CN111235211A - 肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用中,通过对健康儿童和性早熟儿童进行肠道微生物菌群检测,将肠道菌群的丰富度变化和菌群的代谢研究相结合,从而分析菌群组成变动时相应产生的代谢产物的变化,发现性早熟儿童肠道菌群乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属的相对丰度下降,拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属的相对丰度上升,因此,将检测与研究结果相比较,来评估儿童肠道菌群微生物的水平变化;另外本申请中还提供了一种益生菌制剂,所述益生菌制剂的制备原料包括:混合乳杆菌、链球菌、葡萄糖、低聚葡萄糖、低聚果糖及脱脂牛奶,本申请提供的益生菌制剂可以辅助恢复性早熟患者的肠道菌群稳态。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域,尤其涉及一种肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用。
背景技术
近年来,随着我国居民生活水平的提高,饮食结构的改变和环境等因素,越来越多的儿童出现与真实年龄不符的第二性征,性早熟成为儿童最常见的内分泌疾病之一,并且发病频率有逐年升高的趋势,已经在全球范围内引起儿科专家的重视。目前我国普遍认为,女孩在8岁前、男孩在9岁前表现出第二性征的发育即可定义为性早熟,以女孩居多。根据中国健康促进与教育协会2018年公布的调查数据显示,我国儿童性早熟患病率为0.43%,全国约有53万名患儿,性早熟已经成为仅次于肥胖的第二大儿童内分泌疾病。中枢性性早熟是下丘脑-垂体-性腺轴功能提前启动,造成第二性征提早发育,占性早熟病例的80%左右。
大脑与胃肠道之间可以相互影响,相互作用,近些年研究发现,肠道通透性发生改变后,肠道微生物或代谢产物可进入血液,从而影响神经系统和宿主的健康,大脑和肠道双向的互动反应通过迷走神经相互联系,肠道菌群可以通过脑-肠轴影响神经系统的功能,脑-肠轴功能的变化也会改变肠道菌群结构,进而形成了细菌-脑-肠轴这一新的概念体系。
人体肠道中的微生物群落与宿主之间的关系极为密切,肠道菌群失调与多种临床疾病密切相关;肠道菌群在儿童性早熟过程中的作用并不明确,寻找可用来进行儿童性早熟评估的微生物标志物对探究肠道菌群在儿童性早熟过程中的作用机制具有重要的意义;且目前评估儿童性早熟的发生,除了出现肉眼可见的第二性征之外,还需要抽取静脉血进行性激素指标的检测,儿童对抽血时的刺痛感十分恐惧并反感,配合度较低。
发明内容
本申请提供了一种肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,以寻找可以用来评估儿童性早熟状况的微生物标志物。
为了解决上述技术问题,本申请实施例公开了如下技术方案:
本申请提供了一种肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,所述微生物包括特征菌属,用于评估儿童性早熟,其中:
所述特征菌属包括:乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属。
可选的,所述特征菌属还包括:拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属。
可选的,所述乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属的相对丰度下降。
可选的,所述拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属的相对丰度上升。
可选的,所述应用还包括益生菌制剂:
所述益生菌制剂的制备原料按照质量分数包括:
混合乳杆菌35%-45%、链球菌30%-40%、葡萄糖5%-10%、低聚葡萄糖1%-5%、低聚果糖1%-5%及脱脂牛奶0.1%-1%。
可选的,所述混合乳杆菌包括嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌及瑞士乳杆菌,其中:
所述嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌及瑞士乳杆菌的质量份数比例为1:1:1。
可选的,所述链球菌为嗜热链球菌。
可选的,所述益生菌制剂的制备方法包括:
将所述混合乳杆菌、链球菌、葡萄糖、低聚葡萄糖及低聚果糖混合成混合液;
将所述混合液经离心、弃去上清液后得到浓缩菌液;
向所述浓缩菌液中加入脱脂牛奶后梯度降温得到预冷菌液;
将所述预冷菌液真空冷冻干燥得到益生菌制剂。
