CN110176305A - 一种利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，包括肠道菌群样品采集、样本处理及质量控制、检测结果解读及后处理。通过整合和开发先进检测和诊断技术，诊断结果对人体健康稳态进行评估，基于检测装置的检测精确度高、标准数据库容量大、专属于个人的健康指导意见，体现了本发明可预测、可预防的可操作性，将会引领健康产业的发展方向。

Description

一种利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法

技术领域

本发明属于生物治疗及检测领域，特别涉及一种利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法。

背景技术

肠道微生物常认为是和消化、营养作用联系在一起的。对人类来说，植物中的纤维素和半纤维素类多糖是无法消化的，而肠道菌群中的拟杆菌等细菌则具有一系列多糖消化的酶，来分解这些多糖，从而为人类提供能量。除此之外，肠道菌群通过发酵还能产生短链脂肪酸和维生素K供人体吸收，同时一些金属离子，如钙、镁、铁等，也可通过肠道菌群被重新吸收。然而随着研究的深入，人们逐渐发现，肠道菌群不只在消化过程发挥作用，它和人体健康有着极为密切的联系。

肠道菌群和人体的代谢疾病具有重要关系。肠道菌群失衡可能是造成肥胖、糖尿病等多种多种代谢异常的重要原因之一。例如，若长期进食高脂、高糖食物，可造成肠道菌群中条件致病菌比例增加，而共生菌比例下降，从而使得食物中摄取的能量更容易转化为脂肪累积于皮下，造成肥胖。此外，低度炎症还能促使机体对胰岛素相应程度下降，造成胰岛素抵抗，进而发展为糖尿病，因此，如何精确、快捷地进行测序菌群，进而对治疗有极大的作用。

发明内容

为了解决现有技术中不能精确、快捷地进行测序菌群的技术难题，本发明提供了一种利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，具体步骤为：

(1)肠道菌群样品采集

将采集的待测粪便用棉签涂抹少量，不超过1/2的棉签长度，将棉签放置在采集试剂盒中旋紧盒盖，进行信息标记后，备用检测；

(2)样本处理及质量控制

步骤(1)中待测样本处理时，采用高通量基因测序进行样本处理，依次经过菌群基因组DNA提取与检测、PCR扩增与检测、产物定量和均一化、产物纯化、二轮PCR加接头、MiSeq上机测序、生物信息学分析，完成样本中菌群的测序，观察测序质量，当覆盖度超过99.9％，判断菌群测序结果可靠，进入后续分析工序；

(3)检测结果解读及后处理

多样性分析获得该样本中测得所有细菌种类、数量和比例，用于确定该样本人体菌群健康等级情况；将获得数据与标准数据库比对，确定该样本与健康人群、疾病人群的相似性，最终评估该样本受检者的健康情况，并进行后处理预估或者就医处理。

作为改进，步骤(1)中的信息标记包括采集样品对象的生活作息、用药情况、个人病史、家族病史的数据收集。

作为改进，步骤(2)中PCR扩增以基因组DNA为模板，利用特异性引物扩增16s rDNA的V4区域，样本扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳检测产物的纯度和特异性，应在相应片段大小位置出现一条清晰且明显的主条带，在其它位置不应有任何明显杂带，并进行精确定量和纯化回收。

作为改进，步骤(2)中菌群基因组DNA提取后需要全部采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，当出现一条集中且明显的基因组主条带时，才能进入后续PCR扩增流程。

作为改进，所述试剂盒选用-htp Bead Plate试剂盒。

作为改进，步骤(3)中在进行检测结果解读时，健康样本库中不同年龄段肠道菌群种类、数量不同，根据步骤(3)获得的测量数据，进行比对确定年龄段，再依次根据测量的肠道菌群与UC患者肠道菌群种类、肠道息肉患者菌群种类、结肠癌患者菌群种类、糖尿病患者菌群种类、动脉粥状硬化患者菌群种类、高血脂及高血压患者菌群种类、抑郁症患者菌群种类、肥胖菌群种类、类风湿性关节炎患者菌群种类、心脏病患者菌群种类进行比对，得出与上述患者菌群相似度分析报告。

