CN110724751A - 一种评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的方法。褐藻胶是一种人们经常食用的膳食纤维，可被肠道中的微生物利用，进而影响机体的健康。本发明通过对多个样本的肠道菌群测序结果与其对褐藻胶利用能力的相关性分析，提供了与褐藻胶利用能力显著相关的7种肠道微生物菌属。本发明提供的方法是利用粪便菌群的高通量测序结果，通过计算得分，评估肠道菌群对褐藻胶利用能力。使用本发明仅需要简单的数据分析，方便快捷，不需要进行实际的体内或体外发酵实验，节省了时间、人力和实验成本。

Description

一种评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的方法
技术领域
本发明涉及评估肠道菌群能力的方法，具体涉及一种利用肠道菌群的微生物测序结果评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的方法。
背景技术
褐藻胶(alginate)又称海藻胶，包括褐藻酸及其盐类，例如海藻酸钠、海藻酸钙等。褐藻胶在食品工业中的应用十分广泛，可作为增稠剂、稳定剂，是一种十分常见的食品添加剂。褐藻胶是褐藻的主要成分，占褐藻干重的40％。在人们食用海带(Laminariajaponica)等褐藻类食品时，也大量摄入了褐藻胶。近些年有很多研究报道证实，褐藻胶具有减肥、降血脂等功效，目前市场上也出现了以褐藻胶为主要功效成分的功能性食品。
研究认为，褐藻胶不能被人体上消化道中的消化液及消化酶降解，但可被肠道中的微生物利用，而肠道微生物产生的短链脂肪酸等有益的代谢物，可以直接或间接的影响人体能量的吸收、脂质的代谢等，从而影响机体的健康。因此，肠道菌群对褐藻胶的利用能力决定了食用褐藻胶对个体健康的影响。随着肠道菌群的测序技术的发展和普及，根据肠道菌群测序结果直接判断饮食对健康影响更具有现实意义，这对精准健康、产品开发都具有重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的方法，包括步骤：
S1、取粪便，提取基因组DNA，以所述基因组DNA为模板扩增16S rDNA 的V4区域，进行粪便菌群的测序；所述粪便为待评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的人或动物的粪便；
S2、根据测序结果，对粪便进行评估，计算得分；得分＝3000x-1000y，其中，x为所述测序结果所有微生物中正相关菌属的比例之和，y为所述测序结果所有微生物中负相关菌属的比例之和；所述正相关菌属包括：Veillonella(韦荣氏球菌属)、Catabacter、Candidatus_Soleaferrea、Alistipes(另枝菌属)、Barnesiella (厌氧杆菌属)；所述负相关菌属包括：Lactobacillus(乳杆菌)、Megasphaera (巨球型菌属)；
得分≥50则被认为具有较强的褐藻胶利用能力，即对褐藻胶的利用率≥30％；累计得分20～50则被认为具有中等的的褐藻胶利用能力，即对褐藻胶的利用率 15％～30％；累计得分≤20则被认为具有较弱或无褐藻胶利用能力，即对褐藻胶的利用率≤15％。
优选方式下，步骤S1所述扩增16S rDNA的V4区域使用的引物是16S rDNA V4区扩增的通用引物515F/806R，包括步骤：
S1、基因组DNA的提取
采用CTAB或SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl；
S2、PCR扩增
1)模板：稀释后的基因组DNA；
2)引物：根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物；
16S V4区引物为515F-806R；
3)酶和缓冲液：使用New England Biolabs公司的High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer，使用高效和高保真的酶进行PCR，确保扩增效率和准确性；
反应程序：98℃预变性1min；98℃，10sec；50℃，30sec；72℃，30sec， 30个循环；72℃，5min。PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；
S3、PCR产物的混样和纯化
根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1×TAE浓度2％的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物，割胶回收目标条带；产物纯化试剂盒使用的是 Thermo Scientific公司的GeneJET胶回收试剂盒。
文库构建和上机测序
使用
Figure RE-GDA0002301683270000031
DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用HiSeq进行上机测序。
信息分析流程
