CN117418025A - 肠道菌群标志物在自闭症诊断和治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肠道菌群标志物在自闭症诊断和治疗中的应用，所述肠道菌群标志物至少包括柯林斯菌Collinsella；本发明首次发现了柯林斯菌Collinsella与自闭症相关，该肠道菌属在自闭症患者人群中的丰度显著降低，且分析结果显示用ROC曲线分析柯林斯菌Collinsella作为检测变量时具有较高的特异性和敏感性，故其可以作为检测标志物应用于自闭症患者的筛查和诊断，或可用于制备缓解自闭症相关症状的药物或保健食品。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种与自闭症相关的肠道菌群标志物及其在制备自闭症诊断产品和制备治疗或缓解自闭症药物或保健食品中的应用。
背景技术
自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD，以下简称自闭症)是一种复杂的神经发育障碍，其特征是广泛存在的社会交往和交往异常，以及受限的兴趣和重复行为。自闭症通常出现在生命的头三年，表现为特征性症状或行为特征。自闭症的病因尚未明确，现有研究认为自闭症是一种在一定遗传因素作用下，受多种环境因子刺激导致的弥漫性中枢神经系统发育障碍性疾病。
目前尚未发现对自闭症有确定疗效的药物疗法，FDA批准的用于治疗自闭症的两种药物(利培酮和阿立哌唑)仅用于降低患有自闭症的受试者的易怒。因此，目前用于改善自闭症的唯一有效方式是早期诊断并基于该诊断进行早期教育干预。但在传统的自闭症诊断中，只能通过医生对儿童的行为来进行评价和诊断，尚无明确的生理诊断指标，难以进行客观评价。
近年来，越来越多的研究发现自闭症患者常伴随着不同程度的肠胃症状以及肠道菌群失调，表明肠道微生物在自闭症的发病过程中扮演着重要角色，但作用机制尚未完全明确。因此，开发与自闭症相关的生物标志物，有望为自闭症的早期诊断、治疗提供新的途径。
发明内容
有鉴于此，本发明通过收集自闭症患者和健康人的样本，进行16SrRNA测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现了与自闭症相关的肠道菌群，进一步将肠道菌群与疾病信息整合，得到了能够预测自闭症患者的肠道菌群标志物和方法，为自闭症的筛查、诊断提供了新的途径。
本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种与自闭症相关的肠道菌群标志物，其至少包括柯林斯菌Collinsella。
本发明通过收集自闭症患者和健康人的粪便样本，对粪便样本中的微生物基因组DNA进行了提取、扩增、建库和宏基因组测序，将所得测序数据处理成分类学丰度数据，利用训练集数据通过差异菌和线性判别分析，首次发现该肠道菌属在自闭症患者人群中呈现明显减少，在健康人群中显著增加，进一步通过验证集数据发现用ROC曲线分析其作为检测变量具有较高的特异性和敏感性。可见，柯林斯菌Collinsella可以作为检测标志物应用于自闭症患者的筛查和诊断。
优选地，在上述肠道菌群标志物中，还包括副杆状菌Parabacteroides；副杆状菌Parabacteroides也是本发明首次发现的与自闭症相关的肠道微生物菌属，本发明数据表明：该肠道菌属在自闭症患者人群中显著富集，但与柯林斯菌Collinsella相比，用ROC曲线分析副杆状菌Parabacteroides作为检测变量时的敏感性较低。
更为优选地，在上述肠道菌群标志物中，还可以包括拟杆菌Bacteroides、Lachnoclostridium、双歧杆菌Bifidobacterium和布劳特氏菌Blautia中的任意一种或多种。其中，拟杆菌Bacteroides和Lachnoclostridium在自闭症患者人群中显著富集，双歧杆菌Bifidobacterium和布劳特氏菌Blautia在自闭症患者人群中显著减少。
本发明第二方面提供了上述与自闭症相关的肠道菌群标志物在制备自闭症筛查或诊断产品中的应用。
在上述应用中，所述产品通过测定样本中所述肠道菌群标志物的丰度以实现自闭症的筛查或诊断，且所述样本为受试者的粪便样本。
在上述应用中，所述产品包括但不限于为检测试剂盒和预测系统。
优选地，所述试剂盒包括用于检测所述肠道菌群标志物丰度的试剂，所述试剂包括但不限于为检测所述肠道菌群标志物的特异性引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体等；更为优选地，所述特异性引物为扩增所述肠道菌群标志物16SrRNA的引物。
优选地，所述预测系统的检测变量为所述肠道菌群标志物的丰度；其中，柯林斯菌Collinsella、双歧杆菌Bifidobacterium和布劳特氏菌Blautia在自闭症患者样本中的丰度显著低于在健康人样本中的丰度，拟杆菌Bacteroides、Lachnoclostridium和副杆状菌Parabacteroides在自闭症患者样本中的丰度显著高于在健康人样本中的丰度。