作为改进，步骤(3)中根据患者菌群相似度分析报告，获得上述疾病风险预测评估报告，并对相关结果进行从饮食、益生菌、益生元、运动和心理方面给出健康管理方案。

有益效果：本发明提供的利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，通过整合和开发先进检测和诊断技术，诊断结果对人体健康稳态进行评估，基于检测装置的检测精确度高、标准数据库容量大、专属于个人的健康指导意见，体现了本发明可预测、可预防的可操作性，将会引领健康产业的发展方向。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为本发明样本处理及质量控制的基本流程图。

图2为本发明不同年龄健康人群肠道菌群比较对比图。

图3为本发明百岁老人与高度健康人群肠道菌群比较图。

图4为本发明的肠炎小鼠模型与对照小鼠肠道菌群门水平分类对比图。

图5为本发明VSL#3及CLA治疗对病人肠道菌群的改变分析图。

图6为本发明健康人与肠息肉患者种属水平肠道菌群丰度对比分析图。

图7为本发明结肠癌患者(SWP)与健康人(SWC)区别最大的几个肠道菌种丰度对比分析图。

图8为本发明健康人群与T2D人群的肠道菌群关联群组示意图。

图9为本发明健康人群与T2D人群的肠道菌群差异示意图。

图10为本发明肠道菌群与动脉粥样硬化示意图。

图11为本发明高血压大鼠与健康大鼠肠道菌群的差异对照图。

图12为本发明不同国家肠道主要菌群组成示意图。

图13为本发明肠道菌群抑制风湿关节炎抑制机理示意图。

图14为本发明肠道菌群与自闭症关系1示意图。

图15为本发明与自闭症关系2示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一种利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，具体步骤为：(1)肠道菌群样品采集：将采集的待测粪便用棉签涂抹少量，不超过1/2的棉签长度，将棉签放置在采集试剂盒中旋紧盒盖，进行信息标记后，备用检测；(2)样本处理及质量控制：步骤(1)中待测样本处理时，采用高通量基因测序进行样本处理，依次经过菌群基因组DNA提取与检测、PCR扩增与检测、产物定量和均一化、产物纯化、二轮PCR加接头、MiSeq上机测序、生物信息学分析，完成样本中菌群的测序，观察测序质量，当覆盖度超过99.9％，判断菌群测序结果可靠，进入后续分析工序；(3)检测结果解读及后处理：多样性分析获得该样本中测得所有细菌种类、数量和比例，用于确定该样本人体菌群健康等级情况；将获得数据与标准数据库比对，确定该样本与健康人群、疾病人群的相似性，最终评估该样本受检者的健康情况，并进行后处理预估或者就医处理。

可做选择地，健康样本库中不同年龄段肠道菌群种类、数量不同，根据步骤(3)获得的测量数据，进行比对确定年龄段，再依次根据测量的肠道菌群与UC患者肠道菌群种类、肠道息肉患者菌群种类、结肠癌患者菌群种类、糖尿病患者菌群种类、动脉粥状硬化患者菌群种类、高血脂及高血压患者菌群种类、抑郁症患者菌群种类、肥胖菌群种类、类风湿性关节炎患者菌群种类、心脏病患者菌群种类进行比对，得出与上述患者菌群相似度分析报告。步骤(3)中，根据患者菌群相似度分析报告，获得上述疾病风险预测评估报告，并对相关结果进行从饮食、益生菌、益生元、运动和心理方面给出健康管理方案获得上述疾病风险预测评估报告。

步骤(1)中的信息标记包括采集样品对象的生活作息、用药情况、个人病史、家族病史的数据收集。

步骤(2)中PCR扩增以基因组DNA为模板，利用特异性引物扩增16s rDNA的V4区域，样本扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳检测产物的纯度和特异性，应在相应片段大小位置出现一条清晰且明显的主条带，在其它位置不应有任何明显杂带，并进行精确定量和纯化回收。

步骤(2)中菌群基因组DNA提取后需要全部采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，当出现一条集中且明显的基因组主条带时，才能进入后续PCR扩增流程。所述试剂盒选用-htp Bead Plate试剂盒。

