CN109266733B - 自闭症肠道菌群毒力因子基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组自闭症生物标志物及其应用。其中，本发明的一组自闭症生物标志物为如下所示的一组肠道菌群毒力因子基因的至少之一：acpXL、cpsH、escL、cpsJ、IlsP、wzy、lgtC、legK2、Cj1440c、wlaN、wbcG、cpsM、lpg2885、cpsO、ospC4、legLC8、flgF、pvdM、afaC‑VII、wcbE、tcpI。基于待测个体和健康对照的一组自闭症生物标志物中各肠道菌群毒力因子基因的丰度检测结果，即可有效确定待测个体是否易患自闭症。

Description

自闭症肠道菌群毒力因子基因及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及一组自闭症生物标志物及其应用。

背景技术

自闭症(ASDs，Autism Spectrum Disorders)或称孤独症或者孤独症谱系障碍，是广泛性发育障碍的一种亚型，以男性多见，起病于婴幼儿期，主要表现为不同程度的言语发育障碍、人际交往障碍、兴趣狭窄和行为方式刻板，约有3/4的患者伴有明显的精神发育迟滞。据美国疾病监控与预防中心(CDC)数据，2015年其发病率1/45(即2.24％)。我国尚缺乏全国性流行病调查数据，若以1/100估算，预估我国自闭症患者将超过1000万。自闭症作为一种儿童精神疾病，严重影响患儿的社会功能，也会给患儿家庭和社会带来沉重负担。

然而，目前自闭症通常根据量表进行评估，没有血液诊断方法和有效的治疗方案，这样诊断将依靠主观经验判断，不仅不能对自闭症的发病提供有效预警，而且诊断准确率很低。因此，研究自闭症发病机理及其疾病相关的生物标志物，进而及时针对病因进行干预与治疗是治疗疾病、减轻社会负担的关键因素。

但是，现阶段针对自闭症发病机理及其疾病相关的生物标志物的研究还有待加强。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一组自闭症相关的生物标志物。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列研究、发现和工作而完成的：

发明人在研究过程中发现，自闭症患者普遍存在肠道功能紊乱，而肠道功能紊乱可能加重自闭症的症状，进而，对自闭症患者和健康人进行了一系列的肠道微生物深入研究。其中，发明人通过鸟枪法宏基因组测序，检测了自闭症患者和对照组的粪便样本肠道菌群多态性，发现两者的细菌总数和细菌丰度都有显著差异，而进一步的研究则惊喜地发现，自闭症患者的一些肠道菌群毒力因子基因的丰度相对于健康人具有显著的差异。

发明人进一步对上述发现进行了验证，确定基于待测个体和健康对照的如下所示的一组肠道菌群毒力因子基因的至少之一的丰度检测结果：acpXL、cpsH、escL、cpsJ、IlsP、wzy、lgtC、legK2、Cj1440c、wlaN、wbcG、cpsM、lpg2885、cpsO、ospC4、legLC8、flgF、pvdM、afaC-VII、wcbE、tcpI，即可有效确定待测个体是否易患自闭症。由此，发明人认为，可以将上述的一组肠道菌群毒力因子基因的至少之一作为自闭症生物标志物，用于临床和科学研究等各种诊断和非诊断情形下的自闭症检测和筛选。

由此，在本发明的第一方面，本发明提供了一组自闭症生物标志物。根据本发明的实施例，该自闭症生物标志物为为如下所示的一组肠道菌群毒力因子基因的至少之一：acpXL、cpsH、escL、cpsJ、IlsP、wzy、lgtC、legK2、Cj1440c、wlaN、wbcG、cpsM、lpg2885、cpsO、ospC4、legLC8、flgF、pvdM、afaC-VII、wcbE、tcpI。如上所述，基于待测个体和健康对照的上述一组自闭症生物标志物中各肠道菌群毒力因子基因的丰度检测结果，即可有效确定待测个体是否易患自闭症。

