CN114786494A - 微生物组干预 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及调节和/或治疗伴侣动物例如犬科动物(例如狗)或猫科动物(例如猫)及其微生物组的一系列成分的组合物、监测工具和用于测定伴侣动物及其微生物组的健康的诊断方法。

Description

微生物组干预
技术领域
本公开涉及用于调节和/或治疗伴侣动物及其微生物组的组合物、组合物的用途、和方法、用于测定伴侣动物及其微生物组的健康的监测工具和诊断方法。
背景技术
微生物组描述为任何特定环境中的所有微生物，并且更具体地是该环境中微生物的组合遗传物质。在哺乳动物中，微生物存在于皮肤、肠道和口腔中，与其宿主存在共生关系；实际上这些微生物在宿主的健康中发挥着重要作用，其形成了防止外来微生物定殖的屏障，从而保护动物免受病原体的侵害，并在肠道内帮助分解营养物质，释放能量并产生生命所必需的维生素。
尽管病原微生物和益生菌微生物对其哺乳动物宿主的影响早已得到认可，但现在人们越来越认识到栖息微生物群的总群落组成、具体的微生物平衡和遗传潜力的影响。人类肠道微生物组的非侵入性研究主要使用粪便替代样品进行，这些样品特别是代表远端结肠，即肠道内细菌生长的主要部位。结肠中的细菌生长通过发酵进行，发酵为使用宿主未消化和吸收的膳食成分的过程，可用于影响肠道微生物群落和微生物组。
尽管认为母体或父体接种和环境接种以及细菌与免疫系统的相互作用的组合在免疫启动中发挥作用，以便未来识别病原微生物和肠道生理，但是微生物组的发展发生在哺乳动物出生后不久。基于对人类婴儿的研究，现在认为这些肠道微生物组的早期发展在整个生命后期影响健康。在出生后的几周和几个月内，多样性迅速增加，代表肠道微生物组发育的早期建立，认为在此阶段存在的微生物组和微生物群落是可塑性的或可改变的。在某种程度上由于早期生命阶段的这种前多样性(pre-diversity)发展阶段，幼犬(puppy)的肠道屏障发育不全，其中包括胃肠道微生物群以及组织学和肠道相关的免疫功能。因此，幼犬和青年犬(young dog)更容易出现胃肠道疾病，例如软质畸形粪便、腹泻、肠胃胀气和疾病。成熟过程中多样性的增加导致成年肠道微生物组的发展，其可抵抗甚至是益生菌等有益微生物的定植，因此成人微生物组在抵抗群落结构和肠道生态失调的巨大变化方面具有相对抵抗力(resilience)。成年动物的微生物组包含相似的细菌群落，但更多样化且发育良好，其具有经调整的群落结构，与其他生命阶段相比其代表更稳固且更具有抵抗力的微生物群，其中肠道微生物群表现出具有提高的抵抗力。
较老的狗和老年狗以及较老的人和老年人也更容易出现消化问题，例如腹泻和胃肠道感染，这些问题可能具有更高的严重性和更大的影响。这些胃肠道问题在某种程度上可能是由于肠道微生物组的恶化而引发的。
在成年狗中，随着时间的推移或由于环境和饮食因素导致组成发生更大规模的变化，也可引发肠道群落的改变。进入消化系统的感染原或由于饮食变化而改变微生物群落可用的营养物质可破坏微生物组的平衡，导致生态失调。生态失调描述为微生物群落的不平衡，并且在肠道中可导致包括胃肠道不适、腹泻、呕吐、营养缺乏和体重减轻等临床症状。尽管从出生或断奶后不久到老年生命阶段晚期，肠道内的微生物组和微生物都以连续丰富的形式存在，但由例如感染、抗生素清除、药物治疗或极端饮食改变引起的对微生物组的攻击可改变整个生命中的群落组成。在狗患有反复或慢性腹泻的情况下，可以在微生物组中检测到特有的模式、特征或指纹，这可表明通过改变饮食习惯和随之而来的微生物群变化来有效治疗的可能性。
特别适合在猫和狗身上研究营养对微生物组的影响，因为完全且均衡的饮食可以作为长时间的唯一食物源，从而减少个体之间饮食偏好的混杂影响。也就是说，尽管数十年来致力于改善胃肠道(gastrointestinal，GI)健康状况和优化粪便质量，但对与健康参数(例如粪便形式、明显的GI健康状况(缺乏临床症状、对攻击的抵抗力和感染恢复)以及GI功能障碍)相关的细菌分类群和功能基因组的了解仍然非常有限。这在人以外的宿主中例如狗和猫中尤其明显。
据报道，多种成分改变宿主健康，而诸如益生元和纤维等功能性食品对胃肠道健康和粪便质量或粪便稠度特别有用。特别是可溶性和不溶性纤维、益生元寡糖、聚糖或β-葡聚糖的复杂混合物可以代表长期公认的功能性膳食成分，这些功能性膳食成分有助于纠正肠道健康状况，例如消化系统的慢性和急性腹泻或腹胀，改善健康状况和宿主的活力。
由于大肠中的微生物群选择性地发酵耐消化的纤维(De Godoy等人，2013)，因此评估膳食纤维影响的研究特别多。因此，可从对特定食品成分(包括可溶性和不溶性纤维以及益生元)的体外和体内测试中获得大量数据。还已知此类成分影响肠道内的微生物群，特别是结肠内的微生物群，它们使通过未被宿主消化的耐消化纤维发酵增强健康的微生物群有不同的影响。评估认为对膨胀特性(bulking property)和肠道运输很重要的膳食纤维(包括可溶性纤维、益生元和不溶性复合耐性膳食纤维)对微生物群的影响的研究有很多，并且已经证明该膳食纤维对粪便稠度和粪便中微生物含量或微生物衍生含量均有影响(Ferrario等人，2017；Wakshlag等人，2011；Simpson等人，2001；Sunvold等人，1995；Vickers等人，2001)。
在某种程度上由于多种成分和纤维源的变化和复杂性，研究结果可能难以比较，因此揭示一致的趋势仍然存在问题。大多数天然存在的膳食纤维源代表可溶性和不溶性纤维的混合物，其中大量研究工作集中在益生元寡糖、聚糖和β-葡聚糖上。特定产品、包含水平和宿主物种也是趋势评估中的混杂因素，但这些成分已证明对粪便稠度和粪便的微生物含量或微生物衍生含量均有影响(Ferrario等人，2017；Wakshlag等人，2011；Simpson等人，2001；Sunvold等人，1995；Vickers等人，2001)。尽管剂量以及摄入量是有效性的关键，但对人体纤维和胃肠道健康研究的荟萃分析揭示了纤维摄入量与结直肠癌发病率之间的关系。虽然产品/成分和特定的包含水平描述为可降低结肠直肠癌的风险，但据报道，高纤维摄入量、特别是食用全谷物和谷物衍生纤维具有潜在的保护作用。
迄今为止，描述宠物动物中纤维和益生元膳食补充剂的研究文献在很大程度上定义了与特定成分相关的细菌变化，通过选择性细菌培养或现在过时的分子技术(例如变性梯度凝胶电泳)进行测量，这些技术通常测量已知对人类健康有益的分类群。这些见解是否适用于不同的宿主并因此是否与犬类健康相关仍不清楚。然而，已经发表了少量研究解决了微生物群的变化，这些变化在狗喂食特定的纤维源和益生元后通过深度测序测量。Middlebos等人，(2010)给狗喂食含有7.5％甜菜粕的食物，发现该量与参考食物相比可以明显改变肠道微生物群的结构。尽管数据仅支持门(phylum)水平的变化，但当狗接受含有甜菜粕(beet pulp)的食物时，可以观察到厚壁菌(Firmicutes)显著增加和梭杆菌(Fusobacteria)显著减少。
在控制粪便微生物群以增强健康的过程中，了解饮食对微生物组的长期影响以及对宿主健康参数(例如健康的临床生物标志物和胃肠道抵抗力和恢复力)的影响代表这一研究领域的重大进步。
粪便稠度，特别是稀便或干便的极端情况是宠物主人健康的关键指标，并且据报道，令人厌恶的粪便质量、腹泻发作和肠胃健康不佳是养宠物的主要障碍，这会对人类动物互动产生重大影响，并由此造成人及其宠物的生活质量问题。因此，食品和成分对狗和猫粪便质量的影响对于优化宠物健康、安康、生活方式、活力和营养具有重要意义。膳食摄入量，包括干物质体积、水分和营养成分，都会影响粪便的稠度。
然而，关于肠道微生物组及其与动物健康的联系的研究是有限的。因此，有必要了解肠道微生物组与动物健康和活力之间的关系。随着时间的推移或通过营养摄入或干预来测量、监测和跟踪粪便中的肠道细菌以增强或支持宠物的健康肠道，这将是更加有利的，因为这使宠物主人能够观察组合物、成分或营养因子的影响，并为宠物主人提供继续提供健康促进因素的动力。此外，需要新的方法和组合物来增强健康宠物的胃肠道抵抗力、肠道健康，以及治疗慢性和急性肠道疾病，例如与微生物组相关的急性自限性腹泻感染和慢性肠病。此外，需要在兽医治疗和影响微生物组的药物(例如组合物、成分和膳食补充剂或配料(topper))后支持胃肠道抵抗力，以减少微生物群失调和由此产生的腹泻或软便的发生。具有这种效用的组合物或成分提供额外的益处，帮助兽医管理兽医治疗的胃肠道症状。
鉴于微生物组对健康和幸福的重要性，找到影响和监测动物微生物组状态的方法，并使主人能够通过跟踪随时间的健康状态来观察益处是很重要的，因为肠道屏障的内在变化、对腹泻的抵抗力和胃肠道健康可随着主人提供的营养摄入而改变微生物组含量而发生，并影响宠物的健康和活力。
发明内容
在某些方面，本公开涉及改变伴侣动物(例如犬科动物)的微生物组的组合物以及包括给予和使用所述组合物的方法。
本文所公开的组合物和方法影响、优化和增强犬科动物的肠道微生物组，并影响胃肠道健康和抵抗力(resilience)，从而改善动物的健康、安康(wellness)和活力(vitality)。此外，本公开包括通过单点和多点测试方法监测微生物组的方法，以使能够测试组合物对微生物组的影响，从而生成基于肠道健康的微生物组和增强宠物健康的抵抗力护理途径。如实施例中所示，本公开的方法可以高精度地实现这一点。
在本公开的第一个方面，该组合物适用于伴侣动物，并包括至少3种选自以下的成分：约0.005克/天至约0.165克/天的绿茶多酚，约0.5克/天至约33克/天的小麦，约0.2克/天至约30.8克/天的纤维素，总量约为0.1克/天至约11.0克/天的菊苣浆和/或甜菜浆；约0.08克/天至约2.2克/天的番茄渣(tomato pomace)(番茄红素(lycopene))，和约0.025克/天至约2.2克/天的低聚果糖。
在本发明第一方面的一个实施方案中，菊苣浆和/或甜菜浆的总量为约0.1克/天至约8.0克/天。
该组合物可以是宠物食品，例如完全营养宠物食品，例如干的(例如，粗磨物(kibble))、半湿润或湿润的宠物食品；非完全营养宠物食品，例如补充剂、功能性配料(functional topper)、功能性食品增强剂(functional food booster)，或营养组合物或药物组合物。
在一个实施方案中，该组合物还包括L-肉碱、鱼油、硫酸软骨素、葡萄糖胺、叶黄素、羟脯氨酸、胶原蛋白。在一个优选的实施方案中，其他成分与宠物动物的每日摄入量相关。
成分的浓度可在表1所示的浓度范围内。
表1.
