CN112384634B - 骨质疏松生物标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及骨质疏松生物标志物及其用途。所述生物标志物包括多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)，Bacteroides intestinalis，Bacteroides dorei，瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)，嗜粘蛋白‑艾克曼菌Akkermansia muciniphila，Parabacteroides merdae，扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques，Dialister invisus及它们的类似物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及骨质疏松生物标志物及其用途。尤其地，本发明涉及骨质疏松或相关疾病的生物标志物、诊断或预测骨质疏松或相关疾病风险的方法、试剂盒及骨质疏松生物标志物在制备试剂盒中的用途。
背景技术
骨质疏松症(英文：osteoporosis，来自希腊文porous bones，意为“多孔的骨头”)是一种因骨质密度下降，而骨折风险提高的疾病。起因是矿物质大量流失，导致骨头中的钙质不断流失到血液中；骨质疏松症也是中高年龄族群最常见的骨折原因。易于因骨质疏松而骨折的骨骼部位有脊椎、前臂骨、髋关节骨。通常骨折前都不会有任何症状，一直到骨骼变得松软易折，稍微受压就会断裂；发生慢性疼痛及机能衰退后，就连日常活动都会导致再度骨折。
骨质疏松症会随着年纪增加而加重，约15％的白人50多岁起会出现症状，80岁以上则会提高到70％；骨质疏松亦多见于女性，甚于男性患者。发达国家中利用筛检发现2％-8％男性及9％-38％的女性确诊罹患骨质疏松；发展中国家的发病率则尚不明朗。2010年，欧洲有将近2200万女性患者和550万左右男性患者，同年在美国，发现有800万左右女性和100-200万男性患者。骨质疏松症的危险因子包括性别(尤其是女性)、太早停经、种族(尤其是白人和亚洲人)、骨头结构较细、身体质量指数过低、抽烟、酗酒、活动量不足、具有家族病史。
虽然骨质疏松症多数情况下并不会直接导致死亡，但骨质疏松症增加骨折机会，从而影响病患者的健康和独立生活能力，更大大增加社会医疗负担。现有的骨密度筛查只是表面的了解骨密度的变化，但并不能从整体上对患者进行骨质疏松症状的评估。
有关骨质疏松的诊断和筛查还需要进一步改进。本领域迫切需要对骨质疏松生物标志物进行进一步的研究。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：肠道微生物是存在于人体肠道中的微生物群落，是人体的“第二基因组”。人体肠道菌群和宿主构成一个相互关联的整体，肠道微生物不仅能降解食物中消化的营养成分、宿主维生素以及其他的一些营养物质，还能促进肠上皮细胞的分化与成熟，从而激活肠道免疫系统以及调节宿主能量存储与代谢，这些在人体的消化吸收、免疫反应、代谢活性等方面都发挥着重要的作用。因此，本发明发明人通过对骨质疏松患者以及健康人群的肠道菌群以及基因序列进行分析，从而筛选出与骨质疏松症相关性高的生物标志物，并且利用该标志物能够准确地诊断骨质疏松或相关疾病或者预测患病风险，并且可以用于监测治疗效果。
因此，本发明的目的在于提供用于评估骨质疏松风险或者早期诊断骨质疏松的生物标志物，以及骨质疏松的诊断和患病风险评估方法，可以解决现有骨质疏松诊断方法不能做到早期预警、不能预测骨质疏松发病以及发展的趋势等缺点。从而可以应用于预测骨质疏松发病以及发展的趋势，以及应用于疾病病理分型。
据认为，由于以下原因，骨质疏松相关的生物标记物对早期诊断是有价值的。第一，本发明的标记物具有特异性和灵敏性。第二，粪便的分析保证准确性、安全性、可负担性和患者依从性。并且粪便的样本是可运输的。基于聚合酶链反应(PCR)的试验舒适且无创，所以人们会更容易参与给定的筛选程序。第三，本发明的标记物还可以用作用于对骨质疏松患者进行治疗监测的工具以检测对治疗的响应。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种生物标志物。根据本发明的实施例，该生物标志物包括选自下列中的至少一种：
多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或其类似物，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)或其类似物，Bacteroides intestinalis或其类似物，Bacteroides dorei或其类似物，瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)或其类似物，嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)或其类似物，Parabacteroides merdae或其类似物，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)或其类似物，Dialister invisus或其类似物，所述多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)类似物与多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的基因组序列相比，比对相似度在85％以上，所述单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)类似物与单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)的基因组序列相比，比对相似度在85％以上，所述Bacteroides intestinalis类似物与Bacteroidesintestinalis的基因组序列相比，比对相似度在85％以上，所述Bacteroides dorei类似物与Bacteroides dorei的基因组序列相比，比对相似度在85％以上，所述瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)类似物与瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)的基因组序列相比，比对相似度在85％以上，所述嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)类似物与嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)的基因组序列相比，比对相似度在85％以上，所述Parabacteroides merdae类似物与Parabacteroides merdae的基因组序列相比，比对相似度在85％以上，所述扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)类似物与扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)的基因组序列相比，比对相似度在85％以上，所述Dialisterinvisus类似物与Dialister invisus的基因组序列相比，比对相似度在85％以上。这些生物标志物均可以作为骨质疏松症检测的生物学标记物，可以通过确定对象肠道菌群中是否存在这些标志物中的一种或者两种或者多种，从而有效地确定检测对象是否患有或者易感骨质疏松症(即预测患有骨质疏松症的风险)，并且还可以进一步将这些生物标志物用于监控骨质疏松症患者的治疗效果。另外，当健康样本量足够多的时候，本领域技术人员还可以根据检验和计算方法，得到每个生物标志物在肠道中的正常值或者正常的范围，从而用来指示每种标志物在健康样本中的含量，由此，可以通过对样本中这些生物标志物的至少一种在肠道菌群中的含量进行检测，来确定对象是否患有或者易感骨质疏松症，同时可以用来监控骨质疏松症患者的治疗效果的效率。而且本领域技术人员可知的是，当某种未知的微生物或者某种核酸来源的某些基因序列与某种已知菌株的基因序列相比，比对相似度在85％以上的时候，即可认为该微生物与该菌株属于同一属，或者可以将基因序列归类到与该菌株同属，而同属的微生物通常具有相同或相似的功能，因此，也可以利用这些类似物作为骨质疏松症的标志物。