下面以具体的实施例进行说明。

1建立健康样本库

选择不同年龄段的人群建立健康样本库，样本选自全国不同区域，年龄阶段涵盖0-100岁人群，一期目标为1万例，目前已经完成3000例采样。样本菌群测序在MiSeq测序仪上完成，其具有测序速度快，数据准确的优点，可实现300bp×2的测序长度，是肠道菌群测序的利器。后续的肠道菌群多样性分析则采用了国际先进算法，已将冗长繁杂的菌群多样性分析过程进行优化，将目前业内普遍的几个工作日的分析过程缩短至几个小时，提高了分析效率。除此而外，目前本发明中对菌群多样性的解读方式，可将低丰度序列干扰噪音降到最低，最真实地还原样本中菌群结构信息。

样本菌群测序分析已经完成，主要包括四世同堂家庭中青年样本(高度健康人群)、0-6岁婴幼儿群体、6-12岁少年群体、12-18岁青少年群体、18-30岁青年群体、30-60岁中青年群体、60以上老年人群体以及百岁老人群体等。以上所有群体均需经过严格筛选，确定无重大病史和家族病史，方可进入健康样本库。

将不同年龄阶段健康群体样本进行汇总分析发现，不同年龄阶段群体具有特定的肠道菌群特点，如幼年群体(0-12岁)肠道中双歧杆菌的比例显著高于其他群体，而百岁老人群体中的乳杆菌的比例则高于其他群体等见图2。

百岁老人群体和高度健康群体的肠道菌群进行比较后发现，高度健康群体肠道中拟杆菌属和普雷沃氏菌属的比例高于百岁老人群体，而百岁老人群体的大肠杆菌、乳杆菌的比例高于高度健康群体见图3。

2通过检测获得肠道菌群进行风险预估

(1)肠道菌群与溃疡性结肠炎风险评估分析

溃疡性结肠炎(UC)是一组病因和发病机制不明的肠道慢性非特异性炎症性疾病。近年来许多研究都表明肠道菌群在UC的发病机制中起到了重要的启动作用，环境、饮食、精神心理等因素也可能是发病的重要诱因。

许多研究发现，UC发作期与健康对照组粪便菌群比较，主要原籍菌双歧杆菌、真杆菌、类杆菌和消化链球菌都呈有意义的减少，双歧杆菌检出率尤其低(图4)。李雄彪等研究发现，活动期UC患者肠道厌氧菌、革兰阴性菌和乳酸杆菌数量都显著减少，此外肠道菌群对肠道通透性改变的影响也引起了人们的注意。肠屏障功能受损，通透性增高，肠腔内的抗原、内毒素等促炎症物质进入肠黏膜固有层，诱发免疫反应。临床中应用激素、免疫抑制剂治疗UC有效，亦可说明肠道免疫功能耐受性降低，导致机体肠道免疫功能增强。

肠道菌群状态稳定是“健康肠道”的一个特征；而具有UC遗传易感性的患者，其维持肠道微环境的能力减弱，导致其肠道菌群状态不稳定，因此，双歧杆菌、乳杆菌的减少，将明显削弱肠黏膜对各种致病因素的防御作用。益生菌可外源性补充UC患者肠道中减少的菌群种类，重新恢复肠道菌群平衡，提高黏膜防御屏障，阻止致病菌的定植和入侵；提高抗炎细胞因子水平；与病原菌竞争性黏附于上皮细胞，促进上皮细胞分泌黏液，使其在黏膜和微生物之间形成保护层，防止栖生菌易位；增强巨噬细胞对病原菌的吞噬以及非T细胞依赖性IgA的分泌。近年来人们应用益生菌治疗UC患者已经取得了令人鼓舞的结果，研究结果表明益生菌不但可以治疗UC，而且能预防其复发。

UC小鼠接受益生菌产品VSL#3和共轭亚油酸饲喂30天后(图5)，其肠道菌群结构相对于对照组发生了显著性改变，VSL#3饲喂小鼠的菌群多样性明显降低(A)，Margalef丰富度指数和Shannon多样性指数也提示了类似的变化。