根据本发明的实施例，所述自闭症生物标志物表现为所述一组肠道菌群毒力因子基因在自闭症患者和健康人之间具有下表所示的显著的丰度差异：

。在本文中，术语“生物标志物”应做广义理解，其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物，物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物(KO/OG标志物)，其具有非常广泛的用途，可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

术语“毒力因子”是指使微生物在特定物种的宿主身上或其内部建立自身并增强其引起疾病的潜力的特性(即基因产物)。毒力因素包括细菌毒素，介导细菌附着的细胞表面蛋白质，细胞表面碳水化合物和保护细菌的蛋白质，以及可能有助于细菌致病性的水解酶。

表达方式“肠道菌群毒力因子基因的丰度”是指样品中所含的各肠道菌群毒力因子基因的含量。

在本发明的第二方面，本发明还提供了适于检测前面所述的一组自闭症生物标志物的试剂在制备自闭症检测试剂盒中的用途。由此，利用制备获得的试剂盒中的适于检测自闭症生物标志物的试剂，即可对待测生物样品和健康对照样品进行所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因的丰度检测，进而，基于两者的丰度差异结果即可有效判断待测生物样品是否易患自闭症。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种自闭症检测试剂盒。根据本发明的实施例，该自闭症检测试剂盒包括适于检测前面所述的一组自闭症生物标志物的试剂。由此，利用所述试剂盒中的适于检测自闭症生物标志物的试剂，即可对待测生物样品和健康对照样品进行上述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因的丰度检测，进而，基于两者的丰度差异结果即可有效判断待测生物样品是否易患自闭症。

根据本发明的实施例，所述适于检测前面所述的一组自闭症生物标志物的试剂包括：适于对待测个体的粪便样品进行基因组DNA提取以及宏基因组建库和测序的试剂。由此，即可对待测生物样品和健康对照样品进行上述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因的丰度检测，进而，基于两者的丰度差异结果即可有效判断待测生物样品是否易患自闭症。

根据本发明的一些具体示例，所述对待测个体的粪便样品进行基因组DNA提取的试剂为粪便DNA提取试剂盒，优选北京康为世纪的货号为CW2092S的StoolGen粪便DNA提取试剂盒。由此，粪便样品基因组DNA提取效果好，使得自闭症生物标志物的检测结果更加准确可靠。

根据本发明的一些实施例，所述宏基因组建库和测序的试剂为IlluminaHiSeq2500测序平台的建库和测序试剂。由此，自闭症生物标志物的检测结果更加准确可靠。

根据本发明的一些实施例，所述试剂盒的使用包括以下步骤：

分别对待测个体的粪便样品和健康对照样品进行基因组DNA提取，以便获得基因组DNA；

针对所述基因组DNA进行宏基因组建库和测序，以便获得宏基因组测序数据；

基于宏基因组测序数据分别确定所述待测个体的粪便样品和健康对照样品的所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因的丰度；

基于丰度确定结果确定所述待测个体是否易患自闭症，其中，所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因在待测个体的粪便样品和健康对照样品之间具有下表所示的显著的丰度差异，是所述待测个体易患自闭症的指示：

由此，利用该试剂盒能够有效实现对待测生物样品的一组自闭症生物标志物的检测，且结果准确可靠。

根据本发明的实施例，所述健康对照样品也为粪便样品，来自健康人。

根据本发明的一些具体示例，采用鸟枪法宏基因组测序法进行所述宏基因组建库和测序，鸟枪法宏基因组测序(Shotgun metagenome sequencing)能够高精度的反应细菌的种类和丰度。

根据本发明的一些实施例，采用Illumina HiSeq 2500测序平台进行所述宏基因组建库和测序。由此，测序结果准确，从而自闭症生物标志物的检测结果更加准确可靠。

根据本发明的一些具体示例，

分别对待测个体的粪便样品和健康对照样品进行基因组DNA提取，以便获得基因组DNA；

针对所述基因组DNA进行宏基因组建库和测序，以便获得宏基因组测序数据；

基于宏基因组测序数据分别确定所述待测个体的粪便样品和健康对照样品的所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因的丰度；