本申请提供了一种肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用中,通过对健康儿童和性早熟儿童进行肠道微生物菌群检测,将肠道菌群的丰富度变化和菌群的代谢研究相结合,从而分析菌群组成变动时相应产生的代谢产物的变化,发现乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属的相对丰度下降,拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属的相对丰度上升,因此,将检测与研究结果相比较,来评估儿童肠道菌群微生物的水平变化,根据肠道菌群微生物的水平变化来判断是否存在性早熟的风险;另外本申请中还提供了一种益生菌制剂,所述益生菌制剂的制备原料按照质量分数包括:混合乳杆菌35%-45%、链球菌30%-40%、葡萄糖5%-10%、低聚葡萄糖1%-5%、低聚果糖1%-5%及脱脂牛奶0.1%-1%,本申请提供的益生菌制剂可以辅助恢复性早熟患者的肠道菌群稳态。
应当理解的是,以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的,并不能限制本申请。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的健康儿童和性早熟儿童的肠道菌群测序结果示意图;
图2为本申请实施例提供的健康儿童和性早熟儿童的肠道菌群功能分析中D-丙氨酸代谢途径差异示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本申请保护的范围。
本申请提供了一种肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用中,通过将对象粪便排入一个清洁干燥的容器内,用采样勺从粪便内部挖取约500mg粪便,置于保存管中,用粪便菌群试剂盒提取微生物组总DNA,设计含有barcode序列的特异引物,PCR扩增16SrRNA的V1-V2区,建立扩增子文库,illumina HiSeq2500测序平台进行测序;降噪优化后的数据与健康儿童肠道菌群数据进行对比,具体结果如下:
本申请提供了一种肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,所述微生物包括特征菌属,用于评估儿童性早熟,其中:
所述特征菌属包括:乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属。
所述特征菌属还包括:拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属。
降噪优化后的数据与健康儿童肠道菌群数据进行对比,所述乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属的相对丰度下降。
所述拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属的相对丰度上升。
在本实施例中,相对丰度下降或上升是指丰度差异,而丰度差异是指与正常或对照用靶的体内水平相比,在性早熟儿童的患者体内得到更高或更低水平的微生物,从本申请的目的出发,本申请中选用正常儿童与性早熟儿童作对比,具体选取正常儿童与性早熟儿童中的粪便作为样本。
由上述可见,乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属,拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属这几个菌属为性早熟儿童肠道菌群评估的特征菌,因此为评估体系的关键。
因此,可以将检测与研究结果相比较,来评估儿童肠道菌群微生物中上述特征菌的水平变化,根据肠道菌群微生物的水平变化来判断是否存在性早熟的风险。
本申请发现了特征菌群在性早熟儿童中的水平变化,通过检测特征菌群的变化,可以实现性早熟儿童的评估,使用本发明的特征微生物作为标志物进行诊断,特异性高、敏感性强。
由上述技术方案可见,本申请通过分析确定与性早熟疾病相关的关键菌群和具有显著差异的标志物分子,根据测序结果分析,确定性早熟疾病患者肠道微生物菌群中出现显著差异的菌种列表,分析与宿主代谢密切相关的菌落组成变化。
且建立性早熟疾病诊断新的辅助参考指标,通过分析性早熟疾病患者的粪便样本菌群差异,明确起主要作用的生物标志菌群,继而分析菌群的变化以确定性早熟发生过程中,肠道菌群的稳态变化情况。
在本实施例中,采用试剂盒检测肠道菌群微生物,试剂盒为基于检测乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属、拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属丰度的诊断儿童性早熟的试剂盒,试剂盒组分如下:DNA提取试剂、特异性检测乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属、拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属16SrRNAde引物对、反应缓冲液、、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶逆转录酶、DNase、RNAse抑制剂、DEPC-水、无菌水。