本发明中比对相似性，也可以称为比对相似度，是指序列比对过程中目标序列(待确定的序列)和参考序列(已知序列)之间相同碱基或氨基酸残基序列所占比例的大小。
根据本发明的实施例，所述Bacteroides intestinalis为Bacteroidesintestinalis DSM 17393，所述瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)为Ruminococcus sp.5_1_39BFAA，所述嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)为嗜粘蛋白-艾克曼菌ATCCBAA-835(Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835)，所述Parabacteroides merdae为Parabacteroides merdae ATCC 43184，所述扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)为扭链瘤胃球菌L2-14(Ruminococcus torques L2-14)，所述Dialister invisus为Dialisterinvisus DSM 15470。这些生物标志物作为相应菌种的代表菌株，均可以用来指示骨质疏松症或者骨质疏松症相关疾病的患病状态或者患病风险。
根据本发明的实施例，所述多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)类似物与多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的基因组序列相相比，比对相似度在95％以上，所述单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)类似物与单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)的基因组序列相比，比对相似度在95％以上，所述Bacteroides intestinalis类似物与Bacteroides intestinalis的基因组序列相比，比对相似度在95％以上，所述Bacteroides dorei类似物与Bacteroides dorei的基因组序列相比，比对相似度在95％以上，所述瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)类似物与瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)的基因组序列相比，比对相似度在95％以上，所述嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)类似物与嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)的基因组序列相比，比对相似度在95％以上，所述Parabacteroides merdae类似物与Parabacteroides merdae的基因组序列相比，比对相似度在95％以上，所述扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)类似物与扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)的基因组序列相比，比对相似度在95％以上，所述Dialister invisus类似物与Dialister invisus的基因组序列相比，比对相似度在95％以上。本领域技术人员可知的是，当某种未知微生物或者某种核酸来源的基因序列与某种已知菌株相比，比对相似度在95％以上的时候，即可以认为该微生物与该菌株同种，或者可以将基因序列归类到与该菌株同种。由此，本领域技术人员可以直接通过对检测对象中的核酸序列信息获取，然后将其与这些菌株的基因组序列进行比对，如有95％以上的序列相似性，则就可以作为检测对象是否患有骨质疏松症或者易感骨质疏松症的标志。
根据本发明的实施例，当所述各菌类似物与相应的菌的基因组序列相比，比对覆盖度在80％以上，且比对相似度在85％以上时，均可以认为这些类似物与相应菌属于同一属，可以作为骨质疏松症的标志物。优选地，当这些类似物与相应的菌的比对覆盖度在80％以上，且比对相似度在95％以上时，均可以认为这些类似物与相应菌同种，可以作为骨质疏松症的标志物。
本发明中比对覆盖度，指的是对目标序列与参考序列比对的过程中，目标序列中拿来和参考序列进行比对的序列的长度占检测序列总长度的比例。
根据本发明的第二方面，本发明提出了一种诊断对象是否患有骨质疏松或相关疾病或者预测对象是否患有骨质疏松或相关疾病的风险的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括步骤：(1)从所述对象中采集样本；(2)确定步骤(1)中获得的所述样本中根据本发明第一方面所述的生物标志物的相对丰度信息；(3)将步骤(2)中所述的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比较。所述方法不仅仅用于专利法意义上的疾病诊断，同时可以用作科学研究或者其他个人遗传信息的丰富以及遗传信息库的丰富等非疾病诊断。利用检测对象中的各生物标志物的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比较，来确定对象是否患有骨质疏松症或相关疾病，或者预测其患有骨质疏松症或者相关疾病的风险。
本发明中所述参考数据集指的是对已确诊为患病个体和健康个体的样本进行操作，所获得的各生物标志物的相对丰度信息，用来作为每种生物标志物的相对丰度的参考。在本发明的一个实施方案中，参考数据集是指训练数据集。根据本发明，所述训练集是指和验证集具有本领域公知的含义。在本发明的一个实施方案中，所述训练集是指包含一定样本数的骨质疏松症受试者和非骨质疏松症受试者待测样本中的各生物标志物的含量的数据集合。所述验证集是用来测试训练集性能的独立数据集合。
本发明中所述参考值指的是健康对照的参考值或正常值。本领域技术人员已知，当样本容量足够大时，可利用本领域公知的检测和计算方法获得样品中每个生物标志物的正常值(绝对值)的范围。当采用测定方法检测生物标志物的水平时，可将样品中的生物标志物水平的绝对值直接与参考值进行比较，以评估患病风险以及诊断或早期诊断骨质疏松症或相关疾病，任选地，可以包括统计方法。
本发明中所述骨质疏松症相关疾病，意指与骨质疏松症相互关联的疾病，包括可以引发骨质疏松症的前期的症状或疾病，以及由骨质疏松症引发的后续的或者并发的症状或疾病。