(2)肠道菌群与肠道息肉风险评估分析

肠息肉常见于结肠和直肠，实际是从肠道黏膜表面突出到肠腔的隆起性病变，其发生率可随年龄增加而上升。根据息肉的性质可分为肿瘤性息肉和非肿瘤性息肉，而肿瘤性息肉又能够分为管状腺瘤、绒毛状腺瘤和混合型腺瘤等。肿瘤性息肉与肠道肿瘤的发生密切相关，存在不同程度的恶变率，可以看作癌前期病变。

腺瘤性肠息肉患者幽门螺杆菌感染率高，导致结肠癌发病率增高。日本最新的一项研究显示，有幽门螺杆菌感染者比无幽门螺杆菌感染者更容易存在腺瘤性肠息肉，抗幽门螺杆菌抗体阳性约42.0％被检出管状腺瘤。显著高于阴性者的19.0％；抗幽门螺杆菌抗体阳性者结肠镜检查完全正常者(32.0％)所致ARC比例明显低于抗幽门螺杆菌抗体阴性者(5.0％)，统计学有显著性差异。因此，幽门螺杆菌感染与腺瘤性肠息肉可能存在因果相关性。幽门螺杆菌的感染增加了结肠直肠腺瘤和腺癌风险。幽门螺杆菌的感染与大肠腺瘤关系密切，结肠息肉、结肠癌病理上有不少相似之处，都是肠黏膜异常增生形成，幽门螺杆菌感染一肠黏膜增生一腺瘤性肠息肉一结肠腺癌关系轴显示它们之间可能存在的的密切关系，降低幽门螺杆菌感染率可能可以阻断肠息肉向结肠癌转化的恶化倾向。

双歧杆菌是机体肠道内最重要的生理性细菌，可以调节肠道菌群的代谢活动，降低具有致癌性的细菌酶的火星，如硝基还原酶、β-葡萄糖苷酶和偶氮还原酶等，使突变剂和致癌剂不能在体内活化滞留。此外，它还能及或机体免疫系统中的巨噬细胞和NK细胞，使之分泌多种一定量的细胞独行效应分子，如IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ以及NO等。因此双歧杆菌可以防治多种肿瘤的发生与发展。Sekine等的研究证实，婴儿型双歧杆菌的完整肽聚糖对小鼠皮下一直的Meth A纤维肉瘤的生长具有明显的阻抑作用。此外，青春型双歧杆菌在体内能通过诱导肿瘤细胞凋亡来达到拮抗大肠癌生长的目的。

(3)肠道菌群与结肠癌风险评估分析

消化道恶性肿瘤——结直肠癌为例，结直肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生恶性病变，死亡率较高。全世界范围结直肠癌的发病率均处于恶性肿瘤的第三位，欧美国家发病率处于第二位。据国际癌症研究组织(IARC)提供的数据显示，全球每年有一百万结直肠癌新增病例，亚洲的经济发达地区，结直肠癌发病率也迅速增长，接近欧美国家水平。随着生活水平的提高，饮食习惯改变，总体发病率也呈上升趋势，据调查2000年至2005年间发病人数增加12万，男性增加19.1％，女性增加17.7％。

研究发现，大肠癌患者和健康人的肠道菌群不同，但不同研究之间结果相差悬殊，科学家难以确定大肠癌患者肠道菌群属于异常或微生态失调(图7)。常见的结果是发现大肠癌患者肠道菌群有高水平的梭菌属，梭菌属常见于健康人口腔，在肠道内比较少见。许多研究发现，大肠癌患者肠道内大肠杆菌水平也高于健康人。给免疫缺陷小鼠接种大肠杆菌或粪肠球菌都会形成结肠炎，但只有接种大肠杆菌的动物会出现肿瘤。接种大肠杆菌的动物如果没有产生炎症反应，则不会形成肿瘤，说明炎症反应是重要条件。Jobin发现，如果将肠道内炎症环境改变的大肠杆菌基因去除，则促癌作用消失，说明炎症是启动大肠杆菌促癌的诱因。这些动物实验结果说明，肠道细菌是大肠癌产生的重要因素。