所述采用试剂盒检测肠道菌群微生物,包括:
从对象粪便中提取DNA样本;
具体包括:通过将对象粪便排入一个清洁干燥的容器内,用采样勺从粪便内部挖取约500mg粪便,置于保存管中。
针对DNA样本构建测序文库;
对测序文库进行高通量测序,获得测序结果;
具体包括:用粪便菌群试剂盒提取微生物组总DNA,设计含有barcode序列的特异引物,PCR扩增16SrRNA的V1-V2区,建立扩增子文库,illumina HiSeq2500测序平台进行测序,每个样本均产生相应的高质量测序结果。
根据测序结果获得肠道菌群微生物的相对丰度。
具体包括:首先根据已测微生物基因组的16S rRNA基因全长序列,推断它们的共同祖先的基因功能谱;16S测序后,分析标记基因数据的第一步是去除序列错误:尽管序列错误率很低,在Illumina测序中,每个核苷酸的错误率仅为0.1%,但是很大部分明显的序列多样性来源于测序错误。对测序获得的16S rRNA基因序列,通过与数据库比对,寻找每一条测序序列的“参考序列最近邻居”,并归为参考OTU;根据“参考序列最近邻居”的rRNA基因拷贝数,对获得的OTU丰度矩阵进行校正;然后进行OTUs聚类,即将相似的序列(通常具有97%相似性阈值)合并归为单个的小分类单元,然后将序列的变体(包括通过序列错误引入的序列变体)合并成可用于随后分析的单个OTU。
然后统计所有样本在门、纲、目、科、属各层次上的分类结果。基于相对丰度前十五的物种采用累积柱状图比较样本间的物种组成差异,并进行列表展示。基于属水平上每个样品的物种丰度信息,选取丰度前50的属,根据各样品的丰度信息对样品和物种进行聚类,绘制热图。菌群分析中Beta多样性数据可视化采用排序的技术,常用如主坐标轴分析(PCoA)或主成分分析(PCA)。这类方法将复杂的距离矩阵,转换为可观察的2或3维空间,代表样品间距离。样品可以按分组信息着色,方便观察组间差异,属于无监督的方法。除此之外还可以进行α多样性、Shannon-Wiener曲线、Specaccum物种累积曲线等相关分析。
将测序得到的菌群组成“映射”到数据库中,对菌群代谢功能进行预测。根据“参考序列最近邻居”对应的KEGG/EggNOG等基因功能谱数据,换算预测菌群的整体代谢功能。进行差异分析如LEfSe分析,LEfSe分析即LDA Effect Size分析,是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的分析,使用non-parametric factorial Kruskal-Wallis(KW)sum-rank test(非参数因子克鲁斯卡尔—沃利斯和秩验检)检测具有显著丰度差异特征,并找到与丰度有显著性差异的类群。
从图1中可发现,在健康儿童体内乳杆菌目(O_Lactobacillus)、放线菌纲(C_Actinobacteria)、链球菌属(G_streptococcus)、奈瑟氏菌科(F_Neisseria)、巴斯德菌科(F_Pasteurella)等;在性早熟患者体内菌群丰度较高的种属有拟杆菌属(G_Bacteroides)、肠杆菌科(F_Enterobacteriales)、假单胞菌目(O_Pseudomonadales)等菌群丰度较高。图1中的数据仅显示具有显著差异的肠道菌群组成,对于低于设定阈值的菌群数值则不显示。通过对比两组儿童的粪便样本发现,健康儿童的肠道中含有更多的乳杆菌属和巴斯德菌等益生菌群,这一结果也表明在健康儿童的肠道中,这些益生菌对机体的健康起到了积极的促进作用,而从患者粪便样本发现益生菌的减少,或许与性早熟疾病的发生有关。
代谢组学是基于高通量分析技术(色谱质谱联用、NMR)和生物信息学的重要组学技术之一,也被广泛应用到生命科学与医学研究的各个领域。其中最常用的KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)通过基因组测序和其他高通量实验技术生成的大规模分子数据集的整合和解读,用来查询代谢途径、酶(或编码酶的基因)、产物等,也可以通过BLAST比对查询未知序列的代谢途径信息。如下表1是对性早熟患者的样本进行代谢组学分析的结果。
表1差异代谢物的代谢通路分析
其中表中参数的含义分别为:Hits:差异代谢物命中该通路的个数;Raw p:富集分析得到的P值;-ln(p):P值取负自然对数;Holm adjust:经Holm-Bonferroni方法进行多重假设检验校正后的P值;FDR:经错误发现率(false discovery rate,FDR)方法进行多重假设检验校正后的P值;Hits Cpd:命中该条通路的差异代谢物的名称及其KEGG ID。
表1中列出了具有明显差异的三条代谢途径,分别是硒氨基酸代谢、β-丙氨酸代谢、氮代谢。与之相关的中间代谢物个数分别是22个、28个和39个。可以看出这几条途径中牵扯到众多的代谢物的利用和转化,因此这几条途径的改变相应的也会影响着不同的代谢物含量的改变。
