CN116426622A - 利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法及应用 - Google Patents
利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法及应用，确定了用于自然放牧下绵羊代谢紊乱的肠道菌群诊断指标，以自然放牧下不同放牧时期的绵羊作为对象，检测血浆中代谢相关生化指标确定绵羊胃肠道菌群情况。同时，利用16s rRNA基因Illumina测序、生物信息分析，确认与分析对象的兽医临床指标存在明显的相关性的肠内细菌结构和功能，根据分析结果确认到与正常范围内的代谢性相关兽医临床指标有关性的胃肠道内的菌群，本发明有助于自然放牧下绵羊代谢紊乱的诊断、检测、检测疾病活动和评估治疗情况。
Description
技术领域
本发明公开一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法及应用，属于兽医生物检测技术领域，具体涉及一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法及应用。
背景技术
随着草原荒漠化的加剧，能供给绵羊的活动的地方越来越少，从而导致处于放牧环境下的绵羊运动量大幅下降，加之饲喂的高脂肪饲料又会导致绵羊体内出现微生物代谢紊乱，增加代谢性疾病。
绵羊等反刍动物消化道中生活着大量的各种微生物，其数量大约是反刍动物自身细胞数量的十倍。绵羊的胃肠道是一个营养物质的发酵室，胃肠道里面的微生物种群复杂且随着环境的变化而呈现动态改变。共生菌群能够平衡机体的免疫反应、营养物质的消化、机体的生理调节等方面对宿主的健康起着至关重要的作用。已知胃肠内细菌的菌群受到宿主的遗传因素和饮食摄取等环境因素的影响。
此外，已知在肥胖、糖尿病、炎症性肠道疾病动物等中也发现了肠内细菌不均衡。由此，虽然存在研究肠内细菌菌群及其与疾病的相关性的以往报告，但是大部分以往的研究更多关注通过比较患有特定疾病的动物与健康的动物的肠内微生物来发现疾病相关微生物，而实际情况是，对于代谢临床医学指标的信息不足。
因此对于存在于绵羊肠内的特定微生物与健康指标的相关关系信息不足问题，一直是本领域技术人员研究的重点。
基于此，本发明确定了一种用于绵羊代谢紊乱的绵羊胃肠道菌群诊断指标，分析不同时期绵羊体内胃肠道菌群的差异，可以更好地认识代谢疾病的本质，找出疾病相关因子或识别高危羊群，以解决上述提到的问题。
发明内容
本发明克服了现有技术存在的不足，提供了一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法及应用，基于自然放牧下绵羊代谢紊乱的绵羊胃肠道菌群诊断指标，以绵羊为研究对象，对自然放牧下不同放牧时期引起的羊胃肠道菌群的差异性进行分析，从胃肠道菌群入手寻找代谢紊乱条件的主要原因，寻求一种从个体的试样检测出微生物的方法，用于提供预测或诊断代谢性疾病的危险程度时所需的信息。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：利用16s rRNA基因测序检测绵羊胃肠道菌群代谢紊乱的方法，包括以下步骤：
S1：以自然放牧下不同放牧时期的绵羊作为对象；
S2：从放牧绵羊的血浆中提取血清，用于检测代谢相关生化指标；
S3：利用16s rRNA基因序列方法进行总DNA提取和检测、PCR产物鉴定、纯化及定量、构建PE文库及Illumina测序、生物信息分析；
S4：校正了年龄、性别、遗传性因素后，确认与分析对象的临床医学指标存在明显的相关性的肠内细菌结构和功能；
S5：分析胃肠道内菌群的多样性和组成分析，根据分析结果确认到与正常范围内的代谢性疾病相关临床医学指标有关性的胃肠道内的菌群。
优选的，所述总DNA提取和检测具体步骤为：
(1)总DNA提取
胃肠道内组织中DNA的提取根据DNA抽提试剂盒说明书完成操作，然后通过NanoDrop2000进行DNA纯度和浓度的检测，再进行DNA完整性的检测，检测方法为1％琼脂糖凝胶电泳，电压5V/cm，时间为20min；
(2)PCR扩增
引物对应区域：16S V3-V4区
上游引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT
(3)PCR反应参数如下
a.1×(95℃3min，)；
