CN113391007A - 一种肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，包括对肌炎患者的粪便样本进行16s rRNA测序、对肌炎患者的血清样本进行LC‑MS/MS分析以及对肌炎患者的血清样本进行ELISA分析，ELISA分析包括检测血液中的炎症因子水平，然后利用Bio‑Tek酶标仪读取OD值，根据标准曲线计算浓度，再采用SOD和MDA试剂盒分析肌炎患者氧化应激指标SOD和MDA的变化。解决目前肌炎的肠道菌落和血清分析不完善的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法。
背景技术
特发性炎性肌病（IIMs），又称肌炎，是一组异质性自身免疫性疾病，其发病机制尚不清楚，主要分为皮肌炎（DM）、多发性肌炎（PM）、多发性肌炎（PM）、坏死性肌病（NM）和包涵体肌炎（IBM），肌炎的特征是肌肉无力、皮肤病和脏器受累，其中，肺受累是肌炎最常见的特征之一。肌炎表现出不同的临床和生化特征，对治疗和预后的反应差异很大，自身免疫在肌炎的发病机制中发挥作用，以细胞内重要蛋白为靶点的肌炎特异性自身抗体（myositisspecific autoantibody, MSA）被认为是诊断的关键生物标志物。肌炎受多种机制调控，但肌炎的具体机制尚未完全阐明，识别可靠的生物标记物对肌炎的早期诊断是设计这种疾病的特定治疗方法的关键。
炎症在肌炎中起着重要作用，血清中IFN-γ、IL-1β、IL-12、和il - 6在DM患者已报告迅速发展间质性肺疾病。封锁il - 1和il - 6封锁可以改善慢性炎性改变肌肉组织的肌炎患者,它也被报道,IL-35是肌肉组织和血清中肌炎的炎症浸润氧化应激与机体功能下降、肌肉疲劳、肌肉损伤、此前有报道称，肌肉老化和氧化应激是导致体内肌炎特异性肌纤维破坏的重要促成因素。在实验性自身免疫性肌炎中，还有人使用3- n -丁苯酞增加SOD和过氧化氢酶的活性，降低MDA的活性。这些研究表明炎症和氧化应激标志物可作为肌炎的间接标志物。
肠道微生物群正在成为管理或预防人类炎症和代谢紊乱的一个有希望的目标。新发现的证据表明，肠道微生物群及其代谢物的组成改变，通过破坏的肠道屏障从肠道，影响各种代谢器官，导致代谢性炎症。肠道菌群的潜在机制通常被认为涉及免疫调节、宿主能量代谢和氧化应激。肠道内稳态的改变，作为黏膜炎症的早期启动事件，促进了系统性炎症放大的不良后果，特别是在脂肪和肌肉组织。有研究报道，代谢异常可能导致肌肉损伤。然而，肌炎患者的肠道菌群尚未得到系统的研究。
因此需要一种肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，来填补肌炎在肠道菌群和血清代谢物上研究的空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，解决目前肌炎的肠道菌落和血清分析不完善的问题。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，包括对肌炎患者的粪便样本进行16s rRNA测序、对肌炎患者的血清样本进行LC-MS/MS分析以及对肌炎患者的血清样本进行ELISA分析，所述ELISA分析包括检测血液中的炎症因子水平，然后利用Bio-Tek酶标仪读取OD值，根据标准曲线计算浓度，再采用SOD和MDA试剂盒分析肌炎患者氧化应激指标SOD和MDA的变化。
进一步的技术方案是，所述16s rRNA测序包括如下步骤：
S101、采集粪便样本，使用Illumina NovaSeq PE250进行16S rRNA基因扩增测序，获得原始序列数据；
S102、将获得的原始序列数据采用qiime2和4.0.2的R软件进行分析，获得用于质量控制的Raw Data；
S103、与肠道菌群数据库进行对比分析，分析粪便样本中的肠道菌群组成。
更进一步的技术方案是，所述LC-MS/MS分析为采集血液后在离心机上以3000 rpm离心10 min得到血清样本，采用UHPLC系统联合TripleTOF 6600和Waters HSS T3柱进行LC-MS/MS分析。
