该产品包括检测肠道微生物的试剂，其中所述肠道微生物包括：霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)，普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)。
本发明另一个目的在于提供一种诊断肌张力障碍的试剂盒，试剂盒中包括检测霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)的试剂，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)的试剂，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)的试剂，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)的试剂和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)的试剂。
本发明的另一个目的在于提供通过试剂盒检测肌张力障碍的方法(见图1)，包括以下步骤：
1)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的16S rRNA基因组靶向扩增测序分析
(1)收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，
(2)采们Qiangen的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒进行微生物核酸提取，
(3)采用针对细菌16S rRNA基因V4区的特异性引物进行扩增，PCR片段回收纯化，
(4)利用Illumina公司的Hiseq 2500进行高通量测序，
(5)测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余等，最终行到高质量的可用于后续生物信息学分析的序列数据，
(6)生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量等，
(7)利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，
2)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的宏基因组测序分析
(1)收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，
(2)采用试剂盒对微生物组DNA进行片段化处理后，直接进行鸟枪法随机片段测序文库构建，
(3)测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余，
(4)测序数据分别得用现有的生物信息软件进行处理、分析，最终确定微生物组的结构组成，
(5)利用BLASTP对序列数据与KEGG数据库进行比对，对肠道微生物组的基因功能进行注释，
(6)生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量等，
(7)利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，
3)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的代谢组学分析
(1)血清样本都在冰上解冻，量控制样本用于估计代表分析过程中遇到的所有分析物的平均轮廓，
(2)用甲醇对血清样本进行处理，然后，离心，
(3)用高效液相色谱-质谱对上清液进行代谢组学分析，样品分析采用WatersACQUITY超高性能液相色谱系统和Waters Q-TOF微质量系统进行在正负电离两种模式下进行分析，
(4)原始GC-MS数据的提取、对齐、反冗余后导出为包括变量、观测值和峰值强度等的一个峰值数据集文件，并进行进一步的标准化处理，
(5)文件导入到生物统计学软件中，执行偏最小二乘回归分析，
(6)差异代谢物与差异微生物组的斯皮尔曼相关性分析，挖掘肠道微生物组改变对病人血清代谢组的影响，从而进一步分析对神经递质的改变。
优选的，本发明的试剂盒检测肌张力障碍的方法，包括以下步骤：
1)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的16S rRNA基因组靶向扩增测序分析
1.收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，
2.采们Qiangen的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒进行微生物核酸提取，定量并调整最终浓度为1ng/ml，
3.采用针对细菌16S rRNA基因V4区的特异性引物进行扩增，PCR片段回收纯化，
4.利用Illumina公司的Hiseq 2500进行高通量测序，
5.测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余等，最终行到高质量的可用于后续生物信息学分析的序列数据，
6.生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量等，
7.利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，对肌张力障碍病人和健康对照肠道菌群中相对丰度前25的细菌进行两两比较，其中，霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorealongicatena)而普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)相对丰度变化显著，
2)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的宏基因组测序分析
1.收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，
2.采用试剂盒对微生物组DNA进行片段化处理后，直接进行鸟枪法随机片段测序文库构建，
3.测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余等，
4.测序数据分别得用现有的生物信息软件包括，bowtie2、SOAPdenovo、MetaGeneMark、DIAMOND等软件进行处理、分析，最终确定微生物组的结构组成，
5.利用BLASTP对序列数据与KEGG数据库进行比对，对肠道微生物组的基因功能进行注释，
6.生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量等，