Figure BDA0003582181400000051
Figure BDA0003582181400000061
在规定的最小和/或最大范围内。
在一个实施方案中，该组合物包括表1中规定范围内的所有成分。
在某些方面，所述组合物是完全营养食品，换言之，所述组合物提供给伴侣动物所需的所有营养，而无需补充其他摄入。一个实例是商业化生产的宠物食品。所述组合物可具有表2的营养谱(nutrient profile)。
表2.
Figure BDA0003582181400000071
在其他方面，所述组合物可以是非完全营养食品，例如补充剂、功能性配料或功能性食品增强剂。所述组合物可具有表3所示的营养谱(nutrient profile)。
表3.
常量营养素(％制剂中的干物质) 最小 最大
膳食纤维 0.9 99.9
粗脂肪 1.0 19.8
蛋白质 2.5 44.0
难消化蛋白质 0.08 4.4
在一些实施方案中，所述组合成分的浓度最高达如表1所述的最大水平。
在某些实施方案中，该组合物还包括额外的益生元。在某些实施方案中，该组合物还包含额外的纤维或其他功能性食品成分。
在某些实施方案中，该组合物还包含乳酸菌的益生菌种，例如双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacilus)或肠球菌(Entercoccus)。在一些实施方案中，所述组合物还包含酵母的益生菌种，例如来自酵母(Saccharomyces)属的种。在一些实施方案中，所述组合物还包含形成孢子的益生菌种，例如来自芽孢杆菌(Bacillus)属的种。
在一些实施方案中，在将组合物给予伴侣动物后约3至约21天内，所述组合物改善伴侣动物的肠道健康。
在一些实施方案中，组合物是膳食补充剂。在一些实施方案中，将所述膳食补充剂添加到宠物食品的最外部作为配料配料。在一些实施方案中，所述膳食补充剂随后在整个产品中混合。在一些实施方案中，所述组合物是狗的食品。
在一些实施方案中，本公开的主题提供了一种在健康伴侣动物或需要改善胃肠道健壮性的动物(例如患有急性或复发性腹泻的动物)中改善肠道健康和抵抗力的方法，从而改善抵抗力、健康和幸福。在一些实施方案中，该方法包括向伴侣动物给予有效量的本文公开的任何组合物。在本公开的另一方面，提供了一种通过给予伴侣动物本文所公开的组合物来改变伴侣动物的微生物组的方法。在一些实施方案种，该方法可包括确定伴侣动物的微生物组的健康的第一步骤，并且在第一步骤中检测到健康或不健康的微生物组、优选不健康的微生物组时，将本文公开的组合物给予伴侣动物。
第一步骤可包括将从伴侣动物获得的样品中的至少两个、优选至少三个或至少四个细菌分类群进行定量，以确定其丰度；以及将所确定的丰度与对照数据集中相同分类群的丰度进行比较；其中所述至少两个、优选至少三个或至少四个细菌分类群的丰度相对于对照数据集的增加或减少指示健康或不健康的微生物组。
在本公开的另一个方面，本发明第一方面的组合物用于增加在伴侣动物的胃肠道或粪便中存在的栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、异杆菌属(Allobaculum)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、史雷克氏菌属(Slackia)毛螺菌属(Lachnospira)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)中的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种的数量，与给予所述组合物之前伴侣动物中存在的所述细菌的数量相比。
在本公开的另一个方面，本文公开的组合物用于减少在伴侣动物的胃肠道或粪便中存在的肠杆菌目(Enterobacteriales)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、变形菌门(Proteobacteria)、普雷沃氏菌属(Prevotella)或考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)中的至少一种、两种、三种、四种、五种或六种的数量，与给予所述组合物之前伴侣动物中存在的所述细菌的数量相比。
在另一个实施方案中，本文公开的组合物用于减少梭杆菌属(Fusobacterium)、特别是死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)或来自艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)或大肠杆菌/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)或地中海杆菌属(Mediterraneibacter)的种或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或艰难梭菌(Clostridium difficile)的数量。
在本公开的另一个方面，本文所公开的组合物用于通过给予伴侣动物所述组合物来增加伴侣动物微生物组中脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸相关基因中的至少一种的基因表达。
在本公开的另一个方面，所述组合物用于改变伴侣动物中的循环氨基酸水平。在一个实施方案中，通过给予伴侣动物所述组合物来降低天冬氨酸、丝氨酸、肌氨酸、脯氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、1-甲基组氨酸和3-甲基组氨酸、肌肽、鸟氨酸和精氨酸的循环氨基酸水平。
在本公开的另一个方面，本文公开的组合物用于通过给予伴侣动物所述组合物来增加伴侣动物中的CD3和/或CD4淋巴细胞计数。
在本发明的另一个方面，本文所公开的组合物用于通过给予向伴侣动物所述组合物来降低伴侣动物中的循环甘油三酯水平。
健康微生物组可与病原体负荷减少、短链脂肪酸产生有关，并且肠腔pH值降低与肠道屏障通透性降低和胃肠道抵抗力降低有关。具有较高细菌负荷的病原微生物的不健康微生物组与多种健康状况有关。因此，需要监测肠道微生物组的健康或诊断不健康的微生物组。
伴侣动物微生物组的健康可通过以下步骤测量，所述步骤包括对从伴侣动物获得的样品中检测至少两个、优选至少三个、优选至少四个细菌分类群；其中所述至少两个、优选至少三个、优选至少四个细菌分类群的存在指示不健康的微生物组。
伴侣动物微生物组的健康也可通过这样的方法测定，所述方法包括计算伴侣动物微生物组内物种的多样性指数的步骤，以及将多样性指数与对照数据集的多样性指数进行比较的步骤。
伴侣动物的健康可通过本公开的方法在至少两个时间点上进行确定。时间点可间隔约1周、约2周、约21天、约28天、约1个月、约56天、约2个月、约3个月、约4个月、约84天、约5个月或约6个月。这在伴侣动物正在接受治疗以改变微生物组的情况下特别有用，因为它可以监测治疗的进展。它对于监测伴侣动物的健康也是有用的。在一个实施方案中，测量微生物组的多样性指数和/或群落组成的稳定性。
还提供了一种监测已接受本文所述组合物的伴侣动物中微生物组的健康的方法。所述方法允许技术人员确定所述组合物在伴侣动物上转换微生物组的成功性。优选地，这些方法包括在使用本文公开的组合物进行治疗前后测定微生物组的健康，因为这有助于评估治疗的成功性。
本公开的主题因此提供了一种方法，通过所述方法可通过主餐或补充宠物护理或宠物食品接受膳食成分的组合物并结合用于测定动物胃肠健康的方法来增强健康，使得主人或主治兽医能够观察对胃肠道健康和抵抗复力的影响，从而能够观察喂给组合物对动物的影响，并且与喂给组合物或宠物食品相比，根据测试时机确定动物是否将会受益于或已经受益于使微生物组恢复其健康状态的的干预措施。
本公开的主题还提供了一种方法，所述方法用于评估没有胃肠道不适迹象的健康伴侣动物的肠道健康状态，并确定伴侣动物是否会受益于使微生物组恢复其健康状态的干预措施。在一些实施方案中，本公开的主题提供了一种用于测定有需要的伴侣动物(例如具有诸如腹泻或粪便质量差的临床症状或具有诸如慢性肠病或IBD的肠道生态失调的动物)的肠道健康状况的方法。
在某些实施方案中，本公开的主题提供了一种用于在接受宠物护理产品(例如组合物、例如补充剂、宠物食品功能性配料(topper)或增强剂(booster)，或完全营养粗磨食品)之前确定伴侣动物的肠道健康状态的方法，从而评估接受所述宠物护理产品的需求。
在某些实施方案中，本发明公开的主题提供了一种用于在接受宠物护理产品(例如组合物、例如补充剂、宠物食品功能性配料或增强剂，或完全营养粗磨食品)之后评估伴侣动物肠道健康状态的方法，从而在接受所述产品后确定动物的胃肠道健康状况。
在某些实施方案中，本发明公开的主题提供了一种用于在接受宠物护理产品(例如组合物、例如补充剂、宠物食品功能性配料或增强剂，或完全营养粗磨食品)之前、期间和之后评估伴侣动物的肠道健康状态的方法，从而在接受产品前后确定和监测动物的胃肠道健康状况，从而可评估所述宠物护理产品的成功性。