本发明第三方面提供了上述与自闭症相关的肠道菌群标志物在制备治疗自闭症的药物和/或制备缓解自闭症相关症状的保健食品中的应用。
本发明第四方面提供了一种建立源于肠道菌群的自闭症预测系统的方法，具体如图1所示，包括以下步骤：
S1、确定自闭症儿童和健康儿童的入组标准；
S2、收集自闭症儿童组和健康儿童组的粪便样本，对粪便样本中的微生物基因组DNA进行提取、扩增、建库和宏基因组测序，获取原始数据；和/或直接从数据库获取自闭症儿童组和健康儿童组的原始数据；
S3、用同样的质控和分析方法对原始数据进行质控，剔除不合格的数据；
S4、用同样的方法分析出肠道微生物菌群的相对丰度；
S5、筛选出差异菌，并通过秩和检验和线性判别分析效应量；
S6、二元逻辑回归测试所述差异菌的真阳性率和真阴性率。
在本发明的上下文中，术语“丰度”是指生物样本中目标微生物的数量的量度。生物样本内目标核酸序列丰度的定量可能是绝对的或相对的。“相对丰度”通常是基于一个或多个内部参考基因，即来自参考菌株16SrRNA基因，比如使用通用引物并且将目标核酸序列的丰度表达为总细菌16SrRNA基因拷贝的百分比或通过大肠杆菌16SrRNA基因拷贝归一化而测定的性细菌。“绝对丰度”通过与DNA标准进行比较或通过DNA浓度归一化来给出目标分子的确切数目。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明首次发现了原核生物柯林斯菌属Collinsella和副杆状菌属Parabacteroides与自闭症相关，具体的，柯林斯菌属Collinsella在自闭症患者人群中显著减少,副杆状菌属Parabacteroides在自闭症患者人群中显著富集。
(2)本发明的实验结果表明，以柯林斯菌属Collinsella作为检测变量建立自闭症预测系统时，具有较高的特异性和敏感性，故该但菌属可作为检测标志物应用于自闭症患者的筛查和诊断，且检测方法完全无创，准确度高。而且，相对于现有技术如专利申请202211381678.X，本发明采用了更大的样本量进行验证，预测效果更可靠。
(3)本发明为自闭症患者提供了肠道菌群检测手段，并为判断患儿的自闭症和肠道菌群紊乱提供菌源性依据，为后期肠菌移植提供依据。
附图说明
图1为本发明建立源于肠道菌群的自闭症预测系统的方法的技术路线图。
图2为本发明实施例1筛选与验证与自闭症相关的肠道菌群标志物的实验流程图。
图3为实施例1中6个菌属的LEfSe得分图。
图4为实施例1中6个菌属的箱式散点图。
图5为实施例1中的ROC曲线图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图和具体实施例进一步阐明本发明的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本例筛选并验证了能够用于自闭症检测的肠道菌群标志物，实验流程如图2所示，具体操作如下：
(1)样本收集。
收集371例自闭症以及811例健康人的粪便样本。样本来源及入选标准如下：
自闭症组：来自371组家庭，年龄分布3～16岁。其纳入标准为：诊断为自闭症的患者。排除标准有：①患有其他精神疾病(如精神分裂症)和其他神经发育障碍疾病；②患有传代谢性疾病；③患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史；④近1个月内有胃肠道感染病史或抗生素使用史。
对照组：来自811组家庭，年龄分布3～16岁。其纳入标准为：①身体健康，无神经发育障碍疾病；②与患者组年龄匹配。排除标准同自闭症组。
以上数据来源于武汉医院收集的粪便样本以及NCBI数据库上下载原始数据，其中粪便样本就继续进行步骤(2)，而NCBI数据库上下载的原始数据，就直接进行步骤(3)。
(2)DNA提取、构建文库及测序。
采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)方法对粪便样本的微生物基因组DNA进行提取，随后进行PCR扩增。扩增引物使用TruSeq@DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建后使用Illumina Miseq PE250进行上机测序。
(3)LEfSe分析筛选生物标志物。
对下机数据进行过滤、去噪及拼接得到高质量测序数据，将Identity的标准设为100％进行聚类，划分ASV特征序列。使用qiime2的插件feature-classifier classify-sklearn进行特征序列的注释，生成分类学丰度数据。
随机选择80％丰度数据使用LEfSe软件进行分析，默认设置LDA Score的筛选值为3.5，结果如图2所示。筛选出在自闭症组显著富集的3种微生物拟杆菌属Bacteroides、Lachnoclostridium属和副杆状菌属Parabacteroides和健康组富集的3种微生物双歧杆菌属Bifidobacterium、布劳特氏菌属Blautia和柯林斯菌属Collinsella。这六个菌属的箱式散点图见图3。这六个菌属中，柯林斯菌属Collinsella和副杆状菌属Parabacteroides是首次被发现与自闭症相关。