更进一步的技术方案是，在LC-MS/MS分析过程中，流动相包括水和乙腈，流速为0.3ml/min，样品板的温度为4℃，柱温为40℃。
更进一步的技术方案是，在LC-MS/MS分析过程中，洗脱梯度为初始流动相，乙腈含量95%；7 min，乙腈含量65%；1 min，乙腈含量95%；12min，乙腈含量95% ，流速0.5 mL/min；其中进样量为3μL。
更进一步的技术方案是，在LC-MS/MS分析过程中，ESI源条件设置为:第一离子源气体：55psi、第二离子源气体：55psi、幕帘气体：35psi、温度：550℃；正离子模式中：DP：80v、CE：10v、TOF：60-1000 m/z，喷雾电压：5500V；负离子模式中：DP：-80v、CE：-10v、TOF：60-1000 m/z，喷雾电压：-4500V。
更进一步的技术方案是，在LC-MS/MS分析后，利用ProteoWizard将原始数据转换为mzXML格式，并使用R开发的基于XCMS的内部程序进行处理，用于峰值检测、提取、对齐和集成；然后将MS2数据库应用于代谢物注释，其中注释的阈值设置为0.3。
更进一步的技术方案是，所述ELISA分析包括利用IL-4试剂盒、IL-10试剂盒和TNF-α试剂盒检测血液中的炎症因子水平，然后利用Bio-Tek酶标仪读取OD值，根据标准曲线计算IL-4、IL-10、TNF-α的浓度，再采用SOD和MDA试剂盒分析肌炎患者氧化应激指标SOD和MDA的变化。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过本方法填补了肌炎患者在肠道菌群和血清代谢物的分析上面的空白，在肌炎的研究方面取得了重大的进步，具有长足且深远的意义；对于肌炎患者微生物结构变化引起的菌群差异以及血清代谢物的功能代谢偏好的研究提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明中肌炎患者与健康受试者炎症因子IL-4的对比柱状图。
图2为本发明中肌炎患者与健康受试者炎症因子IL-10的对比柱状图。
图3为本发明中肌炎患者与健康受试者炎症因子TNF-α的对比柱状图。
图4为本发明中肌炎患者与健康受试者氧化应激指标SOD的对比柱状图。
图5为本发明中肌炎患者与健康受试者氧化应激指标MDA的对比柱状图。
图6为本发明中炎症因子和氧化应激指标相关性分析示意图。
图7为本发明中肌炎患者与健康受试者的秩丰度曲线图。
图8为本发明中肌炎患者与健康受试者的Veen图。
图9为本发明中肌炎患者（右）与健康受试者（左）的群落丰度示意图。
图10为本发明中肌炎患者与健康受试者前20个ASV在属水平的相对丰度示意图。
图11为本发明中方差分析来检验组间差异是否大于组内差异以表明统计学结果有统计学意义的分析图。
图12为本发明中肌炎患者与健康受试者肠道菌群在门水平上相对丰度排名前20位的优势菌。
图13为本发明中g_D_5_Bacteroides菌在肌炎患者与健康受试者种水平上相对丰度的差异。
图14为本发明中g_D_5_Blautia菌在肌炎患者与健康受试者种水平上相对丰度的差异。
图15为本发明中PCA法处理肌炎患者与健康受试者代谢组学数据后二者的组间差异图。
图16为本发明中PLS-DA法处理肌炎患者与健康受试者代谢组学数据后二者的组间差异图。
图17为本发明中肌炎患者与健康受试者血清中前50种差异代谢物的示意图。
图18为本发明中肌炎患者与健康受试者44个差异的血清代谢物倍数的变化图。
图19为本发明中33种与肌炎相关的代谢物P < 0.05, log2（FC） >1.0的变化图。
图20为本发明中肌炎患者与健康受试者血清代谢物中富集通路前25位示意图。
图21为本发明中肌炎患者与健康受试者肠道优势菌群丰度与血清差异代谢物相关性分析示意图。
图22为本发明中肌炎患者与健康受试者肠道优势菌群丰度、血清差异代谢物、炎症因子、氧化应激指标的相关性分析示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1-22示出了本发明肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法的实施例。