根据本发明的实施例，所述方法可以进一步附加如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述参考数据集包括来自多个骨质疏松患者和多个健康对照的样本中的生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据本发明第一方面所述的生物标志物。
根据本发明的实施例，在将步骤(2)中所述的相对丰度信息与参考数据集进行比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以获得患病概率。利用多元统计模型可以实现快速高效检测。
根据本发明的实施例，所述多元统计模型为随机森林模型。
根据本发明的实施例，所述患病概率大于阈值表明所述对象患有骨质疏松或相关疾病或者有患有骨质疏松或相关疾病的风险。
根据本发明的实施例，所述阈值为0.5。
根据本发明的实施例，当与参考值比较时，所述嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)或其类似物、Parabacteroides merdae或其类似物、Dialister invisus或其类似物的减少表明所述对象患有骨质疏松或相关疾病或者处于患有骨质疏松或相关疾病的风险中；所述多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或其类似物、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)或其类似物、Bacteroides intestinalis或其类似物、Bacteroides dorei或其类似物、瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)或其类似物、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)或其类似物的增加表明所述对象患有骨质疏松或相关疾病或者处于患有骨质疏松或相关疾病的风险中。
根据本发明的实施例，步骤(2)中所述生物标志物的相对丰度信息是利用测序方法得到的，进一步包括：从所述对象的所述样本中分离得到核酸样本，基于所获得的所述核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果，以及基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度信息。根据本发明的一种实施例，可以利用SOAP2和MAQ的至少一种将测序结果与参考基因集进行比对，由此，可以提高比对的效率，进而可以提高骨质疏松症检测的效率。根据本发明的实施例，可以同时对多种(至少两种)生物标志物进行检测，可以提高骨质疏松症检测的效率。
根据本发明的实施例，所述参考基因集包括从多个骨质疏松患者和多个健康对照的样本中进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集。本发明中的参考基因集可以是已有的基因集，如现有的已经公开的肠道微生物参考基因集；也可以是将多个骨质疏松症患者和多个健康对照的样品进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集，由此获得的参考基因集信息更全面，检测结果更可靠。
本发明中所述非冗余基因集作本领域技术人员通常的理解来解释，简单来说是去除冗余基因后的剩余基因的集合。冗余基因通常指的是一条染色体上出现的一个基因的多个复份。
根据本发明的实施例，所述样本为粪便样本。
根据本发明的实施例，所述测序方法是通过第二代测序方法或第三代测序方法进行的。进行测序的手段并不受特别限制，通过二代或者三代测序的方法进行测序，可以实现快速高效的测序。
根据本发明的实施例，所述测序方法是通过选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种进行的。由此，能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，从而有利于对后续测序数据进行分析，尤其是进行统计学检验时的精确性和准确度。
根据本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂盒，包括用于检测生物标志物的试剂，所述生物标志物包括根据本发明的第一方面的生物标志物。利用该试剂盒，可以确定这些标志物在肠道菌群中的相对丰度，由此，可以通过所得到的相对丰度值，从而确定对象是否患有或者易感骨质疏松症，以及用于监控骨质疏松症患者的治疗效果。
根据本发明的实施例，所述试剂盒包括一组参考数据集或者参考值，用来作为每种生物标志物的相对丰度的参考。优选可以将参考数据集或者参考值附在物理载体上，例如光盘，如CD-ROM等。
根据本发明的实施例，所述试剂盒还包括第一计算机程序产品，该第一计算机程序产品用来执行获得所述的参考数据集或者参考值。即该第一计算机程序产品用来执行获得诊断对象是否患有骨质疏松或相关疾病或者预测对象是否患有骨质疏松或相关疾病的一组参考数据集或者参考值。
根据本发明的实施例，所述试剂盒还包括第二计算机程序产品，该第二计算机程序产品还可以用来执行根据本发明第二方面所述的诊断对象是否患有骨质疏松或相关疾病或者预测对象是否患有骨质疏松或相关疾病的风险的方法。
根据本发明的第四方面，本发明提出了生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断对象是否患有骨质疏松或相关疾病或者预测对象是否患有骨质疏松或相关疾病的风险。
根据本发明的实施例，所述诊断或预测包括以下步骤：1)从所述对象中采集样本；2)确定步骤1)中获得的所述样本中的生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据本发明第一方面所述的生物标志物；3)将步骤2)中所述的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比较。根据所述的试剂盒，可以确定这些标志物在肠道菌群中的相对丰度，由此可以通过所得到的相对丰度值，从而确定对象是否患有或者易感骨质疏松症，以及用于监控骨质疏松症患者的治疗效果的效率。
根据发明的实施例，以上生物标志物在制备试剂盒中的用途，可以进一步附加如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述参考数据集包括来自多个骨质疏松患者和多个健康对照的样本中的生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据本发明的第一方面的所述生物标志物。
根据本发明的实施例，在将步骤2)中所述的相对丰度信息与参考数据集进行比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以获得患病概率；优选地，所述多元统计模型为随机森林模型。
根据本发明的实施例，所述患病概率大于阈值表明所述对象患有骨质疏松或相关疾病或者有患有骨质疏松或相关疾病的风险；优选地，所述阈值为0.5。