测序得到的原始数据(Raw Data)，存在一定比例的干扰数据(Dirty Data)，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据(CleanData)。然后基于有效数据进行OTUs(Operational taxonomic units)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的 OTUs和分类谱系的基本分析结果。其中，对于属水平的微生物相对比例结果将用于本发明的得分计算。
本发明的有益效果是：
随着测序技术越来越普及，通过肠道菌群测序结果推测饮食对健康的影响成为趋势。而本发明能够根据肠道菌群测序结果评估肠道菌群对褐藻胶利用能力，从而判断食用褐藻胶对机体的影响。使用本发明仅需要简单的数据分析，方便快捷，不需要进行实际的体内或体外发酵实验，节省了时间、人力和实验成本。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
一种评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的方法，该方法包括以下步骤：
1.取人或动物个体的粪便1g，冻存于-80℃冰箱，选择16SrDNA的V4区域进行扩增完成粪便菌群的测序。
2.参照指标菌体系，对个体粪便进行评估，其中正相关菌比例为X则加 3*X*1000分，负相关菌比例为Y则减Y*1000分，最终样本累计得分≥50则被认为具有较强的褐藻胶利用能力，累计得分20～50则被认为具有中等的的褐藻胶利用能力，累计得分≤20则被认为具有较弱或无的褐藻胶利用能力。
3.所述的正相关菌属包括：Veillonella(韦荣氏球菌属)、Catabacter、Candidatus_Soleaferrea、Alistipes(另枝菌属)、Barnesiella(厌氧杆菌属)。
4.所述的负相关菌属包括：Lactobacillus(乳杆菌)、Megasphaera(巨球型菌属)。
实施例1
正负相关菌属的筛选
S1、征集6名男性志愿者和6名女性志愿者，年龄在19～21岁，最近一个月内没有生病、没有吃过抗生素类药品；
S2、第一周，志愿者正常饮食，记录志愿者一周内的饮食情况，并保证饮食正常，没有暴饮暴食，没有吸烟酗酒行为等。
S3、分别取12名志愿者的粪便，1g粪便放入-80℃冰箱中保存，用于16S rDNA扩增及测序；另取1g粪便，制备粪便菌液，具体步骤如下：
将1g粪便与生理盐水按照重量比1:9的比例用漩涡振荡器混合均匀， 1200rmp离心3min，去除沉积物；8000rpm离心5min，再加入1ml体积分数25％甘油溶液均匀混合，得粪便菌液；将12名志愿者的粪便菌液保存于-80℃。
S4、让步骤S1所述12名志愿者连续食用两周海带，每人每天食用50g(湿重)海带，不固定食用时间，在志愿者食用海带期间，记录每天的饮食，确保志愿者正常饮食，不暴饮暴食、没有吸烟酗酒行为。
S5、食用两周海带后，再次分别取12名志愿者粪便，1g粪便入-80℃冰箱中保存，另取1g粪便按照步骤S3所述方法提取粪便菌液，将12名志愿者的粪便菌液保存于-80℃；
S6、将存于-80℃冰箱中的24个粪便样本，提取基因组DNA，以所述基因组DNA为模板选择16S rDNA的V4区域进行扩增测序，进行高通量测序分析，包括步骤：
按照北京诺禾致源科技股份有限公司的“扩增子测序和分析方法流程”进行
S61、基因组DNA的提取
采用CTAB或SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl；
S62、PCR扩增
1)模板：稀释后的基因组DNA；
2)引物：根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物；
16S V4区引物为515F-806R；
3)酶和缓冲液：使用New England Biolabs公司的High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer，使用高效和高保真的酶进行PCR，确保扩增效率和准确性；
Figure RE-GDA0002301683270000051
反应程序：98℃预变性1min；98℃，10sec；50℃，30sec；72℃，30sec， 30个循环；72℃，5min。PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测； PCR仪：Bio-rad T100梯度PCR仪；
S63、PCR产物的混样和纯化
根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1×TAE浓度2％的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物，割胶回收目标条带；产物纯化试剂盒使用的是 Thermo Scientific公司的GeneJET胶回收试剂盒。
文库构建和上机测序
使用
Figure RE-GDA0002301683270000052
DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用HiSeq进行上机测序。
信息分析流程
测序得到的原始数据(Raw Data)，存在一定比例的干扰数据(Dirty Data)，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据(CleanData)。然后基于有效数据进行OTUs(Operational taxonomic units)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的 OTUs和分类谱系的基本分析结果。其中，对于属水平的微生物相对比例结果将用于本发明的得分计算。
分别使用步骤S3和S6的粪便菌液，共24个样品，在体外厌氧发酵褐藻胶 48h，发酵过程如下：
取粪便菌液，置于38～40℃缓化，将粪便菌液与生理盐水按体积比1:9混匀，得稀释菌液；将所述稀释菌液与培养基按体积比1:9混合得0h发酵菌液，置于 37℃恒温厌氧箱发酵48h，得48h发酵菌液；其中所述培养基为DMM培养基或加褐藻胶的DMM培养基，所述DMM培养基为空白对照，每个培养基做3个平行；所述DMM培养基(1L)组分为：2g蛋白胨，2g酵母提取物，0.02g血红素，0.5g L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g胆酸盐，0.1g NaCl，0.04g K2HPO4，0.04g KH2PO4， 0.01g MgSO4·7H2O，0.01g CaCl2·6H2O，2g NaHCO3，2mL Tween-80，10μLvitamin K，余量为水；所述加褐藻胶的DMM培养基(1L)组分为：2g蛋白胨，2g酵母提取物，0.02g血红素，0.5g L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g胆酸盐，0.1g NaCl，0.04g K2HPO4，0.04gKH2PO4，0.01g MgSO4·7H2O，0.01g CaCl2·6H2O，2g NaHCO3， 2mL Tween-80，10μL vitaminK，3g褐藻胶，余量为水；所述生理盐水的浓度为 0.009g/ml
S7、褐藻胶利用率的测定：分别取褐藻胶浓度为0g/L、0.6g/L、1.2g/L、1.8g/L、2.4g/L和3g/L的褐藻胶水溶液0.5ml，冰浴预冷后分别加3ml四硼酸钠-硫酸溶液，震荡混合均匀，沸水浴5min，以冰浴冷却至25℃，再加入40μl间羟基甲苯，混合，25℃放置10min，在520nm波长下测定吸光度，作标准曲线。
取0h发酵菌液、48h发酵菌液各0.5ml，冰浴预冷后分别加3ml四硼酸钠- 硫酸溶液，震荡混合均匀，沸水浴5min，以冰浴冷却至25℃，再加入40μl间羟基甲苯，混合，25℃放置10min，在520nm波长下测定吸光度，根据标准曲线分别计算出48h发酵菌液和0h发酵菌液中褐藻胶的含量，再根据以下公式计算得出肠道菌群对褐藻胶的利用率；其中，所述四硼酸钠-硫酸溶液浓度为 0.0125mol/L(溶剂为硫酸)，间羟基联苯溶液浓度为1.5g/L(溶剂为5g/L NaOH 溶液)；
S8、利用24个样本的粪便的测序结果中各菌属所占比例和褐藻胶利用率结果作相关性分析，结果如表所示。共找出5个显著正相关的菌属和2个显著负相关的菌属，其中正相关菌属包括：Veillonella、Catabacter、 Candidatus_Soleaferrea、Alistipes、Barnesiella，负相关菌属包括：Lactobacillus、 Megasphaera。
表1.与褐藻胶利用率显著相关的菌属
“﹡”表示在0.05水平(双侧)上显著相关。
本发明用得分来评估褐藻胶利用能力，以24个样本的粪便菌属比例和褐藻胶利用率为基础数据，建立得分与正负相关菌的联系，经过反复摸索拟合，建立了通过各正负相关菌所占比例计算得分的公式：得分＝3000x-1000y，其中x 为各正相关菌属所占比例之和，y为各负相关菌属所占比例之和。
实施例2
评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的方法，包括步骤
S1、取待测试人类粪便各1g，提取基因组DNA，以所述基因组DNA为模板选择16SrDNA的V4区域进行扩增测序，进行高通量测序，本实施例共取6 个待测试粪便样品；
按照北京诺禾致源科技股份有限公司的“扩增子测序和分析方法流程”进行测序和扩增
S11、基因组DNA的提取
采用CTAB或SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl；
S12、PCR扩增
1)模板：稀释后的基因组DNA；
2)引物：根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物；
16S V4区引物为515F-806R；
3)酶和缓冲液：使用New England Biolabs公司的
Figure RE-GDA0002301683270000072