b.27次循环×(95℃30s；55℃30s；72℃45s)；
c.72℃10min，10℃直至被用户停止。
优选的，所述PCR产物鉴定、纯化及定量具体步骤如下：
(1)PCR产物鉴定
每个样本3个PCR产物重复，将3个重复的PCR产物混合；然后使用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物；
(2)PCR产物纯化
PCR产物纯化使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，具体流程依据说明书操作；
(3)PCR产物定量与均一化
将PCR产物用QuantusTMFluorometer进行检测定量，按照不同样本测序量要求不同，混合的比例应与之相应。
优选的，所述生物信息分析具体包括以下步骤：
(1)OTU聚类
使用UPARSE软件，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类，使用UCHIME软件剔除嵌合体；
(2)分类学分析
通过RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库，70％被设置为比对阈值。
优选的，所述OTU聚类具体流程如下：
(1)提取优化序列中的非重复序列，剔除没有重复的单序列；
(2)非重复序列按照97％相似性进行OTU聚类，嵌合体在聚类过程中去除，最终得到OTU代表序列；
(3)将所有优化序列map至OTU代表序列，与OTU代表序列相似性在97％以上的序列被选出，生成OTU表格。
本发明涉及一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的应用，有相关性的胃肠道内的菌群在早期诊断代谢性疾病的作为生物标记物中的应用。
本发明与现有技术相比具有的有益效果是：本发明通过自然放牧下不同放牧时期的绵羊作为对象，首次查明了绵羊肠道内细菌群与代谢性疾病的兽医临床指标的相关性，并以此为基础提供了代谢性疾病的早期诊断技术。在本发明中，从放牧的绵羊的血浆中提取血清，用于检测代谢相关生化指标。此外，用DNA抽提试剂盒提取胃肠道内的DNA，在校正了日龄、性别、遗传性因素等后，确认了与分析对象的临床医学指标存在明显的相关关系的肠内细菌的结构和功能。其结果，分析了胃肠道内菌群的多样性和组成分析，分析结果，确认到与正常范围内的代谢性疾病相关兽医临床指标有关的胃肠道内的菌群。能够将本发明中证明了有相关性的胃肠道内菌群作用于早期诊断代谢性疾病的生物标记物，从而能够将在健康羊群的胃肠道内所发现的较多的肠内菌群用于早期诊断、预防和治疗代谢性疾病的目的。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
图1为本发明胃肠道菌群α多样性分析比较图。
图2为本发明胃肠道菌群β多样性分析比较图。
图3为本发明门水平上胃肠道菌群组成图。
图4为本发明绵羊胃肠道菌群功能预测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
如图1～图4所示，本发明一种利用16s rRNA基因测序检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法，包括以下步骤：
S1：以自然放牧下不同放牧时期的绵羊作为对象；
S2：从放牧绵羊的血浆中提取血清，用于检测代谢相关生化指标；
S3：利用16s rRNA基因序列方法进行总DNA提取和检测、PCR产物鉴定、纯化及定量、构建PE文库及Illumina测序、生物信息分析；
S4：校正了年龄、性别、遗传性因素后，确认与分析对象的兽医临床指标存在明显的相关性的肠内细菌结构和功能；
S5：分析胃肠道内菌群的多样性和组成分析，根据分析结果确认到与正常范围内的代谢性疾病相关临床兽医指标有关性的胃肠道内的菌群。
所述总DNA提取和检测具体步骤为：
(1)总DNA提取；
胃肠道内组织中DNA的提取根据DNA抽提试剂盒说明书完成操作，然后通过NanoDrop2000进行DNA纯度和浓度的检测，再进行DNA完整性的检测，检测方法为1％琼脂糖凝胶电泳，电压5V/cm，时间为20min；
(2)PCR扩增；
引物对应区域：16S V3-V4区；
上游引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；