根据本发明的实施例，当与参考值比较时，所述嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)或其类似物、Parabacteroides merdae或其类似物、Dialister invisus或其类似物的减少表明所述对象患有骨质疏松或相关疾病或者处于患有骨质疏松或相关疾病的风险中；所述多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或其类似物、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)或其类似物、Bacteroides intestinalis或其类似物、Bacteroides dorei或其类似物、瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)或其类似物、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)或其类似物的增加表明所述对象患有骨质疏松或相关疾病或者处于患有骨质疏松或相关疾病的风险中。
根据本发明的实施例，通过测序方法得到步骤2)中所述生物标志物的相对丰度信息，进一步包括：从所述对象的所述样本中分离得到核酸样本，基于所获得的所述核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果，以及基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度信息。
根据本发明的实施例，所述参考基因集包括从多个骨质疏松患者和多个健康对照的样本中进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集。
根据本发明的实施例，所述样本为粪便样本。
根据本发明的实施例，所述测序方法是通过第二代测序方法或第三代测序方法进行的。
根据本发明的实施例，所述测序方法是通过选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种进行的。
根据本发明的第五方面，本发明提出了一种生物标志物作为靶点用于筛选治疗或者预防骨质疏松或相关疾病的药物的用途。根据本发明的实施例，所述生物标志物包括根据本发明的第一方面的生物标志物。根据本发明的实施例，可以利用候选药物使用前和使用后对这些生物标志物的影响，从而确定候选药物是否可以用于治疗或预防骨质疏松症。
根据本发明的第六方面，本发明提出了一种生物标志物在诊断对象是否患有骨质疏松症或相关疾病或者预测对象是否患有骨质疏松或相关疾病的风险中的用途。根据本发明的实施例，所述生物标志物包括根据本发明第一方面的生物标志物。
根据本发明的第七方面，本发明提出了一种药物，所述药物用于预防或治疗骨质疏松或相关疾病。根据本发明的实施例，所述药物能够使得检测对象中嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)或其类似物、Parabacteroides merdae或其类似物、Dialister invisus或其类似物的相对丰度值增加；或者所述药物能够使得多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或其类似物、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)或其类似物、Bacteroides intestinalis或其类似物、Bacteroides dorei或其类似物、瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)或其类似物、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)或其类似物的相对丰度值减少。
本发明所取得的有益效果为：粪便是人体的代谢产物，其内不仅包含人体的代谢产物，还包括对我们的机体代谢和免疫以及机体其他功能的变化密切相关的肠道微生物，对粪便进行研究，发现在骨质疏松症患者和健康人群的肠道菌群的组成上存在明显的差异，可以准确地对骨质疏松症患者进行患病风险评估、早期诊断。本发明通过对骨质疏松症患者和健康人群的肠道菌群的比较和分析，得到多种相关的肠道菌株，结合高质量的骨质疏松症人群和非骨质疏松症人群MLGs作为训练集，能够准确地对骨质疏松症患者进行患病风险评估、早期诊断。该方法与目前常用的诊断方法相比，具有方便、快捷的特点。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1示出了根据本发明的一个实施例在基因水平上骨质疏松患者和健康对照的数量差异图，可以看出骨质疏松组和健康人组的肠道菌群组成存在差异情况。
图2示出了根据本发明的一个实施例随机森林分类器中5次10折交叉验证的错误率分布情况图。
图3示出了根据本发明的一个实施例基于随机森林模型(9个肠道标志物)判别骨质疏松和健康对照组成的训练集的接收者操作曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)。
图4示出了根据本发明的一个实施例基于随机森林模型(9个肠道标志物)，由健康对照和骨质疏松(健康：7和患病：7)组成的验证集的接收者操作曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)。
图5示出了根据本发明的一个实施例中确定对象是否患有骨质疏松症或相关疾病或者预测对象是否患有骨质疏松症或相关疾病的设备的结构示意图，其中图a为所述设备的示意图，图b为设备中的生物标志物相对丰度确定装置的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，本发明中所提供的术语的解释仅为了使本领域技术人员更好地理解本发明，并非对本发明限制。
针对现有骨质疏松诊断方法不能做到早期预警、不能预测骨质疏松发病以及发展的趋势等缺点，本发明提出一种用于评估骨质疏松症风险或者早期诊断骨质疏松症的生物标志物，以及骨质疏松症的诊断和患病风险评估方法，能预测骨质疏松发病以及发展的趋势，应用于疾病病理分型。
生物标志物
根据本发明的第一方面，本发明提出了用于骨质疏松症的生物标志物。
本发明所用术语具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：
根据本发明，术语“骨质疏松”，是一种因骨质密度下降，而骨折风险提高的疾病。骨质疏松可以经由临床诊断，也可以参考世界卫生组织(WHO)推荐的诊断标准，即基于DXA测定骨密度通常用T-Score(T值)表示，T值＝(测定值-同性别同种族正常成人骨峰值)/正常成人骨密度标准差，例如当T值≤-2.5时，可以认为患有骨质疏松症。
根据本发明，生物标志物质的水平通过相对丰度指示。
根据本发明，术语“生物标志物”，也称为“生物学标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的生物标记物可以是在个体中的任何物质，只要它们与被检个体的特定生物状态(例如，疾病)有关系，例如，核酸标志物(也可以称为基因标志物，例如DNA)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(KO/OG标记)等。其中，核酸标志物的含义并不局限于现有可以表达为具有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为DNA，也可以为RNA，可以是经过修饰的DNA或者RNA，也可以是未经修饰的DNA或者RNA或其组合。在本文中核酸标志物有时也可以称为特征片段。在本发明中，生物标志物也可以用“肠道标志物”来替代，因为本发明所发现的与骨质疏松症密切相关的几种生物标志物均存在于受试者的肠道内。生物标记物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。