在某些实施方案中，该方法包括：a)测量伴侣动物中第一肠道微生物的第一量和第二肠道微生物的第二量；b)将肠道微生物的第一量与所述第一肠道微生物的第一参考量进行比较，并将肠道微生物的第二量与所述肠道微生物的第二参考量进行比较，其中所述肠道微生物的参考量基于多个健康伴侣动物的所述肠道微生物的量确定；以及c)当所述第一肠道微生物的所述第一量高于所述第一肠道微生物的所述第一参考量时，和/或当所述第二肠道微生物的所述第二量低于所述第二肠道微生物的所述第二参考量时，确定伴侣动物的肠道健康状况。
在某些实施方案中，所述第一肠道微生物选自下组，所述组包括阿布西拉真杆菌属(Absiella)、厌氧棒杆菌属(Anaerostipes)、厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、多尔氏菌属(Dorea)、肠球菌属(Enterococcus)、丹毒梭菌(Erysipelatoclostridium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、黄杆菌属(Flavonifractor)、梭杆菌属(Fusobacterium)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)、蓝绿藻菌属(Lachnoclostridium)、毛螺菌科_NK4A136_组(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨单胞菌属(Megamonas)、假黄杆菌属(Pseudoflavonifractor)、罗姆布茨菌属(Romboutsia)、罗斯氏菌属(Roseburia)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、塞利单胞菌属(Sellimonas sp.)、土孢杆菌属(Terrisporobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)和毛螺菌属(Lachnospirace)。或者，选自梭杆菌属(Fusobacterium)、尤其是死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)，或艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)的种，或来自大肠杆菌/志贺氏属(Escherichia/Shigella)的种、或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或艰难梭菌(Clostridium difficile)。艰难梭菌属(Clostridium difficile)可与艰难梭菌(Clostridium[Clostridioides]difficile)互换使用。
在某些实施方案中，该方法还包括当所述第一肠道微生物的所述第一量低于所述第一肠道微生物的所述第一参考量时，和/或当所述第二肠道微生物的所述第二量高于所述第二肠道微生物的所述第二参考量时，提供治疗方案的定制建议和/或进一步监测肠道微生物。
在某些实施方案中，从受试者的粪便样品中测量肠道细菌的数量。
本公开的主题提供了一种用于在有需要的受试者中治疗肠道失调(intestinaldysbiosis)和/或改善肠道健康的方法。在某些实施方案中，该方法包括：a)测量伴侣动物中的一种或多种肠道或粪便微生物的第一量；b)向伴侣动物施用治疗方案以治疗肠道疾病和/或改善肠道健康；c)在步骤b)之后测量受试者体内的肠道微生物的第二量；以及d)当所述肠道微生物的所述第二量与所述肠道微生物的所述第一量相比发生变化时，继续施用所述治疗方案。
在某些实施方案中，所述肠道微生物选自阿布西拉真杆菌属(Absiella)、厌氧棒杆菌属(Anaerostipes)、厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、多尔氏菌属(Dorea)、肠球菌属(Enterococcus)、丹毒梭菌(Erysipelatoclostridium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、黄杆菌属(Flavonifractor)、梭杆菌属(Fusobacterium)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)、蓝绿藻菌属(Lachnoclostridium)、毛螺菌科_NK4A136_组(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨单胞菌属(Megamonas)、假黄杆菌属(Pseudoflavonifractor)、罗姆布茨菌属(Romboutsia)、罗斯氏菌属(Roseburia)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、塞利单胞菌属(Sellimonas sp.)、土孢杆菌属(Terrisporobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)和毛螺菌属(Lachnospirace)。或者，选自梭杆菌属(Fusobacterium)、尤其是死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)，或艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)的种，或来自大肠杆菌/志贺氏属(Escherichia/Shigella)的种、或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或艰难梭菌(Clostridium difficile)，及其任何组合。在一些实施方案中，该方法包括当所述肠道微生物的所述第二量相比于所述肠道微生物的所述第一量增加时，继续施用所述治疗方案。在某些实施方案中，所述肠道微生物选自普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)及其任何组合。
在某些实施方案中，肠道微生物选自阿布西拉真杆菌属(Absiella)、厌氧棒杆菌属(Anaerostipes)、厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、多尔氏菌属(Dorea)、肠球菌属(Enterococcus)、丹毒梭菌(Erysipelatoclostridium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、黄杆菌属(Flavonifractor)、梭杆菌属(Fusobacterium)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)、蓝绿藻菌属(Lachnoclostridium)、毛螺菌科_NK4A136_组(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨单胞菌属(Megamonas)、假黄杆菌属(Pseudoflavonifractor)、罗姆布茨菌属(Romboutsia)、罗斯氏菌属(Roseburia)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、塞利单胞菌属(Sellimonas sp.)、土孢杆菌属(Terrisporobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)和毛螺菌属(Lachnospirace)。或者，选自梭杆菌属(Fusobacterium)、尤其是死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)，或艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)的种，或来自大肠杆菌/志贺氏属(Escherichia/Shigella)的种、或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或艰难梭菌(Clostridium difficile)，及其任何组合。在一些实施方案中，该方法还包括当所述肠道微生物的所述第二量相比于所述肠道微生物的所述第一量减少时，继续施用所述治疗方案。
在某些实施方案中，在步骤b)后约14天或约21天或约28天或约56天或约84天之间测量肠道细菌的第二量。在某些实施方案中，治疗方案包括饮食方案。在某些实施方案中，饮食方案包括给予有效量的本文公开的任何组合物。
在某些实施方案中，使用DNA测序技术测定肠道微生物的量。
在某些实施方案中，使用RNA测序技术测定肠道微生物的量。
在某些实施方案中，使用微阵列测定肠道微生物的量。
在某些实施方案中，使用聚合酶链式反应技术(例如定量PCR)测定肠道微生物的量。
附图说明
图1.图1描绘了肠道菌群和肠粘膜中的粘膜免疫之间的相互作用。
图2.图2描绘了实施例1中描述的喂养试验研究设计。
图3.图3是对实施例1中所述的用于从粪便样品中检测肠道微生物组的DNA序列数据的稀疏度分析结果的图示。
图4.图4是对实施例1中所述的主成分分析的图示。