下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT；
(3)PCR反应参数如下；
a.1×(95℃3min，)；
b.27次循环×(95℃30s；55℃30s；72℃45s)；
c.72℃10min，10℃直至被用户停止。
所述PCR产物鉴定、纯化及定量具体步骤如下：
(1)PCR产物鉴定；
每个样本3个PCR产物重复，将3个重复的PCR产物混合；然后使用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物；
(2)PCR产物纯化；
PCR产物纯化使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，具体流程依据说明书操作；
(3)PCR产物定量与均一化；
将PCR产物用QuantusTMFluorometer进行检测定量，按照不同样本测序量要求不同，混合的比例应与之相应。
所述生物信息分析具体包括以下步骤：
(1)OTU聚类；
使用UPARSE软件，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类，使用UCHIME软件剔除嵌合体，具体流程如下：
【1】提取优化序列中的非重复序列，剔除没有重复的单序列；
【2】非重复序列按照97％相似性进行OTU聚类，嵌合体在聚类过程中去除，最终得到OTU代表序列；
【3】将所有优化序列map至OTU代表序列，与OTU代表序列相似性在97％以上的序列被选出，生成OTU表格。
(2)分类学分析；
通过RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库，70％被设置为比对阈值。
本发明涉及一种一种利用16s rRNA基因测序检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的应用，所述有相关性的胃肠道内的菌群在早期诊断代谢性疾病的作为生物标记物中的应用。
本发明一种用于自然放牧下绵羊代谢紊乱的绵羊胃肠道菌群诊断指标，主要是检测血浆中代谢相关生化指标。
具体指标为：为判断自然放牧下绵羊的代谢情况，为肠道菌群指标的筛选提供依据，运用检测试剂盒检测血浆中代谢相关生化指标指葡萄糖(降低)、总蛋白(降低)、尿素氮(降低)、总胆固醇(降低)、柠檬酸(降低)、甘油三酯(降低)、高密度脂蛋白(降低)、三碘甲状原氨酸(升高)、甲状腺素(升高)、生长激素(升高)、胰高血糖素(升高)、肿瘤坏死因子α(升高)、皮质醇(升高)、胰岛素(降低)、胰岛素样生长因子-1(降低)、葡萄糖6磷酸脱氢酶(降低)、乙酰辅酶A羧化酶(降低)、磷酸化糖原合成激酶(降低)、脂肪酸结合蛋白(降低)，激素敏感脂肪酶(升高)、糖原合成激酶(升高)。
指标中，门水平上的胃肠道菌群组成和属水平上的胃肠道菌群组成两个水平的变化。
指标中，门水平上的胃肠道菌群组成指代谢紊乱绵羊胃肠道菌群门水平的变化，厚壁菌门在十二指肠中的存在显著差异，枯草期十二指肠中厚壁菌门的相对丰度显著低于青草期。空肠中放线菌门处在显著差异，枯草期空肠中放线菌门的相对丰度显著降低。除此之外，胃中的放线菌门和拟杆菌门与肠道中存在显著差异。
指标中，属水平上的胃肠道菌群组成指绵羊代谢紊乱胃肠道中各种属变化趋势，单均未见显著变化。胃中和肠道中的各组分的含量存在差异，Aeriscardovia、Turicibacter、Romboutsia和unclassified-f-Bifido bacteriaceae未在瘤胃和皱胃中被检测到。Rikenellaceae-RC9-gut-group则未在空肠中被检测到。
数据结果分析
1、血清生化指标检测结果；
对血清生化指标进行了调查，其结果显示，与青草期相比，枯草期血清中脂代谢相关指标葡萄糖，总蛋白、尿素氮以及总胆固醇、柠檬酸、甘油三酯、高密度脂蛋白的含量显著降低。而低密度脂蛋白的含量没有显著变化。与青草期相比，枯草期血清中与分解代谢相关的三碘甲状原氨酸、甲状腺素、生长激素、胰高血糖素、肿瘤坏死因子α和皮质醇的含量显著升高，而瘦素的含量没有显著变化；与合成代谢相关的胰岛素和胰岛素样生长因子-1的含量显著降低。这些结果进一步说明代谢紊乱条件下绵羊机体物质代谢存在显著的差异。
2、胃肠道菌群α多样性比较；