根据本发明的实施例，可以运用高通量测序，批量分析健康人群和骨质疏松症患者的粪便样本。基于高通量测序数据，对健康人群与骨质疏松症患者群进行比对，从而确定与骨质疏松症患者群相关的特异性核酸序列。简言之，其步骤如下：
样品的收集与处理：收集健康人群与骨质疏松症患者群的粪便样本，使用试剂盒进行DNA提取，得到核酸样本；
文库构建和测序：DNA文库构建和测序是利用高通量测序进行，以便得到粪便样品中所包含肠道微生物的核酸序列；
通过生物信息学的分析方法，确定与骨质疏松症患者相关的特异性肠道微生物核酸序列。首先，将测序序列(reads)与参照基因集(也称为参考基因集，可以为新构建的基因集或任何已知序列的数据库，例如，采用已知的人肠道微生物群落非冗余基因集)进行比对。接下来，基于比对结果，分别确定来自健康人群和骨质疏松症患者群粪便样品的核酸样本中各基因的相对丰度。通过将测序序列与参照基因集进行比对，可以将测序序列与参照基因集中的基因建立对应关系，从而针对核酸样本中的特定基因，与其相对应的测序序列的数目可以有效地反映该基因的相对丰度。由此，可以通过比对结果，按照常规的统计分析，确定在核酸样本中基因的相对丰度。最后，在确定核酸样本中各基因的相对丰度后，对来自健康人群和骨质疏松症患者群粪便的核酸样本中各基因的相对丰度进行统计检验，由此，可以判断在健康人群和骨质疏松症患者人群中是否存在相对丰度有显著差异的基因，如果存在基因是显著差异的，则该基因被当作是异常状态的生物标志物，即核酸标志物。
另外，对于已知或新构建的参照基因集，其通常包含基因物种信息和功能注释，由此，在确定基因相对丰度的基础上，可以进一步通过将基因的物种信息和功能注释进行分类，从而确定肠道菌群中各微生物的物种相对丰度和功能相对丰度，也就可以进一步确定异常状态的物种标志物和功能标志物。简言之，确定物种标志物和功能标志物的方法进一步包括：将健康人群和骨质疏松症患者群的测序序列与参照基因集进行比对；基于比对结果，分别确定健康人群和的骨质疏松症病患者群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度；对来自健康人群和骨质疏松症病人群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度进行统计学检验；以及分别确定在健康人群和骨质疏松症病患者群的核酸样本之间相对丰度存在显著差异的物种标志物和功能标志物。根据本发明的实施例，可以采用对来自相同物种的基因的相对丰度和具有相同功能注释的基因的相对丰度进行统计检验，例如加和、取平均值、中位数值等，来确定功能相对丰度和物种相对丰度。
最后，确定了在健康人群和骨质疏松症患者群的粪便样品之间相对丰度存在显著差异的生物学标志物，即包括微生物物种：多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或其类似物，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)或其类似物，Bacteroidesintestinalis或其类似物，Bacteroides dorei或其类似物，瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)或其类似物，嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)或其类似物，Parabacteroides merdae或其类似物，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)或其类似物，Dialister invisus或其类似物。由此，通过检测上述微生物至少一种是否存在，来有效地确定对象是否患有或者易感骨质疏松症病，并且可以用于监控骨质疏松症病患者的治疗效果。在本文中所使用的术语“存在”应做广义理解，既可以指的是定性分析样本中是否含有相应的目标物，也可以指对样本中的目标物进行定量分析，并且还可以进一步将所得到的定量分析结果与参照(例如通过对具有已知状态的样本进行平行试验所得到的定量分析结果)进行统计学分析或者任何已知数学运算所得到的结果。本领域技术人员可以根据需要和试验条件进行容易的选择。根据本发明的实施例，还可以通过确定这些微生物在肠道菌群中的相对丰度，从而能够确定对象是否患有或者易感骨质疏松症病，以及用于监控骨质疏松症患者的治疗效果。
可以通过检测对象肠道菌群中是否存在上述微生物物种中的至少一种，也可以是检测对象肠道菌群中是否存在上述中的两种或者多种，即是否存在上述生物标志物组合，从而来有效地确定对象是否患有或者易感骨质疏松症，并且可以用于监控骨质疏松症患者的治疗效果。在本文中，术语“生物标志物组合”是指两个或者更多个生物标记物组成的组合。
对于物种标志物和功能标志物本领域技术人员还可以通过常规的菌种鉴别手段和生物活性检验手段来确定在肠道菌群中是否存在所述物种和功能。例如，菌种鉴别可以通过进行16s rRNA进行。
根据本发明的一种具体实施方式，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用来诊断是否患有骨质疏松症或相关疾病或者预测是否患有骨质疏松症或相关疾病的风险，所述试剂用来检测本发明的生物标志物。
检测对象是否患有骨质疏松症或相关疾病或者预测对象是否患有骨质疏松症或相关疾病的设备
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种检测对象中是否患有骨质疏松症或相关疾病或者预测对象是否患有骨质疏松症或相关疾病的设备，如图5所示。根据本发明的实施例，所述设备包括样本采集装置100、生物标志物相对丰度确定装置200以及患病概率确定装置300(如图5中a所示)。其中，样本采集装置适于从所述对象中采集样本；生物标志物相对丰度确定装置与所述样本采集装置相连，其适于确定所获得的样本中的生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据本发明的第一方面的生物标志物；所述患病概率确定装置与所述生物标志物相对丰度确定装置相连，所述患病概率确定装置用于将相对丰度确定装置中获得的生物标志物的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比对。
根据本发明的一种具体实施方式，所述参考数据集包括来自多个骨质疏松症患者和多个健康对照的样本中的根据本发明的第一方面的生物标志物的相对丰度信息。
根据本发明的一种具体实施方式，所述患病概率确定装置中还包括执行多元统计模型以获得患病概率；优选地，所述多元统计模型为随机森林模型。根据本发明的一种优选实施方式，所述患病概率大于阈值表明所述对象患有骨质疏松症或相关疾病或者有患有骨质疏松症或相关疾病的风险；优选地，所述阈值为0.5。根据本发明的一种优选实施方式，当与参考值进行比较时，所述嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)或其类似物、Parabacteroides merdae或其类似物、Dialister invisus或其类似物的减少表明所述对象患有骨质疏松症或相关疾病或者处于患有骨质疏松症或相关疾病的风险中，所述多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)或其类似物、单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)或其类似物、Bacteroides intestinalis或其类似物、Bacteroides dorei或其类似物、瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)或其类似物、扭链瘤胃球菌L2-14(Ruminococcustorques L2-14)或其类似物的增加表明所述对象患有骨质疏松症或相关疾病或者处于患有骨质疏松症或相关疾病的风险中。