实施例1：
本实施例中的肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法具体包括对肌炎患者的粪便样本进行16s rRNA测序、对肌炎患者的血清样本进行LC-MS/MS分析以及对肌炎患者的血清样本进行ELISA分析，ELISA分析包括检测血液中的炎症因子水平，然后利用Bio-Tek酶标仪读取OD值，根据标准曲线计算浓度，再采用SOD和MDA试剂盒分析肌炎患者氧化应激指标SOD和MDA的变化。
16s rRNA测序包括如下步骤：
S101、采集粪便样本，使用Illumina NovaSeq PE250进行16S rRNA基因扩增测序，获得原始序列数据；
S102、将获得的原始序列数据采用qiime2和4.0.2的R软件进行分析，获得用于质量控制的Raw Data；
S103、与肠道菌群数据库进行对比分析，分析粪便样本中的肠道菌群组成。还能在同时进行基因组装、基因预测和功能注释。
LC-MS/MS分析为采集血液后在离心机上以3000 rpm离心10 min得到血清样本，采用UHPLC系统联合TripleTOF 6600和Waters HSS T3柱进行LC-MS/MS分析。
在LC-MS/MS分析过程中，流动相包括水和乙腈，流速为0.3ml/min，样品板的温度为4℃，柱温为40℃。
在LC-MS/MS分析过程中，洗脱梯度为初始流动相，乙腈含量95%；7 min，乙腈含量65%；1 min，乙腈含量95%；12min，乙腈含量95% ，流速0.5 mL/min；其中进样量为3μL。
在LC-MS/MS分析过程中，ESI源条件设置为:第一离子源气体：55psi、第二离子源气体：55psi、幕帘气体：35psi、温度：550℃；正离子模式中：DP：80v、CE：10v、TOF：60-1000m/z，喷雾电压：5500V；负离子模式中：DP：-80v、CE：-10v、TOF：60-1000 m/z，喷雾电压：-4500V。
在LC-MS/MS分析后，利用ProteoWizard将原始数据转换为mzXML格式，并使用R开发的基于XCMS的内部程序进行处理，用于峰值检测、提取、对齐和集成；然后将MS2数据库应用于代谢物注释，其中注释的阈值设置为0.3。
ELISA分析包括利用IL-4试剂盒（# CSB-E04633H, CUSABIO，中国）、IL-10试剂盒（#CSB-E04593H, CUSABIO，中国）和TNF-α试剂盒（# CSB-E04740H, CUSABIO，中国）检测血液中的炎症因子水平。然后利用Bio-Tek酶标仪读取OD值（MB-530, Heales, China），根据标准曲线计算IL-4、IL-10、TNF-α的浓度。采用SOD （#A001-3，南京建成生物工程研究所，中国）和MDA （#A003-1，南京建成生物工程研究所，中国）试剂盒分析肌炎患者氧化应激指标SOD和MDA的变化。
通过本方法填补了肌炎患者在肠道菌群和血清代谢物的分析上面的空白，在肌炎的研究方面取得了重大的进步，具有长足且深远的意义；对于肌炎患者微生物结构变化引起的菌群差异以及血清代谢物的功能代谢偏好的研究提供了新的思路。
实施例2：
在前述实施例1的基础上，本实施例中采用对照法分析正常健康组的肠道菌群和血清代谢物以及肌炎患者的肠道菌群和血清代谢物。
选取10例健康对照组（A:健康对照组）和10例肌炎患者（E:肌炎患者组）参与对照。
采集健康受试者和肌炎患者的血液和粪便样本。血样保存于抗凝管中，3000 rpm离心10 min后，将上血清转入Eppendorf管中，-80℃保存待进一步处理。粪样采集于粪收集管中，-80℃保存待进一步处理。
一、进行16s rRNA测序：收集健康对照组和肌炎患者的粪便样本，按照实施例1中的16s rRNA测序方法进行测序分析和分析。
二、进行LC-MS/MS分析与注释：收集健康对照和肌炎患者的血清样本，按照实施例1中的LC-MS/MS分析方法进行分析。
三、进行ELISA分析：收集健康对照和肌炎患者的血清样本，采用上述实施例1中的方式对2中血清样本进行ELISA分析。