本发明采用Illumina高通量测序技术分析不同放牧时期绵羊瘤胃、皱胃、十二指肠、空肠和回肠的菌群多样性。我们根据OUT划分标准-97％的序列相似性。2537个OUT被检测出。枯草期瘤胃、皱胃、十二指肠、空肠和回肠中被检测出的OUT数分别为1218、1222、348、343和496个。青草期瘤胃、皱胃、十二指肠、空肠和回肠中被检测出的OUT数分别为506、548、332、362和314个。枯草期瘤胃和皱胃中的OUT数较高，由此可以说明枯草期瘤胃和皱胃微生物的多样性较高。
细菌丰富度和均匀度常常被用来解释细菌的多样性，而细菌的丰富度和均匀度分别用Chao指数、Ace指数、Simpson指数和Shannon指数来表示。在OUT的基础上胃肠道微生物的多样性进行分析。与青草期相比，枯草期瘤胃和皱胃中的Shannon指数显著高于青草期，而十二指肠、空肠和回肠的Shannon指数无显著变化；枯草期瘤胃中Simpson指数显著低于青草期，而皱胃十二指肠、空肠和回肠的Simpson指数无显著变化；枯草期瘤胃和皱胃中Ace和Chao指数均显著高于青草期。而十二指肠、空肠和回肠无显著变化。进一步说明枯草期瘤胃和皱胃中的微生物丰富度和均匀度较高。枯草期和青草期瘤胃、皱胃、十二指肠、空肠和回肠中的指数均大于99％，可以说明不同时期，瘤胃、皱胃、十二指肠、空肠和回肠中的微生物覆盖度较高。综合起来，我们可以初步推断出枯草期瘤胃和皱胃的微生物α-多样性较高。
3、胃肠道菌群β多样性比较；
本发明还利用Unweighted Unifrac距离计算的UPGMA聚类数图可以看出样本的聚类情况比较好，不同时期的可以聚类为一簇，而且可以看出胃和肠道各自聚类为一簇。基于Unweighted Unifrac将构建的OUTs的主成分分析，第一主成分和第二主成分的贡献率分别为29.75和15。由于样品采集为随机性采集，造成样品不能够完全分离，存在部分交叉现象。但是可以推断出不同的放牧时期绵羊胃肠道微生物存在一定的差异。
4.胃肠道菌群组成分析；
4.1门水平上的胃肠道菌群组成分析；
绵羊胃内细菌在门水平我们一共检测了30种，其中丰度较大的厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、变形菌门、纤维杆菌门、蓝藻细菌门、Patescibacteria门、迷踪菌门、螺旋体门和软壁菌门。我们可以看出瘤胃和皱胃与十二指肠、空肠和回肠中的优势菌群存在显著差异。与青草期相比，枯草期瘤胃内拟杆菌门、纤维杆菌门、Patescibacteria门和螺旋体门显著升高。在绵羊皱胃中，枯草期的拟杆菌门、纤维杆菌门、Patescibacteria门、迷踪菌门和螺旋体门的含量均高于青草期。与青草期相比，枯草期绵羊十二指肠中的放线菌门、变形菌门、蓝藻菌门和Patescibacteria门的含量显著升高。在枯草期绵羊的空肠中厚壁菌门、蓝藻菌门、Patescibacteria门和软壁菌门的含量均高于青草期。和青草期比较来说，枯草期绵羊的回肠中放线菌门、拟杆菌门、螺旋体门和Patescibacteria门含量升高。
4.2属水平上的胃肠道菌群组成分析；
通过物种注释结果可知，绵羊胃肠道微生物菌群在属水平上前19中相对丰度较高的物种。这菌属主要包括Olsenella、Prevotella_1、Aeriscardovia、双歧杆菌属、Acetitomaculum、Lachnospiraceae_NK3A20_group、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Turicibacter、Ruminococcus_2、Ruminococcaceae_UCG-014、Rikenellaceae_RC9_gut_group、互养球菌属、Romboutsia、Prevotella_7、norank_f_F082、unclassified_f_Bifido bacteriaceae、Prevotellaceae_UCG-001、假单胞菌属、Erysipelotrichaceae_UCG-002。与青草期相比，枯草期绵羊瘤胃中的Prevotella_1、Rikenellaceae_RC9_gut_group、norank_f_F082的含量较高。同样与青草期相比较，枯草期皱胃中的Prevotella_1、Ruminococcus_2、Rikenellaceae_RC9_gut_group、norank_f_F082、假单胞菌属的表达水平较高。