(4)肠道菌群与糖尿病风险评估分析

Ⅱ型糖尿病(Type 2diabetes，T2D)是一种由遗传和环境因素共同引起的复杂内分泌疾病，曾有研究表明，2型糖尿病可能与肠道菌群存在相关性，但一直缺乏全面、系统的研究成果来支持这一论断。

根据345个中国人的肠道微生物测序结果鉴定出大约6万个与T2D相关的分子标记及其丰度，将T2D患者和非T2D患者体内的宏基因组进行归纳、提炼和分类汇总，结果显示T2D人群肠道菌群与健康人群存在显著的差异，主要以拟杆菌属为标志菌群，而健康人群中标志菌群为双歧杆菌、瘤胃球菌和普雷沃氏菌见图8。

从52484个分子标记中鉴定出的7个MLGs关系图谱通过分析，研究人员从物种组成上对T2D相关的微生物进行深入解读，发现有益菌群和有害菌群之间存在拮抗关系，这在梭菌的不同菌群间表现尤为明显(图9)。研究提示：如果人体内缺少了一种产丁酸盐细菌(butyrate-producing bacteria)，就容易患上T2D。研究者还发现在T2D患者的结肠内存在机会致病菌增多以及微生物基因组中耐氧化压力基因增多的现象，这些也都有助于增加肠道内的炎症反应。

(5)肠道菌群与动脉粥状硬化、高血压、高血脂风险评估分析

动脉粥样硬化在心脑血管疾病的进程中是一个重要的病理生理过程。细菌是该病的一种致病因素。已有研究发现，在有症状的动脉粥样硬化患者肠道中，存在一些菌属的变化，如柯林斯菌属增多，而在健康对照者中罗氏菌属增多。这种动脉硬化患者与正常人群肠道的菌属差异，提示肠道菌群的变化可能与动脉硬化相关(图10)。肠道菌群可能改变一些物质的代谢产物，例如，氧化三甲胺(TMAO)是食物中胆碱的代谢产物，而胆碱主要存在于鸡蛋、肝脏、牛肉和猪肉中。胆碱被肠道内细菌消化后，可以代谢出一种气体，即三甲胺(trimethylamine)。三甲胺再在肝脏中经黄素加氧酶代谢成TMAO，随之进入血循环。饮食磷脂酰胆碱所致的TMAO产生取决于肠道微生物的代谢，研究表明TMAO水平增高与主要心脑血管偶发不良事件危险增加相关，TMAO可在通过传统危险因素和血液检测无法识别的人群中作为预测将来心脏病发作、卒中和死亡风险的一种准确筛查工具。

证据显示，血压升高与肠道菌群失调有关，自发性高血压小鼠的微生物丰富程度、多样性和均匀性均显著减少，厚壁菌门/拟杆菌比值增加，这些变化还伴随着产醋酸盐和产丁酸盐细菌的减少(双歧杆菌、粪球菌、假丁酸弧菌等乳酸和丁酸产生菌)而链球菌的数量显著高于健康大鼠，暗示上述菌群与高血压的发生存在相关性(图11)，提示纠正肠道菌群的饮食干预可能会成为高血压的新营养疗法。另外，研究者还发现，高血压患者存在相似的有害菌群模式，即与对照组相比，菌群丰富程度和多样性均较少。相似的肠道菌群变化还见于长期输注血管紧张素II的小鼠模型中，菌群丰富度减少和厚壁菌门/拟杆菌比值增加最明显。在这个模型中，研究者评估了口服二甲胺四环素在肠道菌群恢复中的有效性。结果这种方法除外能降低升高的血压，还能通过降低厚壁菌门/拟杆菌比值而使受试者的肠道菌群再平衡。