基于丰度确定结果确定所述待测个体是否易患自闭症，其中，所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因在待测个体的粪便样品和健康对照样品之间具有下表所示的显著的丰度差异，是所述待测个体易患自闭症的指示：

由此，自闭症生物标志物的检测结果准确可靠。

根据本发明的一些实施例，基于丰度确定结果确定所述待测个体是否易患自闭症进一步包括：使用Deseq2软件对所述待测个体的粪便样品和健康对照样品的各肠道菌群毒力因子基因的丰度进行组间差异分析，并基于差异分析结果确定所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因在待测个体的粪便样品和健康对照样品之间是否具有上表所示的显著的丰度差异，其中，P值小于0.05表示丰度差异显著。由此，自闭症生物标志物的检测结果更加准确可靠。

综上所述，本发明的一组自闭症生物标志物以及自闭症检测试剂盒能够有效用于筛选易患自闭症的生物样品。从而，在本发明的第四方面，本发明还提供了前面所述的一组闭症生物标志物或者自闭症检测试剂盒在筛选易患自闭症的生物样品中的应用。

进一步，在本发明的第五方面，本发明提供了一种筛选易患自闭症的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：

自闭症生物标志物检测装置，所述自闭症生物标志物检测装置用于分别检测待测生物样品和健康对照样品中的前面所述的一组自闭症生物标志物，并确定两者的所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因的丰度；以及

分析装置，所述分析装置与所述自闭症生物标志物检测装置相连，用于从所述自闭症生物标志物检测装置接收所述待测生物样品和健康对照样品中的各肠道菌群毒力因子基因的丰度确定结果，并基于所述丰度确定结果确定所述待测生物样品是否易患自闭症，其中，所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因在待测生物样品和健康对照样品之间具有下表所示的显著的丰度差异，是所述待测生物样品易患自闭症的指示：

根据本发明的实施例，利用上述的筛选易患自闭症的生物样品的系统，能够有效筛选易患自闭症的生物样品，并且检测筛选的结果准确，可靠，可重复性好。

根据本发明的一些具体示例，所述待测生物样品和健康对照样品均为粪便样品，分别来自待测个体和健康人。

根据本发明的一些实施例，所述自闭症生物标志物检测装置包括：粪便DNA提取单元；宏基因组建库和测序单元；以及丰度确定单元，其中，所述丰度确定单元适于基于宏基因组测序数据分别确定所述待测生物样品和健康对照样品的所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因的丰度。

根据本发明的实施例，所述宏基因组建库和测序单元适于实施鸟枪法宏基因组测序。

根据本发明的一些具体示例，采用Illumina HiSeq 2500测序平台作为所述宏基因组建库和测序单元。由此，测序数据准确，自闭症生物标志物的检测结果更加准确可靠。

根据本发明的一些实施例，在所述丰度确定单元中，基于宏基因组测序数据分别确定所述待测生物样品和健康对照样品的所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因的丰度，进一步包括：将所述宏基因组测序数据比对到毒力因子基因数据库(virulence factor database,http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)，以便得到各样品的肠道菌群毒力因子基因的丰度。由此，自闭症生物标志物的检测结果准确可靠。

根据本发明的另一些实施例，在所述分析装置中，基于所述丰度确定结果确定所述待测生物样品是否易患自闭症进一步包括：使用Deseq2软件对所述待测个体的粪便样品和健康对照样品的各肠道菌群毒力因子基因的丰度进行组间差异分析，并基于差异分析结果确定所述一组自闭症生物标志物中的各肠道菌群毒力因子基因在待测个体的粪便样品和健康对照样品之间是否具有上表所示的显著的丰度差异，其中，P值小于0.05表示丰度差异显著。由此，自闭症生物标志物的检测结果更加准确可靠。