采用ELISA法分析肌炎患者血液炎症因子和氧化应激指标的变化。结果显示，与健康对照组相比，肌炎患者IL-4和TNF-α明显升高，而IL-10在肌炎患者中较低（如图1）。与健康对照组相比，肌炎患者的SOD水平明显降低，MDA水平明显升高（如图2）。即是说明炎症反应和氧化应激发生在肌炎的过程中。
对肌炎患者和健康对照的样本进行测序，以检测微生物多样性，如图7所示，随着等级指数的增加，丰度逐渐减小，说明检测样品的物种丰度和均匀度较好。对检测到的微生物进行物种注释和分类后，使用Veen图来可视化各组间共同的ASV和唯一的ASV（如图8），健康对照组特异性asv有450个，肌炎患者特异性asv有39个，健康对照组和肌炎患者共有132个asv。Alpha多样性是对单一样本内物种多样性的分析。采用观察、Chao1和ACE指数计算群落丰富度。如图9所示，在社区丰富度方面，健康对照组和肌炎患者之间没有显著差异。
利用β多样性（β diversity）分析了群落结构的差异：采用方差分析来检验组间差异是否大于组内差异，式中，R = 0.354，组间差异大于组内差异，P = 0.023 < 0.05，表明统计学结果有统计学意义（如图11），如图12、图13和图14所示，在门水平上，与健康对照相比，肌炎患者的拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）增加，而厚壁菌门（Firmicutes）和Actlnobacteria减少，在种水平上，肌炎患者中g_Bacteroides_ASV_3（拟杆菌属）和Bacteroides_uniformis（拟杆菌属）较健康对照组增加，g_Blautia_ASV_5（Blautia属）、g_Subdoligranulum_ASV_4 （Subdoligranulum属）、g_Bifidobacterium_ASV_2（双歧杆菌属）、g_Subdoligranulum_ASV_15 （Subdoligranulum属）、g_Romboutsia_ASV_8 （Romboutsia属）、g_Erysipelotrichaceae_UCG-003_ASV_12（Erysipelotrichaceae_UCG-003g属）和g_Escherichia-Shigella_ASV_23 （Escherichia-Shigella属）有所下降。
采用高通量LC-MS/MS对参与者的血清样本进行代谢分析，PCA是一种无监督模式识别方法，用于处理代谢组学数据，可以基于所有输入样本进行代谢表型分类。结果显示组内存在一致性、组间存在差异（如图15）。为了消除该技术的任何非特异性影响并识别生物标志物，采用PLS-DA用于比较肌炎患者和健康对照组的代谢变化。结果显示，两组样本明显分离，说明组间差异显著（如图16）。为了表征肌炎患者和健康对照之间的代谢物，使用Metaboanalyst 4.0网站分析已鉴定的浓度差异显著的代谢物，如图17显示了前50个潜在的生物标志物，其中Fold change图进一步显示了肌炎患者与健康对照组44个差异的血清代谢物倍数的变化（如图18）。如图19所示，Valcano图显示有33种代谢物P < 0.05, log2（FC） >1.0变化，其中肌炎患者中有15种代谢物，健康对照组中有18种代谢物。
基于代谢组学原始数据，通过KEGG pathway Database功能注释平台进行通路功能预测，代谢产物的KEGG通路统计显示，肌炎患者和健康对照中富集的通路前25位（如图20）。肌炎患者血清中L1水平代谢功能通路有显著变化，在氨基酸代谢的L2水平，6个血清代谢产物中富含L3水平的d -谷氨酰胺和d -谷氨酸代谢（P = 0.0030485），其中C02237 （5-oxo - d -脯氨酸）和C00025（谷氨酸）在肌炎患者中显著富集。在脂质代谢L2水平，初级胆汁酸生物合成L3水平富集了46种血清代谢物（P = 0.028589），其中C00245（牛磺酸）、C05466（鹅脱氧胆酸糖）和C01921（甘胆酸糖）在肌炎患者中显著富集。以上结果表明，肌炎患者血清代谢物的显著积累和消耗与氨基酸代谢途径和脂质代谢途径的功能代谢偏好有关。