High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer，使用高效和高保真的酶进行PCR，确保扩增效率和准确性；
Figure RE-GDA0002301683270000073
Figure RE-GDA0002301683270000081
反应程序：98℃预变性1min；98℃，10sec；50℃，30sec；72℃，30sec， 30个循环；72℃，5min。PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测； PCR仪：Bio-rad T100梯度PCR仪；
S13、PCR产物的混样和纯化
根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1×TAE浓度2％的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物，割胶回收目标条带；产物纯化试剂盒使用的是 Thermo Scientific公司的GeneJET胶回收试剂盒。
文库构建和上机测序
使用
Figure RE-GDA0002301683270000082
DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用HiSeq进行上机测序。
信息分析流程
测序得到的原始数据(Raw Data)，存在一定比例的干扰数据(Dirty Data)，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据(CleanData)。然后基于有效数据进行OTUs(Operational taxonomic units)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的 OTUs和分类谱系的基本分析结果。其中，对于属水平的微生物相对比例结果将用于本发明的得分计算；
S2、根据测序结果，对粪便进行评估，计算得分；得分＝3000x-1000y，其中，x为所述测序结果中正相关菌属的比例，y为所述测序结果中负相关菌属的比例；所述正相关菌属包括：Veillonella(韦荣氏球菌属)、Catabacter、 Candidatus_Soleaferrea、Alistipes(另枝菌属)、Barnesiella(厌氧杆菌属)；所述负相关菌属包括：Lactobacillus(乳杆菌)、Megasphaera(巨球型菌属)；
得分≥50则被认为具有较强的褐藻胶利用能力，对褐藻胶的利用率≥30％；累计得分20～50则被认为具有中等的的褐藻胶利用能力，对褐藻胶的利用率 15％～30％；累计得分≤20则被认为具有较弱或无褐藻胶利用能力，对褐藻胶的利用率≤15％。
结果如表2所示，2、3号样本肠道菌群评估得分≥50则被认为具有较强的褐藻胶利用能力。5、6号样本肠道菌群评估得分20～50则被认为具有中等的褐藻胶利用能力。1、4号样本肠道菌群评估得分≤20则被认为具有较弱的或无褐藻胶利用能力。
结果验证：该6个粪便菌样品在体外厌氧发酵褐藻胶48h，经测定，2号和 3号样本对褐藻胶的利用率分别为33.3％、37.0％，对褐藻胶利用能力较强；5 号和6号样品对褐藻胶的利用率分别为26.6％、21.8％，对褐藻胶的降解能力中等；1号和4号样本对褐藻胶的利用率分别为9.54％、6.1％，对褐藻胶利用能力较弱；以上实验结果与得分评估结果一致，证明了本发明所述评估方法准确可靠。
表2粪便菌样本评估得分计算表
Figure RE-GDA0002301683270000091
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的方法，其特征在于，包括步骤：
S1、取粪便，提取基因组DNA，以所述基因组DNA为模板扩增16S rDNA的V4区域，进行粪便菌群的测序；所述粪便为待评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的人类或动物的粪便；
S2、根据测序结果，对粪便进行评估，计算得分；得分＝3000x-1000y，其中，x为所述粪便菌群测序结果中所有微生物中正相关菌属的比例之和，y为所述粪便菌群测序结果中所有微生物中负相关菌属的比例之和；其中，所述正相关菌属包括：Veillonella、Catabacter、Candidatus_Soleaferrea、Alistipes、Barnesiella；所述负相关菌属包括：Lactobacillus、Megasphaera；
得分≥50则被认为具有较强的褐藻胶利用能力，对褐藻胶的利用率≥30％；得分20～50则被认为具有中等的的褐藻胶利用能力，对褐藻胶的利用率15％～30％；得分≤20则被认为具有较弱或无褐藻胶利用能力，对褐藻胶的利用率≤15％。
2.根据权利要求1所述评估肠道菌群对褐藻胶利用能力的方法，其特征在于，步骤S1所述扩增16S rDNA的V4区域使用的引物是16S rDNA V4区扩增的通用引物515F/806R。
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