图5.图5是使用实施例1中所述的LEfSe比较成年组和老年组之间的肠道菌群组成的图示。
图6.图6是实施例1中所述的老年组中由于饮食疗法的影响而引起的肠道菌群组成变化的图示。
图7.图7是实施例1中所述的使用LEfSe预测的各组功能基因的直方图。
图8.图8是实施例1中所述的使用LEfSe预测的各组功能基因的直方图。
图9.图9是由多因素分析得出的蜘蛛图的图示，用于可视化实施例1中所述的3个不同日期微生物组总组成的变化。
图10.图10是PLS-DA关联图的图示，示出了实施例1中所述的基于在喂食不同饮食3周后在3个日期收集5只狗的粪便样品的26个细菌群(分类群)的粪便微生物组的相对组成的相关性。
具体实施方式
本发明涉及用于改变伴侣动物肠道菌群的饮食干预方法，该方法使肠道微生物组具有更健康的状态并且还确定了用于监测所述饮食干预对宿主健康状态的影响的方法。
在一些方面，本发明涉及一种组合物，其包括选自以下的至少3种成分：约0.005克/天至约0.165克/天的绿茶多酚，约0.5克/天至约33克/天的小麦，约0.2克/天至约30.8克/天的纤维素，总量为约0.1克/天至8.0克/天的菊苣浆和/或甜菜浆；约0.08克/天至2.2克/天的番茄渣(番茄红素)，和约0.025克/天至2.2克/天的低聚果糖。在本发明第一方面的一个实施方案中，该组合物包括至少3种、4种、5种、6种或所有的成分。
在一个实施方案中，该组合物还包含一种或多种选自以下的成分：L-肉碱、鱼油、硫酸软骨素、葡萄糖胺、叶黄素、羟脯氨酸、胶原蛋白，其水平与动物的每日摄入量相关。
所公开的组合物的成分可在表1所示的浓度范围内，其数量在规定的最小和/或最大范围内。
在一个实施方案中，该组合物包含表1中规定范围内的所有成分。
本文公开的组合物可以是完全营养食品。正如在这里使用的，“完全营养食品”是指为伴侣动物提供所有必需营养的食品，而不需要补充其他摄入。一个实例是商业化生产的宠物食品。这种组合物可具有表2的营养谱(nutrientprofile)。
在其他方面，所述组合物可为非完全营养食品，例如补充剂、功能性配料或功能性食品增强剂。这种组合物可具有表3的营养谱(nutrient profile)。
在某些实施方案中，成分组合的浓度最高达表1中所述的最大水平。
描述了能够改变微生物群落组成的特定成分，所述微生物群落组成反映狗肠道微生物组的增强健康和抵抗力。因此，描述了通过宠物食品、治疗剂、补充剂、增强剂或配料给予宠物(如狗和猫)的成分组合，以及证实、监测和跟踪所述组成对单个宠物的影响的方法。
与基准商业宠物干食品相比，当给较老的狗喂食试验饮食(test diet)时，观察到的微生物群变化与微生物群平衡的改变一致，其中推定健康相关的细菌物种的检测水平增加，而与较不健康的微生物群(如机会性病原体)相关的细菌分类群水平降低。预测的微生物组功能含量(通过PICRUSt)表明，与标准基础饮食相比，动物接受试验饮食时，微生物组中的“代谢”和“能量代谢”增加。
喂给本文描述的饮食干预后，系统健康也发生改变，其中当试验高纤维饮食喂给狗时，观察到CD3+和CD4+淋巴细胞计数显著增加，而循环甘油三酯水平显著降低。当狗接受试验饮食时，在微生物组中检测到健康相关细菌包括栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)和毛螺旋菌属(Lachnospira)增加，在粪便中检测到包括大肠杆菌属(Escherichia)在内的肠杆菌目(Enterobacteriales)显著减少，并且功能基因组成也发生改变，其中醚脂质代谢相关基因减少，同时检测到与几种氨基酸代谢相关的基因增加，所述氨基酸包括脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
将先前的专利申请(PCT US2020/014292或WO2020/150712)通过引用整体并入本文，所述专利申请确定了某些细菌分类群中的细菌的种指示犬科动物、优选狗的健康或不健康微生物组，从而在干预前后的多个点检测微生物群的组成可使宠物主人了解干预对宠物的影响。如果成分改变了肠道微生物群的组成，从而增加了以下生物的丰度，则微生物组将更健康，从而提高胃肠道的抵抗力，还可产生系统性影响，如在喂给本文的试验饮食时观察到的影响：通过本文所述方法检测到的微生物表明犬科动物肠道微生物组的健康，所述微生物组包括阿布西拉真杆菌属(Absiella)、厌氧棒杆菌属(Anaerostipes)、厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、多尔氏菌属(Dorea)、肠球菌属(Enterococcus)、丹毒梭菌(Erysipelatoclostridium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、黄杆菌属(Flavonifractor)、梭杆菌属(Fusobacterium)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)、蓝绿藻菌属(Lachnoclostridium)、毛螺菌科_NK4A136_组(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨单胞菌属(Megamonas)、假黄杆菌属(Pseudoflavonifractor)、罗姆布茨菌属(Romboutsia)、罗斯氏菌属(Roseburia)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、塞利单胞菌属(Sellimonas sp.)、土孢杆菌属(Terrisporobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)和毛螺菌属(Lachnospirace)。相比之下，认为梭杆菌属(Fusobacterium)物种的丰度减少是健康的，尤其是死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)或梭杆菌科(Mogibacteriaceae)的种，或大肠杆菌/志贺菌属(Escherichia/Shigella)的种、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或艰难梭菌(Clostridium difficile)。
细菌物种可不同，或数量可在认为是健康的范围内有所不同，这取决于动物的生命阶段。
迄今为止，仍然需要新的方法和组合物用于治疗肠道生态失调和其他针对肠道微生物组的肠道疾病。
为清楚起见并且不受限制，将本公开的主题的详细描述分为以下几个小节：
1.肠道细菌；
2.组合物；
3.治疗方法；并且
1.肠内细菌
在一些实施方案中，肠道微生物可用于指示受试者的肠道健康。在一些实施方案中，肠道微生物与受试者的健康状态或肠道失调有关。
在某些实施方案中，肠道微生物指示受试者的健康肠道状态。在某些实施方案中，肠道微生物包括细菌，所述细菌选自由以下组成的组：毛螺旋菌科的种(Lachnospiraceaesp.)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、瘤胃球菌科的种(Ruminococcaceae sp.)、拟杆菌属的种(Bacteroidessp.)、布劳特氏菌属的种(Blautia sp.)、丹毒丝菌科的种(Erysipelotrichaceae sp.)、蓝绿藻菌属的种(Lachnospiraceae sp)及其任何组合。在某些实施方案中，该细菌选自普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)及其任何组合。
2.组合物
在某些方面，本文所描述的组合物适用于伴侣动物，并包含至少3种选自以下的成分：约0.005克/天至约0.165克/天的绿茶多酚，约0.5克/天至约33克/天的小麦，约0.2克/天至约30.8克/天的纤维素，总量为约0.1克/天至11.0克/天的菊苣浆和/或甜菜浆；和约0.08克/天至2.2克/天的番茄渣(番茄红素)，和约0.025克/天至2.2克/天的低聚果糖。
该组合物可以是宠物食品，例如完全营养宠物食品，例如干燥(例如粗磨物)、半湿润或湿润的宠物食品，或非完全营养宠物食品，例如补充剂、功能性配料、功能性食品增强剂，或营养组合物或药物组合物。
在一个实施方案中，所述组合物还包括L-肉碱、鱼油、硫酸软骨素、葡萄糖胺、叶黄素、羟脯氨酸、胶原蛋白，其水平与宠物动物的每日摄入量相关。
在一些方面，本文公开的组合物的成分可在表1所示的浓度范围内。
其量为规定的最小和/或最大范围或在规定的最小和/或最大范围内。
在一个实施方案中，该组合物包括在表1中规定的范围内的所有成分。
在某些方面，所述组合物可为完全营养食品。如本文所述，“完全营养食品”是指提供伴侣动物所需所有营养的食品，无需补充其他摄入。一个实例是商业化生产的宠物食品。所述组合物可具有表2的营养谱(nutrient profile)。
表2.
Figure BDA0003582181400000181
在其他方面，所述组合物可以是非完全营养食品，例如补充剂、功能性配料或功能性食品增强剂。所述组合物可具有表3的营养谱(nutrient profile)。
表3.