在枯草期绵羊的十二指肠中，Olsenella、Aeriscardovia、互养球菌属、假单胞菌属的含量比青草期要高。在空肠组织中，枯草期绵羊体内的双歧杆菌属、Acetitomaculum、Lachnospiraceae_NK3A20_group、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Turicibacter、假单胞菌属的含量高于青草期。与青草期相比，枯草期绵羊回肠中的Olsenella、Aeriscardovia、双歧杆菌属、Lachnospiraceae_NK3A20_group、Ruminococcus_2、Romboutsia、Prevotella_7、norank_f_F082、unclassified_f_Bifidobacteriaceae、Prevotellaceae_UCG-001、假单胞菌属、Erysipelotrichaceae_UCG-002的含量较高。
5.绵羊胃肠道菌群；
5.1门水平上；
不同放牧时期对绵羊胃肠道菌群门水平的影响，厚壁菌门在十二指肠中的存在显著差异，枯草期十二指肠中厚壁菌门的相对丰度显著低于青草期。空肠中放线菌门处在显著差异，枯草期空肠中放线菌门的相对丰度显著低于青草期。除此之外，胃中的放线菌门和拟杆菌门与肠道中存在显著差异。
5.2属水平上；
不同放牧时期对绵羊胃肠道菌群属水平的影响，胃肠道中各种属在枯草期和青草期之间存在变化趋势，单均未见显著变化。我们还观察到胃中和肠道中的各组分的含量存在差异，Aeriscardovia、Turicibacter、Romboutsia和unclassified-f-Bifidobacteriaceae未在瘤胃和皱胃中被检测到。Rikenellaceae-RC9-gut-group则未在空肠中被检测到。
6.绵羊胃肠道菌群功能预测；
根据软件PICRUSt2分析，我们发现了胃肠道细菌微生物主要包括了12种代谢途径，包括Carbohydrate metabolism(碳水化合物代谢)、Global and overview maps、Aminoacid metabolism(氨基酸代谢)、Energy metabolism(能量代谢)、Nucleotide metabolism(核酸代谢)、Metabolism of cofactors and vit(维生素和辅助因子代谢)、Lipidmetabolism(脂代谢)、Xenobiotics biodegradation and metabolism(生物降解和代谢)、Glycan biosynthesis and metabolism(多糖的生物合成和代谢)、Biosynthesis ofother secondary metabolites(次级代谢产物的合成)、Metabolism of other aminoacids(其他氨基酸的代谢)和Metabolism of terpenoids and polyketides(萜类化合物和聚酮类化合物的代谢)。瘤胃中，青草期碳水化合物代谢的活跃度高于枯草期。十二指肠中碳水化合物代谢、Global and overview maps、维生素和辅助因子代谢和脂代谢的活跃度高于枯草期。回肠中枯草期碳水化合物代谢、Global and overview maps、氨基酸代谢活跃度高于青草期。
产业可利用性：
本发明提供用于检测自然放牧下绵羊代谢性疾病的新型生物标记物的组合物，如果使用该组合物，则通过简单的试样采集，能够预测代谢性疾病的危险程度，能够开发用于预防、诊断各种代谢性疾病的快速诊断试剂盒。此外，作为用于预防或治疗各种代谢性疾病的新药开发和控制的靶标，期待也能够有效利用上述组合物。
下面通通过具体指标参数进行进一步的辅助说明。
表1胃肠道菌群α多样性分析比较
表2绵羊胃肠道微生物种群(门水平)
表3绵羊胃肠道微生物种群(属水平)
上面结合附图对本发明的实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (6)
1.利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法，其特征在于，采用16s rRNA基因Illumina测序检测胃肠道菌群，按下述步骤实施：
S1：以自然放牧下不同放牧时期的绵羊作为对象；
S2：从放牧绵羊的血浆中提取血清，用于检测代谢相关生化指标；