7.利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，对肌张力障碍病人和健康对照肠道菌群中相对丰度前25的细菌进行两两比较，其中，霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorealongicatena)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)相对丰度变化显著,
3)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的代谢组学分析
1.血清样本都在冰上解冻，量控制(QC)样本(通过等体积混合每一个血清样本制成)用于估计代表分析过程中遇到的所有分析物的平均轮廓，
2.用2倍体积甲醇对血清样本进行处理，然后，离心，
3.用高效液相色谱-质谱对上清液进行代谢组学分析，样品分析采用WatersACQUITY超高性能液相色谱系统(Milford,MA)和Waters Q-TOF微质量系统(Manchester,UK)进行在正负电离两种模式下进行分析，
4.原始GC-MS数据的提取、对齐、反冗余后导出为包括变量(rt_mz)、观测值(样本)和峰值强度(丰度)等的一个峰值数据集文件，并进行进一步的标准化处理，
5.文件导入到生物统计学软件(R(版本，3.5.3)中，执行偏最小二乘回归分析(Partial least squares Discriminant Analysis，PLS-DA)，R2X(PCA)或R2Y(PLS-DA)定义为模型所解释数据的方差占比，表示拟合优度，Q2定义为模型可预测数据中的方差占比，表示当前模型的可预测性，R2X、R2Y和Q2的值被用作指标来评估模式识别模型的稳健性，差异显著的代谢物由PLS-DA模型的VIP值>1和双尾t检验对标准化峰值强度的P值(<0.05)组合确定，折叠变化(FC)以两组间平均峰值强度比的二值对数计算，VIP估计PLS-DA模型中各变量的重要性；VIP评分>1的变量在模型中很重要。
6.差异代谢物与差异微生物组的斯皮尔曼相关性分析，挖掘肠道微生物组改变对病人血清代谢组的影响，从而进一步分析对神经递质的改变。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗肌张力障碍的药物或保健品。
本发明所述的药物或保健品，包括干预或者改变以下5种肠道细菌丰度的成分，5种肠道细菌为霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautiaobeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)。
其中，上述药物成分能够使菌群中霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)相对丰度显著降低，而普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)相对丰度显著升高。
本发明的有益效果，主要表现在以下方面：
肌张力障碍是继原发性震颤和帕金森病后的第三大运动神经障碍性疾病，目前病因不详，治疗手段缺乏。本发明为首次对孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组进行了系统分析，并首次发现肠道菌群中霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)相对丰度显著升高，而普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)相对丰度显著降低，P<0.05。这5种肠道细菌丰度的改变对孤立性肌张力障碍病人病程的发生、发展及预后可能发挥着重要的功能和作用，为后期针对此症的的诊断和治疗及预防药物的研发提供宝贵的候选靶标。
附图说明
图1、肌张力障碍症肠道微生物组分析技术流程图。
图2A、肌张力障碍症患者血清代谢组学偏最小二乘回归分析图(Partial leastsquares Discriminant Analysis，PLS-DA)。结果显示肌张力障碍患者血清代谢组总体特征显著不同于健康对照。
图2B、火山图直观显示在正负电离两种模式下，肌张力障碍患者血清中大量代谢物(242种)丰度都与健康对照丰在显著差异。显著差异判断标准：P<0.05,VIP>1and FC>2or<0.5,其中，VIP为用来估测变量重要性参数；FC为Fold change缩写，为特定代谢物在肌张力障碍患者血清中丰度与健康对照血清丰度的比值。图2C、肌张力障碍症患者肠道微生物组特征性细菌与242种不同代谢物之间的斯皮尔曼相关性分析相关性分析图。颜色深浅显示特征性细菌与差异代谢物的相关性大小，*显示相关系数的统计学意义，其中，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。本图只显示特征性细菌至少与一种差异代谢物的相关性统计学P值<0.01的。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、检测过程
一、孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的16S rRNA基因组靶向扩增测序分析
1.收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，
2.采们Qiangen的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒进行微生物核酸提取，定量并调整最终浓度为1ng/ml，
3.采用针对细菌16S rRNA基因V4区的特异性引物进行扩增，PCR片段回收纯化，
4.利用Illumina公司的Hiseq 2500进行高通量测序，
5.测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余等，最终行到高质量的可用于后续生物信息学分析的序列数据，
6.生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量等，
7.利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，发现孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组在多样性和菌群结构上与正常对照有着统计学意义的显著不同(P<0.05)。进一步在各个细菌分类水平上，对肌张力障碍病人和健康对照肠道菌群中相对丰度前25的细菌进行两两比较，结果发现孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组中有多个菌株的相对丰度与正常对照相比，都有统计学意义的显著变化P<0.05为有效，其中，霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorealongicatena)相对丰度显著升高，而普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)相对丰度显著降低，