Figure BDA0003582181400000182
在某些实施方案中，组合成分的浓度最高达表1中所述的最大水平。在一些实施方案中，该组合物是完全营养宠物食品，例如干燥(如粗磨物)、半湿润或湿润的宠物食品；非完全营养宠物食品，例如补充剂、功能性配料、功能性食品增强剂或营养组合物或药物组合物。
在一个实施方案中，这些组合物适于给予伴侣动物。
如本文所用，“伴侣动物”包括可见于家养环境的任何动物，包括哺乳动物，如犬科动物(如狗和狼)和猫科动物(如猫)。
在一个实施方案中，本文所描述的组合物适用于药物。
在一个实施方案中，本文公开的组合物适用于治疗伴侣动物的胃肠道失调。在一个实施方案中，该组合物适用于改变伴侣动物的微生物组。在一个实施方案中，该组合物适用于增加在伴侣动物的胃肠道或粪便中存在的栖粪杆菌(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、异杆菌属(Allobaculum)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、史雷克氏菌属(Slackia)毛螺菌属(Lachnospira)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)细菌，与给予该饮食前在伴侣动物体内存在的所述细菌的数量相比。在一个实施方案中，该组合物适用于减少肠杆菌目(Enterobacteriales)细菌，优选大肠杆菌属(Escherichia)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、变形菌门(Proteobacteria)、普雷沃氏菌属(Prevotella)或考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)的数量。在一个实施方案中，该组合物用于增加伴侣动物的脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸相关基因中的至少一种的基因表达。在一个实施方案中，所述组合物适用于改变伴侣动物中的循环氨基酸水平，尤其是减少包括天冬氨酸、丝氨酸、肌氨酸、脯氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、1-甲基组氨酸和3-甲基组氨酸、肌肽、鸟氨酸和精氨酸的组中的任何一种。在一个实施方案中，该组合物适于改变伴侣动物的循环氨基酸水平，尤其是减少包含天冬氨酸、丝氨酸、肌氨酸、脯氨酸、甘氨酸、α1氨基丁酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、1-甲基组氨酸和31甲基组氨酸、肌肽、鸟氨酸和精氨酸的组中的任何一种氨基酸。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含有效量的浆状物。所述浆状物本质上是纤维状的。在一些实施方案中，所述浆状物是甜菜浆，例如甜菜粕，优选未加工的甜菜粕。在另一个实施方案中，浆状物可以是菊苣浆，优选菊苣浆纤维。在一些实施方案中，对浆状物进行蒸煮或灭菌，或使其包含在挤出或加工产品中。在一个实施方案中，组合物的浆状物可以源自至少一种植物，例如菊苣和甜菜。
在一些实施方案中，浆状物的浓度介于约0.5％w/w和约10％w/w之间、约0.5％w/w和约5％w/w之间、约0.5％w/w和约4％w/w之间、约0.5％w/w和约3％w/w之间、约0.5％w/w和约2％w/w之间、约0.5％w/w和约1.5％w/w之间、约0.5％w/w和约1.2％w/w之间、约0.5％w/w和约1％w/w之间、约0.5％w/w和约0.9％w/w之间、或约0.5％w/w和约0.8％w/w之间。在一些实施方案中，浆状物的浓度介于约0.8％w/w和约10％w/w之间、约0.8％w/w和约5％w/w之间、约0.8％w/w和约4％w/w之间，约0.8％w/w和约3％w/w之间，约0.8％w/w和约2％w/w之间，约0.8％w/w和约1.5％w/w之间，约0.8％w/w和约1％w/w之间、约1％w/w和约10％w/w之间、约1％w/w和约5％w/w之间、约2％w/w和约5％w/w之间，或约1％w/w和约2％w/w之间。在一些实施方案中，浆状物的浓度为约0.8％w/w。
在某些实施方案中，该组合物包括有效量的在本文中公开的与受试者的健康肠道状态有关的任何细菌。在某些实施方案中，所述细菌选自栖粪杆菌(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、异杆菌属(Allobaculum)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、史雷克氏菌属(Slackia)毛螺菌属(Lachnospira)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺旋菌科的种(Lachnospiraceae sp.)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、瘤胃球菌科的种(Ruminococcaceae sp.)、拟杆菌属的种(Bacteroides sp.)、布劳特氏菌属的种(Blautia sp.)、丹毒丝菌科的种(Erysipelotrichaceae sp.)、蓝绿藻菌属的种(Lachnospiraceae sp)及其任何组合。在某些实施方案中，所述细菌选自普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)及其任何组合。在某些实施方案中，所述细菌选自denovo1184、denovo1244、denovo1696、denovo2407、denovo2451、denovo283、denovo3487、denovo4154、denovo4328、denovo4681、denovo498、denovo5338、denovo6995、denovo943及其任何组合，如在PCTUS2020/0142922/WO2020/150712中定义的，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，组合物中包含的细菌在约1000CFU和约10万亿CFU之间。在一些实施方案中，细菌介于约1000CFU和约1万亿CFU之间、约100万CFU和约1万亿CFU之间、约1亿CFU和约1000亿CFU之间、约10亿CFU和约1万亿CFU之间、约10亿CFU和约1000亿CFU之间、约1亿CFU和约1000亿CFU之间、约10亿CFU和约500亿CFU之间、约1亿CFU和约500亿CFU之间、或约10亿CFU和约100亿CFU之间。在一些实施方案中，组合物中包含的细菌为至少约1000CFU、至少约100万(million)CFU、至少约1000万(10million)CFU、至少约1亿CFU、至少约10亿(billion)CFU、至少约100亿CFU、至少约1000亿CFU或更多。
在一些实施方案中，组合物还包含有效量的浆状物，例如菊苣浆或甜菜浆(例如甜菜粕)。
在一些实施方案中，组合物是膳食补充剂，例如，施加在组合物之上，作为宠物食品配料或随后在整个产品中混合。在一些实施方案中，组合物是零食产品(treat product)或咀嚼物或粗磨零食或补充产品。在一些实施方案中，组合物是猫食品或狗食品。在一些实施方案中，食品是狗食品。在一些实施方案中，组合物是干的宠物食品。在一些实施方案中，组合物是湿的宠物食品。
在一些实施方案中，本公开主题的制剂还可包含额外的活性剂。可存在于本公开主题的制剂中的额外的活性剂的非限制性实例包括营养剂(例如，氨基酸、肽、蛋白质、脂肪酸、碳水化合物、糖、核酸、核苷酸、维生素、矿物质等)、益生元、益生菌、抗氧化剂和/或增强微生物组、改善胃肠道健康和改善动物健康的试剂。
在一些实施方案中，组合物包含一种或多种益生菌。在一些实施方案中，益生菌是动物益生菌。在一些实施方案中，动物益生菌是猫益生菌。在一些实施方案中，动物益生菌是犬益生菌。在一些实施方案中，益生菌为双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳酸菌(lacticacid bacterium)和/或肠球菌(Enterococcus)。在一些实施方案中，益生菌选自乳酸菌中的任何生物体，且更具体地选自以下细菌的属：乳球菌属(Lactococcus spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacteriumspp.)(如长双歧杆菌(B.longum)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、动物双歧杆菌(B.animalis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis))、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)(例如保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、肠球菌属(Enterococcus spp.)(如粪肠球菌(E.faecium))、普氏杆菌属(Prevotella spp.)、梭杆菌属(Fusobacterium spp)、拟普氏杆菌属(Alloprevotellaspp.)及它们的任意组合。在一些实施方案中，益生菌以每天约1个菌落形成单位(CFU)至约1000亿CFU的量给予伴侣动物，以维持GI微生物群或微生物组或胃肠道健康。在一些实施方案中，益生菌以每天约1个菌落形成单位(CFU)至约200亿CFU的量给予伴侣动物，以维持GI微生物群或微生物组或胃肠道健康。在一些实施方案中，益生菌以每天约10亿至约200亿CFU的量给予伴侣动物以维持GI微生物群。在一些实施方案中，益生菌以每天约0.1亿至约1000亿活细菌的量给予伴侣动物。在一些实施方案中，益生菌以每天约1亿至约100亿活细菌的量给予伴侣动物。在一些实施方案中，益生菌以每天约1×104CFU至1×1014CFU的量给予伴侣动物。在一些实施方案中，可以包括额外的益生元，例如低聚果糖(FOS)、低聚木糖(XOS)、大豆低聚糖(GOS)、葡聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉和/或低聚甘露糖。在一些实施方案中，额外的益生元以足以明显刺激微生物组或GI微生物群和/或引起一种或多种益生菌增殖的量给予。