(6)肠道菌群与肥胖风险评估分析

研究证明，肠道菌群与肥胖的发生有着千丝万缕的关系，而且比"肥胖基因"扮演着更为重要的角色。阴沟肠杆菌是第一个被确定与肥胖有关的细菌，而在此之前，很多科学家也在分析哪些细菌和肥胖有关，但都是一个大致分类，比如研究发现，肥胖者肠道内游弋着一种与苗条者体内迥异的细菌。在肥胖人群中，厚壁菌增加，拟杆菌减少。但当肥胖人群体重减少时，厚壁菌数量下降，拟杆菌比例上升。

这里所说的厚壁菌主要是芽孢杆菌、葡萄菌、梭菌等一些条件致病菌。研究人员认为，这种“肥胖细菌”从食物吸收了过多的能量，能量被身体吸收并沉积起来成为多余的脂肪，肥胖便形成了。将肥胖大鼠肠道的高比值硬壁菌与拟杆菌移植给无菌小鼠，成功地复制出肥胖表型，而且鉴定出3种肥菌——颤杆菌和梭菌属14a簇及4簇。

科学家分析了世界各地的23种不同人群共1020人的肠道菌群，发现高纬度(赤道以北)寒冷地区的居民体内硬壁菌的比例高于低纬度(赤道以南)炎热地区的居民，并画出一张标识厚壁菌门(蓝色)和拟杆菌门(红色)比例的地图(图12)。从图上可以看出，欧洲人的厚壁菌门占优势，而中国人、南美人、南非人的拟杆菌门占优势，美国人的厚壁菌门似乎少于欧洲人，而拟杆菌门又少于中国人、南美人、南非人。有趣的是，非洲裔美国人的肠道菌跟其他美国人一样，但与土著非洲人不同。

拟杆菌可抑制脂肪累积，并促进瘦素的分泌。拟杆菌被越来越多地认为是人体的瘦菌。当把这两种肠菌不同的小鼠关在一个笼子里饲养时，肥菌不能取代瘦菌，而瘦菌却能入侵肥菌，结果有瘦菌的小鼠依然消瘦，而有肥菌的小鼠也不会变胖。进一步分析表明，瘦鼠肠道的短链脂肪酸增加，可抑制脂肪在脂肪组织的积累，能量消耗，促进瘦素(饱腹感激素)分泌。菌群分析显示，具有入侵性的瘦菌是拟杆菌(一个大类)。其他研究也证明，小鼠肠道的拟杆菌确实与消瘦相关。

(7)肠道菌群与类风湿性关节炎风险评估分析

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性滑膜炎、关节软骨及骨质破坏，关节畸形和功能丧失为特征的自身免疫性疾病，RA是临床上较为多见的疾病，发病时间长，损害性大，尚无确切可靠治疗手段，其发病被认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果，但具体机制依然不清。近年来的研究显示肠道菌群失调可能是影响RA发生发展的一个重要的环境因素。研究证明RA动物模型的肠道内确实存在菌群失调，RA患者的肠道菌群也发生了改变，肠道菌群的正常定植与免疫系统的发育和免疫耐受的形成密切相关，肠道菌群失衡会改变上皮和粘膜通透性，使机体丧失免疫耐受功能，致敏免疫细胞和抗原在关节处聚集，导致类风湿关节炎等疾病的发生。

研究发现某种嗜血杆菌(Haemophilus sp)在RA患者中呈现相对缺失的状态，并且其丰度与RA自身免疫抗体的滴度成反比。而唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)在RA患者的牙菌斑、唾液和粪便中均显著富集，尤其是在病情高度活动患者中表现得尤为明显。研究人员还发现了口腔与肠道菌群功能的一致性，并揭示这种菌群异常在RA的主要病理生理机制如瓜氨酸环化异常中具有重要的作用，可能直接参与疾病发生。

(8)肠道菌群与情绪的风险评估分析

目前，已经有很多研究表明，细菌及其“副产品”可主要通过激活神经纤维，或者通过调节宿主机体的免疫激素、神经化学系统，对大脑产生的影响。很可能辅助着神经、大脑生物化学、行为，特别是与压力，焦虑和抑郁相关的正常发育。