二、孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的宏基因组测序分析
1.收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，2.采用试剂盒对微生物组DNA进行片段化处理后，直接进行鸟枪法随机片段测序文库构建，
3.测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余等，
4.测序数据分别得用现有的生物信息软件包括，bowtie2、SOAPdenovo、MetaGeneMark、DIAMOND等软件进行处理、分析，最终确定微生物组的结构组成，
5.利用BLASTP对序列数据与KEGG数据库进行比对，对肠道微生物组的基因功能进行注释，
6.生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量等，
7.利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，发现孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组在多样性和菌群结构上与正常对照有着统计学意义的显著不同(P<0.05)。进一步在各个细菌分类水平上，对肌张力障碍病人和健康对照肠道菌群中相对丰度前25的细菌进行两两比较，结果同样地发现孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组中有多个菌株的相对丰度与正常对照相比，都有统计学意义的显著变化P<0.05为有效。其中，霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorealongicatena)相对丰度显著升高，而普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)相对丰度显著降低，P<0.05,
三、孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的代谢组学分析
1.血清样本都在冰上解冻，量控制(QC)样本(通过等体积混合每一个血清样本制成)用于估计代表分析过程中遇到的所有分析物的平均轮廓，
2.用2倍体积甲醇对血清样本进行处理，然后，4℃，14000g离心10分钟，
3.用高效液相色谱-质谱对上清液进行代谢组学分析，样品分析采用WatersACQUITY超高性能液相色谱系统(Milford,MA)和Waters Q-TOF微质量系统(Manchester,UK)进行在正负电离两种模式下进行分析，
4.原始GC-MS数据的提取、对齐、反冗余后导出为包括变量(rt_mz)、观测值(样本)和峰值强度(丰度)等的一个峰值数据集文件，并进行进一步的标准化处理，
5.文件导入到生物统计学软件(R(版本，3.5.3)中，执行偏最小二乘回归分析(Partial least squares Discriminant Analysis，PLS-DA)，R2X(PCA)或R2Y(PLS-DA)定义为模型所解释数据的方差占比，表示拟合优度，Q2定义为模型可预测数据中的方差占比，表示当前模型的可预测性，R2X、R2Y和Q2的值被用作指标来评估模式识别模型的稳健性，差异显著的代谢物由PLS-DA模型的VIP值>1和双尾t检验对标准化峰值强度的P值(<0.05)组合确定，折叠变化(FC)以两组间平均峰值强度比的二值对数计算，VIP估计PLS-DA模型中各变量的重要性；VIP评分>1的变量在模型中很重要。
6.差异代谢物与差异微生物组的斯皮尔曼相关性分析，挖掘肠道微生物组改变对病人血清代谢组的影响，从而进一步分析对神经递质的改变。
研究结果：
1.通过对孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的16S rRNA基因组靶向扩增和宏基因组测序分析发现，肌张力障碍密切相关的微生物群落，统计学显著性，P<0.05。表1显示，在各个细菌分类水平上，鉴定出的孤立性肌张力障碍病人显著改变的的微生物物种。16S rRNA基因组靶向扩增和宏基因组分析方法，一致鉴定出与孤立性肌张力障碍相关的菌种为：Eubacterium hallii(升高),Blautia obeum(升高)，Dorea longicatena(升高)，Bacteroides vulgatus(升高),Bacteroides_plebeius(升高)。
2.通过对代谢组的偏最小二乘回归分析分析，鉴定出孤立性肌张力障碍病人血清中与正常人不同的242个代谢物(p<0.05,VIP>1and FC>2or<0.5)。
3.通过对差异代谢物与差异微生物组的斯皮尔曼相关性分析发现，Eubacteriumhallii(升高),Blautia obeum(升高)，Dorea longicatena(升高)，Bacteroides vulgatus(升高),Bacteroides_plebeius(升高)的改变，与病人血清中多种参与神经递质代谢物显著相关，提示肠道菌群的改变参与肌张力障碍病人神经病理的改变。见表2和图2。
表1.孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组在细菌各分类水平上的显著改变。P<0.05。
表2.孤立性肌张力障碍病人血清代谢组学水平的显著改变。(p<0.05,VIP>1andFC>2or<0.5)。
Claims (6)
1.检测肠道微生物表达水平的试剂在制备诊断肌张力障碍的试剂盒中的应用，其中所述肠道微生物包括：霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautiaobeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测肠道微生物表达水平的方法为16SrRNA基因组靶向扩增测序和宏基因组测序相结合的方法。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的16S rRNA基因组靶向扩增测序分析
(1)收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，
(2)采用 Qiangen的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒进行微生物核酸提取，
(3)采用针对细菌16S rRNA基因V4区的特异性引物进行扩增，PCR片段回收纯化，
(4)利用Illumina公司的Hiseq 2500进行高通量测序，
(5)测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余，最终行到高质量的可用于后续生物信息学分析的序列数据，
(6)生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量，
(7)利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，