根据本发明的一种具体实施方式，所述生物标志物相对丰度确定装置进一步包括：核酸样本分离单元210、测序单元220以及比对单元230(如图5中b所示)。根据本发明的实施例，核酸样本分离单元适于从所述对象的所述样本中分离得到核酸样本，测序单元与核酸样本分离单元相连，并且基于所获得的核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果，比对单元与测序单元相连，并且基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度信息。
根据本发明的一种具体实施方式，所述参考基因集包括从多个骨质疏松患者和多个健康对照的样本中进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集。
根据本发明的实施例，测序单元并不受特别限制。优选地，所述测序单元利用第二代测序方法或第三代测序方法进行。优选地，所述测序单元为选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种。由此，能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，从而有利于对后续测序数据进行分析，尤其是进行统计学检验时的精确性和准确度。
根据本发明的一个实施例，所述比对单元利用选自SOAP2和MAQ的至少一种进行所述比对。由此，可以提高比对的效率，进而可以提高检测骨质疏松症的效率。
另外，根据本发明的实施例，本发明还提出了一种药物筛选方法。由此，根据本发明实施例，骨质疏松症密切相关的标志物作为药物设计靶点来进行药物的筛选，促进新的治疗骨质疏松症病的药物的发现。例如，可以通过检测与候选药物接触前后，生物标志物水平的变化，来确定候选药物是否可以作为治疗或预防骨质疏松症病的药物。例如，检测有害生物标志物水平在接触药物候选物之后是否有所降低，有益生物标志物水平在接触药物候选物之后是否有所升高。另外，还可以通过确定药物对生物标志物的至少一种的生物活性的直接影响或间接影响来对候选化合物是否可以作为治疗或预防骨质疏松症的药物来进行筛选。由此，根据本发明的实施例，本发明还提出了根据骨质疏松症的生物标志物在筛选治疗或预防骨质疏松症的药物中的用途。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
本发明采用宏基因组关联分析(MWAS)的分析方法，经测序分析粪便样本的菌群组成，功能差异；用随机森林判别模型判别骨质疏松群体和非骨质疏松群体，获得患病概率，用于骨质疏松的患病风险评估、诊断、早期诊断或，寻找潜在药物靶点。
根据本发明，术语“MLG”是指操作分类单元(Metagenomic Linkage Group)(QinJ,Li Y,Cai Z,et al.A metagenome-wide association study of gut microbiota intype 2diabetes[J].Nature,2012,490(7418):55-60.)，是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系，种，属，分组等)设置的同一标志。通常按照相似性阈值将序列划分为不同的MLG，每一个MLG通常被视为一个微生物物种。若一个MLG中有超过50％的序列以95％的碱基相似性比对上已知微生物物种，则认为MLG为此已知物种；若一个MLG中有超过50％的序列以85％的碱基相似性比对上已知微生物属水平，则认为MLG为此已知物种属水平注释。
根据本发明，术语“个体”指动物，特别是哺乳动物，如灵长类动物，最好是人。
根据本发明，术语如“一”、“一个”和“这”不仅指单数的个体，而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。
在本发明中，所述的测序(二代测序)和MWAS具有本领域公知，本领域技术人员可以根据具体情况进行调整。根据本发明的实施例，可以根据文献(Wang,Jun,and HuijueJia."Metagenome-wide association studies:fine-mining the microbiome."NatureReviews Microbiology14.8(2016):508-522.)中记载的方法进行。
在本发明中，随机森林模型和ROC曲线的使用方法为本领域所公知，本领域技术人员可以根据具体情况进行参数设置和调整。根据本发明的实施例，可以根据文献(DroganD,Dunn WB,Lin W,Buijsse B,Schulze MB,Langenberg C,Brown M,Floegel a.,DietrichS,Rolandsson O,Wedge DC,Goodacre R,Forouhi NG,Sharp SJ,Spranger J,Wareham NJ,Boeing H:Untargeted Metabolic Profiling Identifies Altered Serum Metabolitesof Type 2-Diabetes Mellitus in a Prospective,Nested Case Control Study.ClinChem 2015,61:487-497.；Mihalik SJ,Michaliszyn SF,de las Heras J,Bacha F,Lee S,Chace DH,DeJesus VR,Vockley J,Arslanian SA:Metabolomic profiling of fattyacid and amino acid metabolism in youth with obesity and type 2diabetes:evidence for enhanced mitochondrial oxidation.Diabetes Care 2012,35:605-611.，通过引用全文并入此处)，中记载的方法进行。
在本发明中，构建了骨质疏松受试者和非骨质疏松受试者的生物标志物的训练集，并以此为基准，对待测样本的生物标志物含量值进行评估。
在本发明中，非骨质疏松受试者为精神状态良好的受试者。
在本发明中，所述受试者可以为人或者模型动物。
本领域技术人员知晓，当进一步扩大样本量时，利用本领域公知的样本检测和计算方法，可以得出每种生物标志物在样本中的正常含量值区间(绝对数值)。可以将检测得到的生物标志物含量的绝对值与正常含量值进行比较，任选地，还可以结合统计学方法，以得出骨质疏松患病风险评价、诊断等。
不希望受任何理论的限制，发明人指出这些生物标志物是存在于人体中的肠道菌群。通过本发明所述的方法对受试者肠道菌群进行关联分析，得到骨质疏松群体的所述生物标志物在菌群检测中表现出一定的含量范围值。
实施例1
1.1样本收集：
参照文献A metagenome-wide association study of gut microbiota in type2diabetes(Qin,J.et al..Nature 490,55–60(2012))记载的方法，采集粪便样品后冷冻运输并迅速转移到-80℃保存，进行DNA提取，得到提取的DNA样本。
1.2宏基因组测序与筛选