本发明首次发现自闭症的致病与上述的肠道菌群毒力因子基因的丰度有关，因此将上述的肠道菌群毒力因子基因作为自闭症的检测标志物。根据本发明实施例的自闭症生物标志物能够有效用于任何诊断和非诊断(如科学研究)用途的自闭症检测，具体地，基于对待测生物样品和健康对照样品进行一组自闭症生物标志物中各肠道菌群毒力因子基因的丰度检测，并基于两者的丰度差异结果即可有效判断待测生物样品是否易患自闭症。并且结果准确，可靠，可重复性好。由此，自闭症的诊断将不依靠主观经验判断，不仅可以对自闭症的发病提供有效预警，而且可对其进行确诊，克服了自闭症的诊断较大程度的依赖于主观经验判断的缺陷，极大提高了诊断准确率。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是实施例1中发现阶段自闭症和对照组肠道菌群毒力因子基因对比图，显示了毒力因子基因能显著区分疾病组和对照组(多维方差分析，p<0.006)；

图2是实施例1中验证阶段自闭症和对照组肠道菌群毒力因子基因对比图，显示了毒力因子基因能显著区分疾病组和对照组(多维方差分析，p<0.0002)。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1

1对象与方法

1.1研究对象

患者组来自深圳市儿童医院心理科及言语治疗科门诊自闭症患儿，收集时间为2015年7～12月。纳入标准：①根据国际最新诊断标准，即《美国精神障碍诊断与统计手册第5版》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,5th Edition，DSM-5)，诊断为“自闭症”需要非常多支持的患儿；②年龄<14岁；③性别不限。排除标准：①患有其他精神疾病(如精神分裂症等)；②患有其他神经发育障碍疾病；③患有遗传代谢性疾病；④患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史。对照组来自深圳市儿童医院儿保科体检儿童。纳入标准：①无精神疾病，身体健康；②与患者组年龄及性别匹配。排除标准同患者组。所有入组儿童家长对本研究知情并签署知情同意书。本研究经深圳市儿童医院伦理委员会批准。

本研究分两期，第一期为发现阶段，共收集22例患儿，男18例，女4例；年龄2～6岁，平均(2±1)岁。共收集15名对照儿童，男8名，女7名；年龄1～6岁，平均(2±1)岁。两组性别(Fisher精确检验，P>0.05)、年龄(Student’s T test，P>0.05)差异无统计学意义。第二期为验证阶段，收集22例患儿，男18例，女3例；年龄2～6岁，平均(2±1)岁。共收集16名对照儿童，男9名，女7名；年龄1～6岁，平均(2±1)岁。两组性别(Fisher精确检验，P>0.05)、年龄(Student’s T test，P>0.05)差异无统计学意义

1.2采集粪便及前期处理

参与者自行将粪便排在指定的粪便采集盆，然后准备医用一次性粪便采样管，戴手套，采集粪便，采集中断，避免因疏忽造成的污染，一旦发现污染，应重新采样，采集完成后迅速冷冻保存于-80℃冰箱。收集相关基础信息，包括：姓名、性别、年龄、身高、体重、患病史、家庭住址、父母联系方式等详实的《健康情况信息表》；《饮食及生活习惯调查表》需重点收集的资料包括饮食习惯，是否母乳喂养，父母生活习惯、健康状况及吸烟史，家庭所处氛围，近期抗生素，酸奶，益生菌使用等。

粪便标本收集完后，采用北京康为世纪的型号为CW2092S的StoolGen粪便DNA提取试剂盒按照其说明书进行基因组DNA的提取。

1.3宏基因组建库和测序

利用NanoDrop 2000进行对DNA进行定量，总量需要达到5ug以上，同时取200ng基因组DNA进行电泳鉴定；取基因组DNA 5ug(以qubit定量结果为准，用TE补足到130ul的体积)，利用Covaris将宏基因组DNA打断到180bp；打断后用EB 85ul进行洗脱；末端补平，加A，加接头，2％的琼脂糖凝胶选取目标片段(QIAGEN Gel Kit，20ul EB洗脱)，Qubit定量，然后用llumina HiSeq 2500测序平台进行高通量测序。

1.4生物信息分析和统计

首先，过滤掉一些质量差或含有接头的序列。其次，所有测定的序列均对照人类基因组序列(参考Hg19)以剔除人为污染的序列。再次，采用最新的MEGAN软件v5的默认参数，对鸟枪法宏基因组测序数据进行blast比对到毒力因子相关基因数据库(virulencefactor-related gut microbiota genes：virulence factor database,http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)。得到每个样品肠道菌群毒力因子相关基因的丰度。