在一些实施方案中，组合物还可包含本领域已知的添加剂。在一些实施方案中，此类添加剂以不损害由本公开的主题提供的目的和效果的量存在。所考虑的添加剂的实例包括但不限于功能上有益于改善健康的物质、具有稳定作用的物质、感官物质、加工助剂、增强适口性的物质、着色物质和提供营养益处的物质。在一些实施方案中，稳定物质包括但不限于可以增加产品保质期的物质。在一些实施方案中，此类物质包括但不限于防腐剂、增效剂和螯合剂、包装气体、稳定剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂和保湿剂。在一些实施方案中，乳化剂和/或增稠剂包括例如明胶、纤维素醚、淀粉、淀粉酯、淀粉醚和改性淀粉。
在一些实施方案中，用于着色、适口性和营养目的的添加剂包括例如着色剂；氧化铁、氯化钠、柠檬酸钾、氯化钾和其他食用盐；维生素；矿物质；和调味剂。产品中此类添加剂的量通常为最高达约5％(基于干产品计)。
在一些实施方案中，组合物是膳食补充剂。在一些实施方案中，膳食补充剂包括例如与另一种饲料一起使用以改善营养平衡或总体性能的饲料。在一些实施方案中，补充剂也包括这样的组合物，所述组合物未经稀释作为其他饲料的补充剂来饲喂，与可单独获得的动物口粮的其他部分自由选择，或与动物的常规饲料稀释并混合以产生完全饲料。例如，AAFCO在美国饲料管理协会(American Feed Control Officials，Incorp.)官方出版物第220页(2003)中提供了有关补充剂的讨论。补充剂可以是各种形式，包括例如粉末、液体、糖浆、丸剂、片剂、胶囊化组合物等。
在一些实施方案中，组合物是零食。在一些实施方案中，零食包括例如给予动物以诱使动物在非用餐时间进食的组合物。在一些实施方案中，组合物是犬科动物的零食，包括例如狗骨头。零食可以是营养的，其中产品包含一种或多种营养素，并且可以例如具有如上文所述的用于食品的组合物。非营养零食包括任何其他无毒的零食。
在一些实施方案中，本公开主题的细菌和/或甜菜粕可以在制剂加工期间(例如在产品的其他组分混合期间和/或之后)掺入组合物中。可以通过常规方式将这些组分分配到产品中。
在一些实施方案中，本公开主题的组合物可以使用常规的伴侣动物食品工艺以罐装或湿形式制备。在一些实施方案中，地面动物(ground animal)(例如哺乳动物、家禽和/或鱼)蛋白质组织与其他成分混合，例如乳鱼油、谷物、其他营养平衡成分、特殊用途添加剂(例如维生素和矿物质混合物、无机盐、纤维素和甜菜浆、填充剂等)；并加入足以进行加工的水。这些成分在适于混合这些成分的同时进行加热的容器中混合。可以使用任何合适的方式加热混合物，例如通过直接蒸汽注入或通过使用装有热交换器的容器。在加入最后一种成分后，将混合物加热到约50°F至约212°F的温度范围。超出此范围的温度是可接受的，但在不使用其他加工助剂的情况下可能在商业上不能实现。当加热到合适的温度时，材料通常呈浓稠液体的形式。将所述浓稠液体装进罐里。盖上盖子，并将容器气密密封。然后将密封罐放入设计用于对内容物进行消毒的常规设备中。这通常通过加热到大于约230°F的温度持续适当的时间来实现，这取决于例如所用温度和组成。
在一些实施方案中，本公开主题的组合物可以使用常规方法制备成干燥形式。在一些实施方案中，将包括例如动物蛋白源、植物蛋白源、谷物等的干燥成分研磨并混合在一起。在一些实施方案中，然后，可以将包括脂肪、油、动物蛋白源、水等的湿或液体成分添加到干混合物中并与之混合。在一些实施方案中，然后将混合物加工成粗磨物或类似的干片。在一些实施方案中，组合物是粗磨物。在一些实施方案中，粗磨物使用挤压工艺形成，其中干的和湿的成分的混合物在高压和高温下进行机械加工，并用力推过小开口并通过旋转刀切割成粗磨物。在一些实施方案中，然后将湿的粗磨物干燥并任选地用一种或多种局部涂层(coating)涂覆，所述局部涂层可以包括例如调味剂、脂肪、油、粉末等。在一些实施方案中，粗磨物也可以由面团使用烘烤工艺而不是挤出制成，其中在干热加工之前将面团放入模具中。
在一些实施方案中，本公开主题的零食可以通过例如类似于上述用于干食品的工艺的挤出或烘烤工艺制备。
3.治疗方法
在一些非限制性实施方案中，本公开的主题提供了在有需要的受试者中用于增强或改善微生物组、改善肠道健康和/或治疗肠道菌群失调的方法。在一些实施方案中，受试者是伴侣动物，例如狗或猫。在一些实施方案中，该方法可以提高伴侣动物的免疫力、消化功能、和/或减轻生态失调。
在一些实施方案中，该方法包括给予受试者有效量的本公开的任何组合物。在一些实施方案中，该方法进一步包括监测受试者中本公开的任何肠道微生物。在一些实施方案中，在受试者的粪便样品中测量肠道微生物。在一些实施方案中，测量来自受试者肠道的样品的肠道微生物。
在一些实施方案中，组合物可以以每天20次至每天1次、每天10次至每天1次、或每天5次至每天1次给予受试者。在一些实施方案中，组合物可以以每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次、每天7次、每天8次、9每天一次、每天10次或更多次给予受试者。在一些实施方案中，组合物可以以每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周一次、每2周一次、每3周一次或每月一次给予受试者。在一些实施方案中，该组合物可以以连续方式给予动物，例如其中动物以本主题组合物的连续可用的供应来进食。
在一些实施方案中，组合物的剂量在每天约1mg/kg体重和每天约5000mg/kg体重之间。在一些实施方案中，宠物食品的剂量在每天约5mg/kg体重至每天约1000mg/kg体重之间、每天约10mg/kg体重至约500mg/kg体重之间、每天约10mg/kg体重至每天约250mg/kg体重之间、每天约10mg/kg体重至每天约200mg/kg体重之间、每天约20mg/kg体重至每天约100mg/kg体重之间、每天约20mg/kg体重至每天约50mg/kg体重之间或它们的任何中间范围。在一些实施方案中，宠物食品的剂量为每天至少约1mg/kg体重、每天至少约5mg/kg体重、每天至少约10mg/kg体重、每天至少约20mg/kg体重、每天至少约50mg/kg体重、每天至少约100mg/kg体重、每天至少约200mg/kg体重或更多。在一些实施方案中，宠物食品的剂量为每天不超过约5mg/kg体重、每天不超过约10mg/kg体重、每天不超过约20mg/kg体重、每天不超过约50mg/kg体重、每天不超过约100mg/kg体重、每天不超过约200mg/kg体重、每天不超过约500mg/kg体重或更多。
在一些实施方案中，组合物的量在喂养伴侣动物的过程中减少。在一些实施方案中，组合物的浓度在喂养伴侣动物的过程中增加。在一些实施方案中，组合物的浓度基于伴侣动物的年龄而改变。
在某些非限制性实施方案中，本公开的主题提供了一种用于治疗有需要的伴侣动物的肠道生态失调和/或改善肠道健康的方法。在一些实施方案中，该方法包括：a)测量伴侣动物的一种或多种肠道微生物的第一量；b)给予伴侣动物本公开的组合物以治疗肠道疾病和/或改善肠道健康；c)在步骤b)之后测量受试者的肠道微生物的第二量；和d)当所述肠道微生物的所述第二量与所述肠道微生物的所述第一量相比发生变化时，继续给予本公开的组合物。
在一些实施方案中，所述肠道微生物选自denovo1184、denovo1244、denovo1696、denovo2407、denovo2451、denovo283、denovo3487、denovo4154、denovo4328、denovo4681、denovo498、denovo5338、denovo6995、denovo943(如PCT US2020/014292或WO2020/150712中定义的)及其任何组合，并且其中步骤d)包括当所述肠道微生物的所述第二量与所述肠道微生物的所述第一量相比增加时，继续施用该治疗方案。在某些实施方案中，所述肠道微生物选自普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)、霍尔德曼氏菌两形真杆菌(Holdemania[Eubacterium]biforme)及其任何组合。
在一些实施方案中，在步骤b)之后约7天至约14天之间测量肠道微生物的第二量。在某些实施方案中，在步骤b)后约21天内、约14天内、约12天内、约10天内、约7天内、约6天内、约5天内、约4天内、约3天内、约2天内或约1天内肠道微生物的量增加。在某些实施方案中，在步骤b)后约1天至约21天内、约1天至约14天内、约3天至约14天内、约5天至约14天内、约7天至约14天内、约10天至约14天内或约7天至约21天内肠道细菌的量增加。
在一些实施方案中，所述肠道微生物选自denovo1214、denovo1400、denovo1762、denovo2014、denovo2197、denovo2368、denovo3663、denovo4206、denovo4485、denovo6368、denovo7117、denovo4881及其任何组合，并且其中步骤d)包括当所述肠道微生物的所述第二量与所述肠道微生物的所述第一量相比减少时，继续给予所述组合物。
在一些实施方案中，在步骤b)之后约7天至约14天之间测量肠道微生物的第二量。在某些实施方案中，在步骤b)后约21天内、约14天内、约12天内、约10天内、约7天内、约6天内、约5天内、约4天内、约3天内、约2天内或约1天内肠道微生物的量减少。在某些实施方案中，在步骤b)后约1天至约21天内、约1天至约14天内、约3天至约14天内、约5天至约14天内、约7天至约14天内、约10天至约14天内或约7天至约21天内肠道细菌的量减少。
在一些实施方案中，肠道微生物的参考量是多个健康伴侣动物的肠道微生物的平均量。在一些实施方案中，肠道微生物的参考量在多个健康伴侣动物的肠道微生物的平均量的约三个标准差范围内。在一些实施方案中，肠道微生物的参考量在多个健康伴侣动物的肠道微生物的平均量的约两个标准差范围内。在一些实施方案中，肠道微生物的参考量在多个健康伴侣动物的肠道微生物的平均量的约一个标准差范围内。
在一些实施方案中，可通过本领域已知的任何方法测定肠道微生物的量。在一些实施方案中，该方法包括但不限于检测与微生物相关的蛋白质/抗原的基于抗体的检测方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、蛋白质印迹；以及检测与微生物相关的16s rRNA的方法，例如实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量聚合酶链式反应(qPCR)、DNA测序和微阵列分析。在一些实施方案中，微阵列包括用于检测本文公开的任何肠道微生物的探针。