利用所提取的DNA样本构建测序文库，在Illumina HiSeq2000测序平台上进行单向(Single-end)宏基因组测序(读长100bp)。对测序产生的数据进行过滤(quality-controlled，去除adapter污染序列、去低质量序列和去宿主基因组污染序列)。
1.3基因集比对
将上述“1.2宏基因组测序与筛选”后的高质量测序片段(reads)与肠道参考基因集进行比对，从而得到基因的相对丰度(参考文献Qin,J.et al.2012)。
1.4物种分类注释与丰度计算
通过与IMG(v400)数据库进行比对，参考文献A metagenome-wide associationstudy of gut microbiota in type 2diabetes(Qin,J.et al.Nature 490,55–60(2012))记载的方法，对对预测的基因进行物种分类。对于门水平的物种分类，比对的相似度在65％以上，比对覆盖度在70％以上作为门水平的物种分类的临界值。对于属水平的物种分类，比对的相似度在85％以上作为属水平的分类的临界值。对于比对的相似性在95％以上作为种、株水平的物种分类的临界值。
然后参照文献A metagenome-wide association study of gut microbiota intype 2diabetes(Qin,J.et al.Nature 490,55–60(2012))中记载的方法，利用基因的相对丰度计算该物种的相对丰度，并用秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)进行统计检验(p<0.05)，确定病例与对照之间的相对丰度存在显著差异的物种。
1.5生物标志物丰度计算
根据基因丰度对基因进行聚类(参考文献Qin,J.et al.A metagenome-wideassociation study of gut microbiota in type 2diabetes.Nature 490,55–60(2012).)，选取聚类基因数大于50的MLGs进行物种注释；并取对应基因丰度中位数的办法，得到对应MLGs的丰度，并计算病例与对照之间的相对丰度存在显著差异的MLGs。
1.6利用随机森林(ROC/AUC)筛选骨质疏松发生发展的潜在生物标志物
为进一步筛选潜在疾病肠道生物标志物，本实施例构建了骨质疏松症受试者和非骨质疏松症受试者的生物标志物的训练集，并以此为基准，对待测样本的生物标志物含量值进行评估。其中，在本发明中，所述训练集和所述验证集具有本领域公知的含义。在本发明的实施方案中，训练集是指包含一定样本数的骨质疏松症受试者和非骨质疏松症受试者待测样本中的各生物标志物的含量的数据集合。验证集是用来测试训练集性能的独立数据集合。其中，非骨质疏松症受试者为精神状态良好的受试者，受试者可以为人或者模型动物，在本实施例中是以人为受试者进行实验的。
具体包括如下步骤：
本发明从91个样品(健康人：47和骨质疏松病人：44人)中，随机地从44个患病样本中选取37个样品，随机地从47个正常样本中抽取40正常样本，然后组成77个样本(37个骨质疏松和40个正常人)作为训练集(表1)，其余样品作为验证集(包括7个骨质疏松病人和7个正常人)。
1.6.1利用训练集数据验证筛选得到的生物标志物
首先，按照1.4-1.5描述的方法计算训练集中每个样本的相对丰度。然后将训练集基因数量大于50的MLG输入随机森林(randomForest 4.6-12in R 3.2.5,RF)分类器。对分类器进行5次10折交叉验证，10次重复，利用RF模型筛选的MLG相对丰度对每一个体计算其骨质疏松患病风险(图2)，并绘制受试者操作特征(receiver operation characteristic，ROC)曲线，并计算出曲线下面积(AUC)作为判别模型效能评价参数。选取标志物组合数＜30，且判别效能最佳的组合为本发明组合。在模型中输出每个MLG的选择频率，频率越高，代表该标志物用来判别骨质疏松和非骨质疏松的重要性越高。
结果显示，本发明所得RF分类器包含了9个代谢物(即9个生物标志物)，这9个生物标志物对应的相对丰度如表1所示，其详细信息如表2所示。图2示出了随机森林分类器中5次10折交叉验证的错误率分布情况。图2中黑色粗曲线代表5次试验，10次重复的平均值，竖线代表所选最佳组合中MLG数目。图3示出了基于随机森林模型(9个生物标志物)判断骨质疏松症患者和健康对照，训练集的接收者操作曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)，其中特异性表征的是对不患病判对的概率，敏感性指的是对于患病判对的概率，其中对训练集样本的判别效能为：AUC＝95.92％，95％置信区间CI＝86.4％-100％(图3)，结果表明该模型所得代谢物组合可作为区分骨质疏松与非骨质疏松的潜在生物标志物。
其中，表3中，每种标志物基因集大小代表的是每种标志物中包括的核酸序列的个数；标志物基因集注释数代表的是：代表其中有多少基因注释到这个标志物上，标志物最优注释表征的是根据每种标志物包括的所有基因集与IMG(v400)数据库进行比对，得到的相应的物种分类；最优注释基因比例表征的是：这个基因簇里面有多少比例的基因注释到那个物种；最优注释相似度表征的是：这些基因簇里注释到这个物种，所有基因的注释准确度的均值作为该标志物的最优注释相似度；富集方向代表的是，每种生物标志物在骨质疏松症患者和健康对照中的相对丰度的变化，其中OS<＝H代表的是该生物标志物在骨质疏松症患者中的相对丰度小于在健康对照中的相对丰度，H<＝OS代表的是该生物标志物在骨质疏松症患者中的相对丰度大于在健康对照中的相对丰度；筛选频率代表的是：进行5折10次交叉验证，该生物标志物被选择的频率；验证集AUC代表的是：代表在训练集数据得到模型下，对验证集数据的判别程度；95％置信区间(95％CI)在a到b之间，代表的是对于给出的每种生物标志物，有相应的95％的概率可以说样本介于给出的a到b之间，发生错误的概率为5％。
从表3可以看出，富集方向一栏中相比较于健康对照，骨质疏松患者在嗜粘蛋白-艾克曼菌ATCC BAA-835(Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835)、Parabacteroidesmerdae ATCC 43184、Dialister invisus DSM 15470均表现为相对丰度减少，在多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、Bacteroides intestinalis DSM 17393、Bacteroides dorei、瘤胃球菌sp.5_1_39BFAA(Ruminococcus sp.sp.5_1_39BFAA)、扭链瘤胃球菌L2-14(Ruminococcus torques L2-14)均表现为相对丰度增加。
1.6.2利用验证集数据验证筛选得到的生物标志物
本发明，随即使用独立人群对该模型进行验证，患病概率(RP)≥0.5预测个体具有骨质疏松患疾病风险或者患有骨质疏松。首先，按照1.4-1.5描述的方法计算验证集中每个样本中各生物标志物的相对丰度。然后按照1.6.1的方法利用随机森林模型对验证集数据进行验证。
基于该模型：
图4示出了基于随机森林模型(9个生物标志物)判断骨质疏松症患者和健康对照，验证集的接收者操作曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)。其中，基于9个标记物，对独立验证集(骨质疏松＝7和健人对照＝7)，模型的判别AUC＝94.33％(95％CI＝87.13％-99.4％)(图4，表3、表4-1、表4-2、表5)；基于Ruminococcus sp.5_1_39BFAA，验证集曲线下面积为0.9082，特异性高。