通过上述对比分析可以看出肌炎患者与健康受试者的肠道菌群和血清代谢物的分析结果具有一定的差异，为肌炎的生物标志物等的选择提供了新的方向。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。
Claims (8)
1.一种肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，其特征在于：包括对肌炎患者的粪便样本进行16s rRNA测序、对肌炎患者的血清样本进行LC-MS/MS分析以及对肌炎患者的血清样本进行ELISA分析，所述ELISA分析包括检测血液中的炎症因子水平，然后利用Bio-Tek酶标仪读取OD值，根据标准曲线计算浓度，再采用SOD和MDA试剂盒分析肌炎患者氧化应激指标SOD和MDA的变化。
2.根据权利要求1所述的肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，其特征在于：所述16s rRNA测序包括如下步骤：
S101、采集粪便样本，使用Illumina NovaSeq PE250进行16S rRNA基因扩增测序，获得原始序列数据；
S102、将获得的原始序列数据采用qiime2和4.0.2的R软件进行分析，获得用于质量控制的Raw Data；
S103、与肠道菌群数据库进行对比分析，分析粪便样本中的肠道菌群组成。
3.根据权利要求1所述的肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，其特征在于：所述LC-MS/MS分析为采集血液后在离心机上以3000 rpm离心10 min得到血清样本，采用UHPLC系统联合TripleTOF 6600和Waters HSS T3柱进行LC-MS/MS分析。
4.根据权利要求3所述的肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，其特征在于：在LC-MS/MS分析过程中，流动相包括水和乙腈，流速为0.3ml/min，样品板的温度为4℃，柱温为40℃。
5.根据权利要求3所述的肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，其特征在于：在LC-MS/MS分析过程中，洗脱梯度为初始流动相，乙腈含量95%；7 min，乙腈含量65%；1 min，乙腈含量95%；12min，乙腈含量95% ，流速0.5 mL/min；其中进样量为3μL。
6.根据权利要求3所述的肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，其特征在于：在LC-MS/MS分析过程中，ESI源条件设置为:第一离子源气体：55psi、第二离子源气体：55psi、幕帘气体：35psi、温度：550℃；正离子模式中：DP：80v、CE：10v、TOF：60-1000 m/z，喷雾电压：5500V；负离子模式中：DP：-80v、CE：-10v、TOF：60-1000 m/z，喷雾电压：-4500V。
7.根据权利要求3所述的肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，其特征在于：在LC-MS/MS分析后，利用ProteoWizard将原始数据转换为mzXML格式，并使用R开发的基于XCMS的内部程序进行处理，用于峰值检测、提取、对齐和集成；然后将MS2数据库应用于代谢物注释，其中注释的阈值设置为0.3。
8.根据权利要求1所述的肌炎患者肠道菌群和血清代谢物的分析方法，其特征在于：所述ELISA分析包括利用IL-4试剂盒、IL-10试剂盒和TNF-α试剂盒检测血液中的炎症因子水平，然后利用Bio-Tek酶标仪读取OD值，根据标准曲线计算IL-4、IL-10、TNF-α的浓度，再采用SOD和MDA试剂盒分析肌炎患者氧化应激指标SOD和MDA的变化。
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