血液中5-羟色胺水平下降会让人情绪低落，人体90％的5-羟色胺来自消化道，研究证实肠道某些细菌对于肠道5-羟色胺的产生贡献巨大。同时，如果肠道内某些细菌缺乏，肠道5-羟色胺的产量也大幅降低，也就是说一些细菌是影响人体心情的重要因素(图14-15)。肠道菌群能够释放不同的化学物质，使人感到愉悦或者不舒服，进而影响人的情绪和行为。例如摄入乳酸菌可以通过迷走神经进而调节中枢GABA受体影响人体的免疫和情绪变化。相对应地，人的情绪也可以影响肠道菌群的状态，研究表明长期处在压力下会导致小鼠肠道厌氧菌增多和肠道菌群多样性降低。不健康饮食引起的肠道菌群变化也与抑郁症发病有着密切的关系。

3根据风险评估分析内容制定合适个人的健康管理方案

受检者的肠道菌群数据在一定程度上对个人的健康管理有指导作用，可以通过人为地摄入一些富含营养的益生菌产品进行调节菌群的数量，提高有益菌含量，抑制有害菌生长。同时，在进行调整饮食方式调节肠道菌群，增加肠道菌群的多样性和有益菌的数量，尽量少吃高脂和高蛋白食物，长食富含活性益生菌的酸奶，多吃一些富含益生元的食物，慎用抗生素及保持乐观心态等多方面的进行制定合理的健康管理方案。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，其特征在于：具体步骤为：

(1)肠道菌群样品采集

将采集的待测粪便用棉签涂抹少量，不超过1/2的棉签长度，将棉签放置在采集试剂盒中旋紧盒盖，进行信息标记后，备用检测；

(2)样本处理及质量控制

步骤(1)中待测样本处理时，采用高通量基因测序进行样本处理，依次经过菌群基因组DNA提取与检测、PCR扩增与检测、产物定量和均一化、产物纯化、二轮PCR加接头、MiSeq上机测序、生物信息学分析，完成样本中菌群的测序，观察测序质量，当覆盖度超过99.9％，判断菌群测序结果可靠，进入后续分析工序；

(3)检测结果解读及后处理预估

多样性分析获得该样本中测得所有细菌种类、数量和比例，用于确定该样本人体菌群健康等级情况；将获得数据与标准数据库比对，确定该样本与健康人群、疾病人群的相似性，最终评估该样本受检者的健康情况，并进行后处理预估或者就医处理。

2.根据权利要求1所述的利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，其特征在于：步骤(1)中的信息标记包括采集样品对象的生活作息、用药情况、个人病史、家族病史的数据收集。

3.根据权利要求1所述的利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，其特征在于：步骤(2)中PCR扩增以基因组DNA为模板，利用特异性引物扩增16s rDNA的V4区域，样本扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳检测产物的纯度和特异性，应在相应片段大小位置出现一条清晰且明显的主条带，在其它位置不应有任何明显杂带，并进行精确定量和纯化回收。

4.根据权利要求1所述的利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，其特征在于：步骤(2)中菌群基因组DNA提取后需要全部采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，当出现一条集中且明显的基因组主条带时，才能进入后续PCR扩增流程。

5.根据权利要求1所述的利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，其特征在于：所述试剂盒选用Power-htp Bead Plate试剂盒。

6.根据权利要求1所述的利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，其特征在于：步骤(3)中在进行检测结果解读时，健康样本库中不同年龄段肠道菌群种类、数量不同，根据步骤(3)获得的测量数据，进行比对确定年龄段，再依次根据测量的肠道菌群与UC患者肠道菌群种类、肠道息肉患者菌群种类、结肠癌患者菌群种类、糖尿病患者菌群种类、动脉粥状硬化患者菌群种类、高血脂及高血压患者菌群种类、抑郁症患者菌群种类、肥胖菌群种类、类风湿性关节炎患者菌群种类、心脏病患者菌群种类进行比对，得出与上述患者菌群相似度分析报告。

7.根据权利要求6所述的利用高通量基因测序评估肠道菌群健康的方法，其特征在于：步骤(3)中，根据患者菌群相似度分析报告，获得上述疾病风险预测评估报告，并对相关结果进行从饮食、益生菌、益生元、运动和心理方面给出健康管理方案。