在3.2.5版本R中使用“randomForest 4.6-12package”进行随机森林模型分类和回归。输入包括训练集数据(即训练样本中选定的MLGs标记物的相对丰度，见表1)，样本疾病状态(训练样本的样本疾病状态为矢量，‘1’代表骨质疏松，‘0’代表健康人)，以及一个验证集(验证集中所选MLGs标记物的相对丰度，见表4-1、4-2)。然后，发明人利用R软件中随机森林包的随机森林函数建立分类和预测函数对验证集数据进行预测，输出即为预测结果(患病概率)；阈值为0.5，如果疾病的概率≥0.5，则认为有患骨质疏松的风险或者患有骨质疏松。
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表5：随机森林模型(分别基于9个肠道标志物、Ruminococcus sp.5_1_39BFAA)预测骨质疏松和健康对照的样品患有骨质疏松的风险或患有骨质疏松的概率(患病概率>＝0.5确认个体具有患骨质疏松的风险或者患有骨质疏松。)
以上结果表明，本发明公开的生物标志物具有较高的准确度和特异性，具有良好的开发为诊断方法的前景，从而为骨质疏松的患病风险评估、诊断、早期诊断，寻找潜在药物靶点提供依据。
在本发明中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可以是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (12)
1.一种骨质疏松生物标志物，其特征在于，包括：
多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)，单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)，Bacteroides intestinalis，Bacteroides dorei，瘤胃球菌(Ruminococcussp.)，嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)，Parabacteroides merdae，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)和Dialister invisus。
2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述Bacteroides intestinalis为Bacteroides intestinalis DSM 17393，所述瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)为瘤胃球菌5_1_39BFAA(Ruminococcus sp.5_1_39BFAA)，所述嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)为嗜粘蛋白-艾克曼菌ATCC BAA-835(Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835)，所述Parabacteroides merdae为Parabacteroides merdae ATCC 43184，所述扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)为扭链瘤胃球菌L2-14(Ruminococcus torques L2-14)，所述Dialister invisus为Dialister invisus DSM 15470。
3.权利要求1或2所述的生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断对象是否患有骨质疏松。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述诊断包括如下步骤：
1)从所述对象中采集样本；
2)确定步骤1)中获得的所述样本中根据权利要求1或2所述的生物标志物的相对丰度信息；
3)将步骤2)中所述的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比较。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述参考数据集包括来自多个骨质疏松患者和多个健康对照的样本中的生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据权利要求1或2所述的生物标志物。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，在将步骤2)中所述的相对丰度信息与参考数据集进行比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以获得患病概率。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述多元统计模型为随机森林模型。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述患病概率大于阈值表明所述对象患有骨质疏松。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述阈值为0.5。
10.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，当与参考值比较时，所述嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)、Parabacteroides merdae、Dialister invisus的减少表明所述对象患有骨质疏松或相关疾病；所述多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、Bacteroides intestinalis、Bacteroides dorei、瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcustorques)的增加表明所述对象患有骨质疏松。
11.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，通过测序方法得到步骤2)中所述生物标志物的相对丰度信息，进一步包括：
从所述对象的所述样本中分离得到核酸样本，
基于所获得的所述核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果，
以及基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度信息。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述参考基因集包括从多个骨质疏松患者和多个健康对照的样本中进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| 肠道微生态失衡为骨质疏松症发病的易感因素;董万涛;黄凯;宋敏;侯红燕;宋志靖;周灵通;刘小钰;蒋林博;;中国骨质疏松杂志(第03期);第119-123页 * |
Also Published As
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