图2示出了对肠道菌群的功能代谢组分析之后,发现在健康儿童体内D-丙氨酸代谢途径高于性早熟患者,而在表1数据中β-丙氨酸的代谢也有显著的差异,即性早熟患者于健康人群肠道菌群的代谢存在明显的差异。其中D型氨基酸对地球上大部分生命是有毒性的,被微生物吸收的D型氨基酸主要经两条途径被利用:被细菌用于自身细胞壁肽聚糖的合成,或被转化为l型氨基酸或丙酮酸等进入胞内代谢。研究结果中,健康儿童肠道菌群代谢的D-丙氨酸代谢途径活跃度高于性早熟患者,说明健康儿童体内拥有更多分解D型氨基酸的菌群,以降低D型氨基酸对细胞产生的毒性。
通过以上结果可发现,性早熟和健康儿童的肠道菌群差异较大,健康儿童体内益生菌含量高于性早熟患者,两组群体中丙氨酸代谢也存在一定的差异。
第二方面,本申请还提供了一种产品,具体包括益生菌制剂:
所述益生菌制剂的制备原料按照质量分数包括:
混合乳杆菌35%-45%、链球菌30%-40%、葡萄糖5%-10%、低聚葡萄糖1%-5%、低聚果糖1%-5%及脱脂牛奶0.1%-1%。
在本申请实施例中,所述混合乳杆菌包括嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌及瑞士乳杆菌,其中:
所述嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌及瑞士乳杆菌的质量份数比例为1:1:1。
嗜酸乳杆菌在人体整个胃肠道中起调整肠道菌群平衡、抑制肠道不良微生物增殖的作用。采用MRS固体培养基(0.1%琼脂粉)进行菌种的活化培养,最适生长温度为37℃。将活化的菌种挑取单菌落,接种到MRS液体种子瓶(pH值6.2±0.1),37℃的恒温厌氧培养箱中培养24h。然后将菌种按2%的接种量接种到含有5%浓度葡萄糖的发酵培养瓶中进行发酵培养。
培养基中葡萄糖单独添加。培养基的其他成分配制完成后,调节pH值。在高压锅中进行121℃条件下,灭菌20min。待培养基恢复至50~60℃左右时,加入灭菌的葡萄糖母液,使葡萄糖的终浓度为20g/L。然后将培养基放置在实验台上备用。因为在高温条件下,葡萄糖和培养基中的物质发生美拉德反应,即是羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)间的反应,生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素。因此,将葡萄糖和培养基其余成分单独灭菌,待恢复低温后再混合使用。
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum),研究显示发酵乳杆菌是肠道中的优势菌群,它对致病菌具有一定的拮抗作用、具有抗氧化作用并且对α-低聚半乳糖也有的降解作用。另外有研究报道发酵乳杆菌的转糖基活性也较高,能够降低乳糖含量,缓解乳糖不耐症。因此菌种活化采用MRS液体培养基,但是在发酵培养过程中,采用乳糖作为碳源的MRS液体培养基进行放大培养,以获取足够的菌体数量。
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的培养方法采用与嗜酸乳杆菌相同的培养方法。
在本申请实施例中,所述链球菌为嗜热链球菌。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)为革兰氏阳性细菌、兼性厌氧、不运动,无内生孢子。该菌是一种乳酸菌,在酸奶中可以发现其存在。嗜热链球菌可以将乳制品中的乳糖酵解为乳酸,从而可以缓解对乳糖敏感的人群,使乳糖不耐受的人群也可以从乳制品中获得营养。
采用M17固体培养基(0.1%琼脂粉)进行菌种的活化培养,最适生长温度为42℃。将活化的菌种挑取单菌落,接种到M17液体种子瓶(pH值7.2±0.1),42℃的恒温厌氧培养箱中培养24h。然后将菌种按2%的接种量接种到含有2%浓度乳糖的发酵培养瓶中进行发酵培养。
MRS液体培养基成分(g/L):
M17液体培养基成分(g/L):
培养基中乳糖单独添加。培养基的其他成分配制完成后,调节pH值为7.2±0.1。在高压锅中进行121℃条件下,灭菌20min。灭菌结束后打高压锅温度和压力恢复至安全范围内去除培养基放置,待培养基恢复至50~60℃左右时,加入灭菌的乳糖母液,使乳糖的终浓度为5g/L。然后将培养基放置在实验台上备用。
益生元(Prebiotics)是天然食物中不易被消化的多糖成分,但是可被消化系统中的益生菌(Probiotics)利用,能够促进菌群生长扩张和代谢生成短链脂肪酸。益生元主要有低聚果糖、低聚半乳糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、大豆低聚糖等。在大肠中,益生元对乳杆菌具有选择性作用外,还通过发酵影响肠功能的许多方面。短链脂肪酸是益生元分解的主要产物。通过刺激细菌的生长和发酵,益生元会影响排便习惯,并具有轻度通便作用。
在本申请实施例中,所述益生菌制剂的制备方法包括:
将混合乳杆菌35%-45%、链球菌30%-40%、葡萄糖5%-10%、低聚葡萄糖1%-5%、低聚果糖1%-5%按照配比,混合制成混合液,然后在5000rpm的条件下离心15min,弃去上清液,收集浓缩菌体。用4℃储存的无菌的生理盐水,将菌体进行洗涤处理,然后5000rpm离心15min,重复三次;在浓缩菌体中加入等体积的脱脂牛奶作为保护剂,然后依次进行梯度降温。分别在4℃放置4h,-20℃放置12h,-80℃放置12h,最后将预冷好的菌体放入冻干机,进行真空冷冻干燥。将以上各个成分按比例混匀,制成含有益生菌和益生元的混合粉末制剂。