S3：利用16s rRNA基因序列方法进行总DNA提取和检测、PCR产物鉴定、纯化及定量、构建PE文库及Illumina测序、生物信息分析；
S4：校正了日龄、性别、遗传性因素后，确认与分析对象的兽医临床指标存在明显的相关性的肠内细菌结构和功能；
S5：分析胃肠道内菌群的多样性和组成分析，根据分析结果确认到与正常范围内的代谢性疾病相关临床医学指标有关性的胃肠道内的菌群。
2.根据权利要求1所述的一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法，其特征在于：所述总DNA提取和检测具体步骤为：
(1)总DNA提取；
胃肠道内组织中DNA的提取根据DNA抽提试剂盒说明书完成操作，然后通过NanoDrop2000进行DNA纯度和浓度的检测，再进行DNA完整性的检测，检测方法为1％琼脂糖凝胶电泳，电压5V/cm，时间为20min；
(2)PCR扩增；
引物对应区域：16S V3-V4区；
上游引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；
下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT；
(3)PCR反应参数如下；
a.1×(95℃3min)
b.27次循环×(95℃30s；55℃30s；72℃45s)；
c.72℃10min，10℃直至被用户停止。
3.根据权利要求1所述的一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法，其特征在于：所述PCR产物鉴定、纯化及定量具体步骤如下：
(1)PCR产物鉴定；
每个样本3个PCR产物重复，将3个重复的PCR产物混合；然后使用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物；
(2)PCR产物纯化；
PCR产物纯化使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，具体流程依据说明书操作；
(3)PCR产物定量与均一化；
将PCR产物用QuantusTMFluorometer进行检测定量，按照不同样本测序量要求不同，混合的比例应与之相应。
4.根据权利要求1所述的一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法，其特征在于：所述生物信息分析具体包括以下步骤：
(1)OTU聚类；
使用UPARSE软件，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类，使用UCHIME软件剔除嵌合体；
(2)分类学分析；
通过RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库，70％被设置为比对阈值。
5.根据权利要求4所述的一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法，其特征在于：所述OTU聚类具体流程如下：
(1)提取优化序列中的非重复序列，剔除没有重复的单序列；
(2)非重复序列按照97％相似性进行OTU聚类，嵌合体在聚类过程中去除，最终得到OTU代表序列；
(3)将所有优化序列map至OTU代表序列，与OTU代表序列相似性在97％以上的序列被选出，生成OTU表格。
6.根据权利要求1所述的一种利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的应用，其特征在于：有相关性的胃肠道内的菌群在早期诊断代谢性疾病中作为生物标记物的应用。
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| CN202310033764.XA CN116426622A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 利用16s rRNA基因检测胃肠道菌群诊断自然放牧绵羊脂肪代谢紊乱的方法及应用 |
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2023
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