然后，通过多维方差分析判断疾病组和对照组在毒力因子基因是否差异显著，以及用稀疏偏最小二乘判别分析(PLSDA)后进行展示，疾病组和对照组的毒力因子基因的多态性是否差异显著则是用秩和检验进行分析。

2结果

2.1发现阶段

第一期为发现阶段，共收集22例患儿，男18例，女4例；年龄2～6岁，平均(2±1)岁。共收集15名对照儿童。发明人发现肠道菌群毒力因子相关基因能显著区分自闭症患者和正常对照(图1，多维方差分析，p<0.006)。

进一步，发明人确定了44个自闭症患者组和对照组差异显著的肠道菌群毒力因子，其中33个肠道菌群毒力因子的丰度在自闭症患者组显著上升，11个肠道菌群毒力因子的丰度在自闭症患者组显著下降(见表1)。

表1.自闭症和对照组丰度差异显著的肠道菌群毒力因子(发现阶段)

2.2验证阶段

第二期为验证阶段，共收集22例患儿，男18例，女3例；年龄2～6岁，平均(2±1)岁。共收集16名对照儿童，男9名，女7名；年龄1～6岁，平均(2±1)岁。结果见图2。发明人发现肠道菌群毒力因子相关基因能显著区分自闭症患者和正常对照(图2，多维方差分析，p<0.0002)。

进一步，发明人确定了228个自闭症患者组和对照组差异显著的肠道菌群毒力因子，其中117个肠道菌群毒力因子的丰度在自闭症患者组显著上升，111个肠道菌群毒力因子的丰度在自闭症患者组显著下降(见表2)。

表2.自闭症和对照组丰度差异显著的肠道菌群毒力因子(验证阶段)

进一步，发明人将发现和验证阶段的结果取交集，得到共计21个自闭症患者组和对照组差异显著的肠道菌群毒力因子，其中15个肠道菌群毒力因子的丰度在自闭症患者组显著上升，6个肠道菌群毒力因子的丰度在自闭症患者组显著下降(见表3)。

其中，丰度差异是通过使用Deseq2软件对自闭症患者组和对照组的肠道菌群毒力因子基因的丰度进行组间差异分析确定的，其中P值小于0.05表示丰度差异显著。

表3.自闭症和对照组丰度差异显著的肠道菌群毒力因子(发现和验证阶段)

3结论

发明人发现，自闭症患者肠道菌群毒力因子基因能显著区分疾病组和对照组，且上述得到的一组共21个肠道菌群毒力因子在自闭症患者和健康对照之间具有显著的丰度差异，其中15个肠道菌群毒力因子的丰度在自闭症患者组显著上升，6个肠道菌群毒力因子的丰度在自闭症患者组显著下降，从而上述的自闭症患者肠道菌群毒力因子基因可以作为自闭症患者的标志物。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.适于检测一组自闭症生物标志物的试剂在制备自闭症检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述一组自闭症生物标志物为如下所示的一组肠道菌群毒力因子基因：acpXL、cpsH、escL、cpsJ、IlsP、wzy、lgtC、legK2、Cj1440c、wlaN、wbcG、cpsM、lpg2885、cpsO、ospC4、legLC8、flgF、pvdM、afaC-VII、wcbE、tcpI；

其中，所述一组自闭症生物标志物表现为所述一组肠道菌群毒力因子基因在自闭症患者和健康人之间具有如下所示的显著的丰度差异：

相对于健康人，自闭症患者的肠道菌群毒力因子基因acpXL、cpsH、escL、cpsJ、IlsP、wzy、lgtC、legK2、Cj1440c、wlaN、wbcG、cpsM、lpg2885、cpsO以及ospC4的丰度显著上升；

相对于健康人，自闭症患者的肠道菌群毒力因子基因legLC8、flgF、pvdM、afaC-VII、wcbE以及tcpI的丰度显著下降。

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