在一些实施方案中，治疗方案可以是本领域已知的生态失调的任何治疗方案。在一些实施方案中，治疗方案包括本文公开的治疗方法。
在一些实施方案中，肠道细菌的量从受试者的粪便样品中测量。
对照数据集
在一些实施方案中，将细菌的种的丰度与来自具有相似实际年龄的犬科动物(例如幼年犬科动物、成年犬科动物、较老犬科动物或老年犬科动物)的对照数据集进行比较。
可替代地或另外地，可制备对照数据集。为此，可以分析两只或更多(例如，3、4、5、10、15、20或更多)健康犬科动物的微生物组，以确定微生物组中所含物种的丰度。在这种情况下，健康的犬科动物是尚未诊断出患有已知影响微生物组的疾病的犬科动物。此类疾病的实例包括肠易激综合征、溃疡性结肠炎、克罗恩病和炎症性肠病。优选地，犬科动物没患有生态失调。生态失调是指体内微生物群失衡，这是由于肠道中关键细菌(keystonebacteria)(例如双歧杆菌(bifidobacteria)，如长双歧杆菌亚种婴儿双歧杆菌(B.longumsubsp.infantis))水平不足或有害细菌过多。用于检测生态失调的方法是本领域众所周知的。两只或更多犬科动物通常来自特定的生命阶段。例如，它们可以是幼年犬科动物、成年犬科动物、较老犬科动物或老年犬科动物。这很有用，因为微生物组在犬科动物的一生中发生变化，因此需要将微生物组与处于同一生命阶段的犬科动物进行比较。在犬科动物是狗的情况下，对照数据集还可来自相同品种的狗，或在狗是杂种狗的情况下，来自狗的直系祖先(父母或祖父母)之一的相同品种。
制备对照数据集的具体步骤可包括分析至少两只(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多)幼年犬科动物的微生物组组成，和/或至少两只(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多)成年犬科动物，和/或至少两只(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多)较老犬科动物和/或至少两只(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多)老年犬科动物；确定细菌物种(特别是上文讨论的那些)的丰度；并将这些数据编译成对照数据集。
对于测定微生物组的多样性指数的实施方案，可以以类似的方式准备对照数据集。特别地，多样性指数可以在特定生命阶段(幼犬、成年、较老或老年)的两只或更多健康犬科动物中测定。然后可以使用结果来确定犬科动物在该生命阶段的多样性指数的平均范围。
应当理解，不需要每次执行本文公开的方法时都制备对照数据集。相反，技术人员可以依赖已建立的对照集。
允许技术人员检测和定量细菌分类群的技术在本领域中是众所周知的。这些技术包括例如16S rDNA扩增子测序、鸟枪法测序、宏基因组测序、Illumina测序和纳米孔测序。优选地，细菌分类群通过对16s rDNA序列进行测序来确定。
在一些实施方案中，细菌分类群通过对V4-V6区域进行测序来确定，例如使用Illumina测序。这些方法可使用如PCT US2020/014292或WO2020/150712中描述的引物319F：和806R。
细菌的种还可通过本领域已知的其他方式来检测，例如RNA测序、蛋白质序列同源性或指示细菌的种的其他生物标记物。
然后，可以使用测序数据来确定样品中存在或不存在不同细菌分类群。例如，序列可以以98％、99％或100％的同一性聚类，然后可评估丰度的分类群(例如，代表总序列的0.001以上的那些)的相对比例。合适的技术是本领域已知的，并且包括例如逻辑回归、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)或随机森林分析和其他多变量方法。
犬科动物
本文公开的方法可用于确定犬科动物的微生物组的健康。该属包括家养狗(Canislupus familiaris)、狼、郊狼(coyote)、狐狸、豺狼(jackal)、野狗(dingoe)，并且本发明可用于所有这些动物。最优选地，受试者是家养狗，在本文中简称为狗。
犬科动物可为健康的。“健康”可是指未诊断出患有已知影响微生物组的疾病的犬科动物。所述疾病的实例包括肠易激综合征(irritable bowel syndrome)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、克罗恩病(Crohn's disease)和炎症性肠病(inflammatory boweldisease)。最优选地，犬科动物不患有生态失调。生态失调是指体内的微生物组失衡，其原因是肠道中关键细菌(如双歧杆菌，例如长双歧杆菌婴儿亚种)水平不足或有害细菌过多。检测生态失调的方法是本领域已知的。
本文公开的方法的一个优点是，考虑到犬科动物的生命周期，其允许技术人员确定犬科动物的微生物群是否健康。
有许多不同品种的家养狗，它们表现出不同的习性。不同品种也具有不同的预期寿命，其中较小的狗通常比较大型犬的寿命更长。因此，认为不同品种在其生命的不同时间点为幼年、成年、较老或老年。下表提供了不同生命阶段的总结。
表4
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玩具型、小型、中型和大型品种之间的区别在本领域中是已知的。特别地，玩具品种包括不同的品种，例如阿芬平猎犬(Affenpinscher)、澳洲丝毛梗(Australian SilkyTerrier)、比熊犬(Bichon Frise)、博洛尼亚犬(Bolognese)、骑士国王查尔斯猎犬(Cavalier King Charles Spaniel)、吉娃娃(Chihuahua)、中国冠毛犬(ChineseCrested)、棉花面纱犬(Coton De Tulear)、英国玩具梗犬(English Toy Terrier)、布鲁塞尔格里芬犬(Griffon Bruxellois)、哈瓦那犬(Havanese)、意大利灵缇犬(ItalianGreyhound)、日本狮子犬(Japanese Chin)、查理士王小猎犬(King Charles Spaniel)、罗成犬(Lowchen)(小狮子犬(Little Lion Dog))、马耳他犬(Maltese)、迷你杜宾犬(Miniature Pinscher)、巴比伦犬(Papillon)、北京犬(Pekingese)、博美犬(Pomeranian)、哈巴狗(Pug)、俄罗斯玩具犬(Russian Toy Terrier)和约克夏犬(Yorkshire Terrier)。
小型品种比玩具型品种平均更大，平均体重最高达10kg。示例性品种包括法国斗牛犬(FrenchBulldog)、小猎犬(Beagle)、腊肠犬(Dachshund)、彭布罗克威尔士柯基(Pembroke Welsh Corgi)、迷你施诺茨骑士(Miniature Schnautzer)、骑士查理王猎犬(Cavalier King Charles Spaniel)、狮子狗(Shih Tzu)和波士顿梗犬(Boston Terrier)。
中型犬种的平均体重约为11-26kg。这些犬种包括斗牛头犬(Bulldog)、可卡犬(Cocker Spaniel)、喜乐蒂牧羊犬(Shetland Sheepdog，)、边境牧羊犬(Border Collie)、巴塞特猎犬(Basset Hound)、西伯利亚哈士奇(Siberian Husky)和达尔马提亚犬(Dalmatian)。
大型品种是指平均体重为至少27kg的品种。实例包括大丹犬(Great Dane)、那不勒斯獒犬(Neapolitan mastiff)、苏格兰猎鹿犬(Scottish Deerhound)、波尔多公犬(Dogue deBordeaux)、纽芬兰獒犬(Newfoundland)、英国獒犬(English mastiff)、圣伯纳德獒犬(SaintBernard)、莱昂伯格(Leonberger)和爱尔兰猎狼犬(Irish Wolfhound)。
杂交品种通常可根据根据其体重分为玩具型、小型、中型和大型狗。
样品
本文公开的方法通常使用粪便样品或来自犬科动物胃肠腔的样品。粪便样品非常方便，因为它们的收集是非侵入性的，而且还允许在一段时间内对个体进行简单的重复采样。本发明还可使用其他样品，例如回肠、空肠、十二指肠样品和结肠样品。
样品可为新鲜样品。在用于本发明方法之前，还可通过诸如添加到保存缓冲液中的其他方式或通过使用诸如冷冻干燥的方法进行脱水使样品冷冻或稳定化。
在用于本文公开的方法之前，通常对样品进行处理以提取DNA。分离DNA的方法在本领域中是众所周知的，如参考文献Hart等人(2015)公共科学图书馆·综合(PLoSone).Nov24；10(11)：e0143334所述。合适的方法包括例如QIAamp Power粪便DNA试剂盒(Qiagen)。
改变微生物组
在一些实施方案中，所述方法可包括改变微生物组的组成的其他步骤。这可以通过给予饮食改变、功能性食品或营养组合物、能够改变微生物组组成的药物组合物来实现。所述功能性食品、营养组合物、活性生物治疗产品(LBP)和药物组合物在本领域中是众所周知的，并且包括细菌(参见WO2018/006080)。它们可以包含选自双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)的单一细菌物种，例如动物双歧杆菌(B.animalis)(例如，动物双歧杆菌动物亚种(B.animalis subsp.animalis)或动物双歧杆菌乳亚种(B.animalissubsp.lactis))、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、短双岐杆菌(B.breve)、长双歧杆菌(B.longum)(例如长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subsp.Infantis)或例如长双歧杆菌长亚种(B.longum subsp.Longum))、假长型双歧杆菌(B.pseudolongum)、青春型双岐杆菌(B.adolescentis)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)或假链状双歧杆菌(B.pseudocatanulatum)；乳杆菌属(Lactobacillus)的单一细菌物种，例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、胃窦乳杆菌(L.antri)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、人阴道乳杆菌(L.coleohominis)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、粘膜乳杆菌(L.mucosae)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、类干酪乳杆菌(L.paracasei)、北里乳杆菌(L.kisonensis)、类消化乳杆菌(L.paralimentarius)、恶味乳杆菌(L.perolens)、蜜蜂乳杆菌(L.apis)、加纳乳杆菌(L.ghanensis)、糊精乳杆菌(L.Dextrinicus)、深圳乳杆菌(L.shenzenensis)、哈尔滨乳杆菌(L.harbinensis)；或片球菌属(Pediococcus)的单一细菌物种，例如小片球菌(P.parvulus)、洛丽片球菌(P.lolii)、乳酸片球菌(P.acidilactici)、阿根廷片球菌(P.argentinicus)、克氏片球菌(P.claussenii)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)或斯氏片球菌(P.stilesii)；或肠球菌属(Enterococcus)的相似细菌物种，例如屎肠球菌(E.faecium)，或芽孢杆菌属(Bacillus)物种例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、印度芽孢杆菌(B.indicus)或克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)。