(4)预测评分系统的建立。
将剩下20％丰度数据先进行二元逻辑回归，然后进行受试者工作曲线测试(ROC曲线)分析，得出cutoff值(最佳截断值)。其中，步骤(3)和(4)所涉及的样本信息表如表1所示。
表1样本信息表
利用IBM SPSS Statistics(v27)统计学软件完成特异性及敏感度计算及ROC曲线绘制，软件内部先计算实际测量值的阈值，而后计算阈值对应的真阳性例数(TP)、假阳性例数(FP)、真阴性例数(TN)、假阴性例数(FN)，特异性(真阴性率)＝TN/(TN+FP)，敏感度(真阳性率)＝TP/(TP+FN)，通过1-特异性和敏感度即可构建ROC曲线，ROC曲线的积分即为AUC。为了计算某指标的特异性及敏感度，我们先计算约登系数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登系数取最大值时所对应的特异性及敏感度即为某指标的特异性及敏感度。
单个微生物菌属的相对丰度值直接进行受试者工作曲线测试(ROC曲线)分析，结果如图5所示。拟杆菌Bacteroides、Lachnoclostridium、副杆状菌Parabacteroides、双歧杆菌Bifidobacterium、布劳特氏菌Blautia和柯林斯菌Collinsella的预测评分方法的AUC、最佳截断值、敏感度、特异性见于表2。
表2ROC诊断曲线结果
从上述结果可知，柯林斯菌Collinsella单菌对自闭症的预测能力远远高于其他菌属，其预测评分方法的AUC为0.753，敏感度为67.5％，特异性为76.0％；而柯林斯菌Collinsella和副杆状菌Parabacteroides组合预测评分方法的AUC为0.753，最佳截断值为0.597，敏感度为67.5％，特异性为76.0％，与柯林斯菌属(Collinsella)单菌的效果一样，说明柯林斯菌属(Collinsella)的预测性能不受副杆状菌Parabacteroides影响。
综上所述，本发明首次发现了柯林斯菌Collinsella和副杆状菌Parabacteroides与自闭症相关，且数据表明柯林斯菌Collinsella在自闭症患者人群中显著减少，而副杆状菌Parabacteroides在自闭症患者人群中显著富集；进一步的验证试验表明柯林斯菌Collinsella单菌作为检测变量时具有较高的特异性和敏感性，故其能作为自闭症的预测因子。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的意思相同的含义。
上述实施案例只为说明本发明的技术方案及特点，其目的在于更好的让熟悉该技术的人士予以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，均在本发明保护范围之内，其中未详细说明的为现有技术。
Claims (10)
1.与自闭症相关的肠道菌群标志物，其特征在于，所述肠道菌群标志物至少包括柯林斯菌Collinsella。
2.根据权利要求1所述与自闭症相关的肠道菌群标志物，其特征在于，所述肠道菌群标志物还包括副杆状菌Parabacteroides。
3.根据权利要求1所述与自闭症相关的肠道菌群标志物，其特征在于，所述肠道菌群标志物还包括拟杆菌Bacteroides、Lachnoclostridium、双歧杆菌Bifidobacterium和布劳特氏菌Blautia中的任意一种或多种。
4.如权利要求1～3任一项所述的与自闭症相关的肠道菌群标志物在制备自闭症筛查或诊断产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品通过测定样本中所述肠道菌群标志物的丰度以筛查或诊断自闭症。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒和预测系统。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测所述肠道菌群标志物丰度的试剂。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预测系统的检测变量为所述肠道菌群标志物的丰度。
9.如权利要求1～3任一项所述的肠道菌群标志物在制备治疗自闭症的药物中的应用。
10.如权利要求1～3任一项所述的肠道菌群标志物在制备缓解自闭症症状的保健食品中的应用。
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Cited By (3)
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| CN118326033B (zh) * | 2024-06-14 | 2024-10-29 | 杭州迪谱医学检验实验室有限公司 | 一种诊断或预测孤独症的微生物标志物组合、系统和应用 |
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