2)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的宏基因组测序分析
(1)收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，
(2)采用试剂盒对微生物组DNA进行片段化处理后，直接进行鸟枪法随机片段测序文库构建，
(3)测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余，
(4)测序数据分别得用现有的生物信息软件进行处理、分析，最终确定微生物组的结构组成，
(5)利用BLASTP对序列数据与KEGG数据库进行比对，对肠道微生物组的基因功能进行注释，
(6)生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量，
(7)利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，
3)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的代谢组学分析
(1)血清样本都在冰上解冻，量控制样本用于估计代表分析过程中遇到的所有分析物的平均轮廓，
(2)用甲醇对血清样本进行处理，然后，离心，
(3)用高效液相色谱-质谱对上清液进行代谢组学分析，样品分析采用Waters ACQUITY超高性能液相色谱系统和Waters Q-TOF微质量系统进行在正负电离两种模式下进行分析，
(4)原始GC-MS数据的提取、对齐、反冗余后导出为包括变量、观测值和峰值强度的一个峰值数据集文件，并进行进一步的标准化处理，
(5)文件导入到生物统计学软件中，执行偏最小二乘回归分析，
(6)差异代谢物与差异微生物组的斯皮尔曼相关性分析，挖掘肠道微生物组改变对病人血清代谢组的影响，从而进一步分析对神经递质的改变。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的16S rRNA基因组靶向扩增测序分析
(1)收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，
(2)采们Qiangen的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒进行微生物核酸提取，定量并调整最终浓度为1ng/ml，
(3)采用针对细菌16S rRNA基因V4区的特异性引物进行扩增，PCR片段回收纯化，
(4)利用Illumina公司的Hiseq 2500进行高通量测序，
(5)测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余，最终行到高质量的可用于后续生物信息学分析的序列数据，
(6)生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量，
(7)利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，对肌张力障碍病人和健康对照肠道菌群中相对丰度前25的细菌进行两两比较，其中，霍氏真杆菌(Eubacteriumhallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)而普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)相对丰度变化显著，
2)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的宏基因组测序分析
(1)收集孤立性肌张力障碍病人及其家人新鲜排泄物，迅速冻存并进微生物组DNA提取，
(2)采用试剂盒对微生物组DNA进行片段化处理后，直接进行鸟枪法随机片段测序文库构建，
(3)测序数据的加工处理，包括原始数据的质量控制，净化，去冗余，
(4)测序数据分别得用现有的生物信息软件进行处理、分析，最终确定微生物组的结构组成，
(5)利用BLASTP对序列数据与KEGG数据库进行比对，对肠道微生物组的基因功能进行注释，
(6)生物信息学分析，包括将不同样本的数据标准化或归一化为同一个测序深度的数据量，
(7)利用标准化数据对肠道菌群的alpha和beta多样性分析比较，对肌张力障碍病人和健康对照肠道菌群中相对丰度前25的细菌进行两两比较，其中，霍氏真杆菌(Eubacteriumhallii)，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)相对丰度变化显著,
3)孤立性肌张力障碍病人肠道微生物组的代谢组学分析
(1)血清样本都在冰上解冻，量控制样本用于估计代表分析过程中遇到的所有分析物的平均轮廓，
(2)用2倍体积甲醇对血清样本进行处理，然后，离心，
(3)用高效液相色谱-质谱对上清液进行代谢组学分析，样品分析采用Waters ACQUITY超高性能液相色谱系统和Waters Q-TOF微质量系统进行在正负电离两种模式下进行分析，
(4)原始GC-MS数据的提取、对齐、反冗余后导出为包括变量、观测值和峰值强度的一个峰值数据集文件，并进行进一步的标准化处理，
(5)文件导入到生物统计学软件中，执行偏最小二乘回归分析，R2X或R2Y定义为模型所解释数据的方差占比，表示拟合优度，Q2定义为模型可预测数据中的方差占比，表示当前模型的可预测性，R2X、R2Y和Q2的值被用作指标来评估模式识别模型的稳健性，差异显著的代谢物由PLS-DA模型的VIP值>1和双尾t检验对标准化峰值强度的P值<0.05组合确定，折叠变化以两组间平均峰值强度比的二值对数计算，VIP估计PLS-DA模型中各变量的重要性，
(6)差异代谢物与差异微生物组的斯皮尔曼相关性分析，挖掘肠道微生物组改变对病人血清代谢组的影响，从而进一步分析对神经递质的改变。
5.一种诊断肌张力障碍的产品，其特征在于，该产品包括检测肠道微生物的试剂，其中所述肠道微生物包括：霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)，卵形布劳特氏菌(Blautiaobeum)，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)。
6.一种诊断肌张力障碍的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括检测霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)的试剂，卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)的试剂，长链多尔氏菌(Dorea longicatena)的试剂，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)的试剂和四棘蝴蝶鱼拟杆菌(Bacteroides_plebeius)的试剂。
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