由于以上实施方式均是在其他方式之上引用结合进行说明,不同实施例之间均具有相同的部分,本说明书中各个实施例之间相同、相似的部分互相参见即可。在此不再详细阐述。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后,将容易想到本申请的其他实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化,这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的,本申请的真正范围和精神由权利要求的内容指出。
以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。
Claims (8)
1.一种肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,其特征在于,所述微生物包括特征菌属,用于评估儿童性早熟,其中:
所述特征菌属包括:乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属。
2.根据权利要求1所述的肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,其特征在于,所述特征菌属还包括:拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属。
3.根据权利要求1所述的肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,其特征在于,所述乳杆菌属、链球菌属、奈瑟氏菌属及巴斯德氏菌属的相对丰度下降。
4.根据权利要求2所述的肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,其特征在于,所述拟杆菌属、肠杆菌属及假单胞菌属的相对丰度上升。
5.根据权利要求1所述的肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,其特征在于,所述应用还包括益生菌制剂:
所述益生菌制剂的制备原料按照质量分数包括:
混合乳杆菌35%-45%、链球菌30%-40%、葡萄糖5%-10%、低聚葡萄糖1%-5%、低聚果糖1%-5%及脱脂牛奶0.1%-1%。
6.根据权利要求5所述的肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,其特征在于,所述混合乳杆菌包括嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌及瑞士乳杆菌,其中:
所述嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌及瑞士乳杆菌的质量份数比例为1:1:1。
7.根据权利要求5所述的肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,其特征在于,所述链球菌为嗜热链球菌。
8.根据权利要求5所述的肠道菌群微生物在儿童性早熟评估中的应用,其特征在于,所述益生菌制剂的制备方法包括:
将所述混合乳杆菌、链球菌、葡萄糖、低聚葡萄糖及低聚果糖混合成混合液;
将所述混合液经离心、弃去上清液后得到浓缩菌液;
向所述浓缩菌液中加入脱脂牛奶后梯度降温得到预冷菌液;
将所述预冷菌液真空冷冻干燥得到益生菌制剂。
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CN112820348A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-05-18 | 宁夏医科大学总医院 | 血浆代谢在银屑病患者皮肤微生物区系新的相互作用的应用 |
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2020
- 2020-02-20 CN CN202010105207.0A patent/CN111235211A/zh not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN112820348A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-05-18 | 宁夏医科大学总医院 | 血浆代谢在银屑病患者皮肤微生物区系新的相互作用的应用 |
CN112820348B (zh) * | 2021-01-06 | 2023-04-07 | 宁夏医科大学总医院 | 一种检测血浆代谢与银屑病患者皮肤微生物区系相互作用的方法 |
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