此外，可使用这些细菌的种以及其他细菌物种的组合。
当犬科动物的微生物组年龄与其实际年龄不绝对一致时，这些方法可为有用的。例如，本文公开的方法可揭示成年狗具有代表较老狗或老年狗的微生物组组成和多样性。如上所述，认为与成年微生物群相关的特征是最健康的微生物组特征，因此在这些情况下，非常希望使老年狗的饮食改变和/或给予功能性食品、营养或药物组合物，以使微生物组转换回成年微生物组组成/状态。
类似地，可希望改变微生物组，使微生物组的生物年龄状态与犬科动物的实际年龄不一致。例如，患有复发性腹泻的较老或老年生命阶段的较老的狗可受益于接受饮食改变、功能性食物、营养品、LBP或药物组合物，以使微生物组转换为代表成年狗的微生物组。
在一些方面，本文公开的方法还可用于评估如上所述的治疗的成功性。为此，犬科动物可接受饮食改变、功能性食品、补充剂、LBP、营养或药物组合物或运动/体力活动方案，其能够改变微生物组的组成。在通过营养或运动给予治疗后(例如，1天、2天、5天、1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月等之后)，可使用本发明的任何方法评估微生物组年龄。优选地，在给予饮食改变、功能性食品、补充剂、LBP、营养组合物或药物组合物或运动/体力活动方案之前和之后，测定微生物组生物年龄状态。
监测
在一些方面，可将本文公开的组合物给予被监测的伴侣动物。第一次实施所述方法时，测定伴侣动物的微生物组年龄，并且在给予本文公开的组合物后，重复所述方法以评估所述组合物的影响。还可在犬科动物接受治疗后首次确定微生物组的生物年龄状态，然后重复所述方法以评估微生物组的生物年龄状态是否变化。
所述方法可间隔几天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月或36个月以上进行重复。
概述
如本文所用，术语“包括/包含(comprise、comprising)”及其任何变体旨在涵盖非排他性的包括，使得包含一系列要素的工艺、方法、制品或设备不仅包括所述要素，还可包括未明确列出的或所述工艺、方法、制品或设备固有的其他要素。
与数值x相关的术语“约”是可选的并且表示例如x±10％。
术语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，本发明的方法的定义中可以省略“基本上”一词。
提及两个核苷酸序列之间的百分比序列同一性是指，当比对时，在比较两个序列时，该百分比的核苷酸是相同的。可使用本领域已知的软件程序来确定该比对和同源性百分比或序列同一性。使用BLAST(基本局部比对搜索工具)算法或Smith-Waterman同源性搜索算法确定优选的比对，使用仿射间隙搜索，间隙开放罚分为12，间隙扩展罚分为2，BLOSUM矩阵为62。比对可以在整个参考序列上进行，即它可以在本文公开的序列的100％长度上进行。
除非特别说明，否则包括多个步骤的过程或方法可在方法开始或结束包括另外的步骤，或可包括另外的中间步骤。此外，如果合适，可组合、省略或以替代顺序执行步骤。
本文描述了本发明的方法的各种实施方案。应当理解，每个实施方案中指定的特征可与其他指定的特征组合，以提供进一步的实施方案。特别地，在此强调为合适的、典型的或优选的实施方案可彼此组合(除非它们是相互排斥的)。
本发明的实施方式
实施例1：影响并从而改善或增强狗的肠道微生物组或微生物群的方法
发明人进行了一项调查，以研究老年狗的肠道菌群组成和氨基酸代谢功能的变化，并将老年狗的微生物群和微生物组(通过PICRUST)与成年狗进行比较。在本研究中，检查了喂食治疗性饮食的较老的狗(如老年狗)肠道菌群的变化，并与成年狗的肠道菌群进行比较。
材料和方法
10只比格犬参与该研究。在研究前的3个月内，没有一只狗接受药物治疗。它们临床上无症状，根据CBC、血清生化、尿液分析、粪便试验和腹部超声检查确认没有消化系统疾病。分别有五只狗纳入老年狗组和成年狗组。
给每只狗喂食市售成年狗维持饮食，为期3周，作为稳定期和引入期。然后，给老年组的5只狗喂食不同配方的饮食，所述配方含有通过复合不溶性纤维和可溶性纤维(包括短链益生元)的混合物赋予的更高水平的膳食纤维，持续3周，然后使动物恢复基础维持饮食再持续3周(图1)。在将狗转换为替代饮食的每个时间点(第0天：即基础饮食21天后；第21天：即转换为试验配方饮食21天后；第42天：即恢复基础饮食21天后)进行血液学和生物化学测试，并将血清储存在-80℃下。人工收集粪便，并立即储存在-80℃下连续3天，随后进行分析。
在每个采样时间点，测量CBC、血清生化、差异白细胞计数和淋巴细胞亚集，并测量冷冻血清样品的氨基酸组分。
使连续3天收集的粪便样品集中备用(pool)，使用IlluminaMiSeq和QIIME管道软件1.8版对16S rRNA基因V3-V4区域进行16S分析，并对每个样品的菌群组成进行分析。此外，基于KEGG Orthology使用PICRUSt对功能基因组成进行预测分析。
使用Fisher精确检验或Dunnett检验分析各组在年龄、性别、体重、肠道菌群多样性得分和血清氨基酸分数浓度方面的差异，使用Kruskal-Wallis检验和Friedman检验(StatMate III，ATM)分析老年组中试验饮食引起的变化。使用相似性分析(ANOSIM，引物6)对各组之间的肠道菌群组成进行相似性分析，并使用线性判别分析效应量法(lineardiscriminant analysis effect size method)分析每个细菌的种和预测功能基因的组成比的差异(LEfSe：https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/).
结果
2个组的性别和体重如表6所示。两组之间没有显著差异。在整个试验饮食喂养期间，未观察到任何动物出现消化症状。
在血液测试中，老年组的WBC、Lym和Mon显著低于成年组，尤其是CD3+、CD4+、CD8+和Foxp3+淋巴细胞计数显著低于成年组(表7)。此外，当狗接受试验高纤维饮食时，观察到CD3+和CD4+淋巴细胞计数显著增加，但Foxp3+淋巴细胞计数没有变化。老年组的TG水平显著较高，对于年长的狗这一点通过饮食得到改善。
当比较血清氨基酸组分时，老年组的丝氨酸、甘氨酸和肌肽水平显著降低，并且这些水平没有因改变饮食而发生显著变化(表8)。然而，老年组的赖氨酸水平明显较高，并且观察到与饮食有关。给狗喂食高纤维试验饮食与降低到与成年组相当的水平有关。此外，高纤维试验饮食稍微降低了几种氨基酸，如天冬氨酸、肌氨酸、脯氨酸、α-氨基丁酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸和精氨酸。
在16S分析中，每个样品平均获得215,394个序列导联(sequence lead)(中位数：221,640，范围：164,416-250,500)。进行稀疏度分析以避免样品之间序列深度差异的影响(图3)。由于当提取超过10,000个导联时所有样品都达到一个特定的平台(specificplateau)，因此在下面的分析中，从每个样品中随机提取10,000个导联。每组制备一条曲线。红色：成年组，橙色：老年组(第0天)，绿色：老年组(第21天)，蓝色：老年组(第42天)。数据以平均值±标准差表示。按照顺序，当查看每个样品标记的30000个序列时，从最高值到最低值的曲线稀疏度测量：橙色、绿色、红色，然后是蓝色。
为了比较肠道菌群的多样性，计算检测到的OTU数量以及PD、Chao1和香农指数。组别或饮食干预之间的微生物多样性指数均无显著差异(表9)。
在基于未加权unifrac距离的主成分分析中，各组狗之间的细菌物种组成没有显著差异(ANOSIM；GlobalR＝0.095，P＝0.094)(图4A)。基于加权unifrac距离的主成分分析确定，老年狗在接受高纤维试验饮食3周后第21天的菌群组成与恢复基础饮食后第42天的菌群组成以及成年组的菌群组成显著不同(方差分析(ANOSIM)；总体(Global)R＝0.203，P＝0.050；第21天与第42天相比，R＝0.312，P＝0.024；第21天与成年组相比，R＝0.448，P＝0.008)，但第0天老年组的菌群组成与第21天或成年组显著不同(第0天与成年相比，R＝0.168，P＝0.079；第0天与第21天相比，R＝-0.016，P＝0.540)(图4B)。
图4的图表根据未加权的unifrac距离(A)和加权的unifrac距离(B)绘制。随着点间距的减小，样品之间菌群组成的相似性增加。成年狗：
Figure BDA0003582181400000351
老年狗：第0天，
Figure BDA0003582181400000352
第21天，
Figure BDA0003582181400000353
第42天，
Figure BDA0003582181400000354
接下来，使用LEfSe法比较组别之间肠道菌群的组成比率。尽管观察到厚壁菌门(Firmicute)总体下降，但是老年组中的一些毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)物种明显高于成年狗(图5)。图5(A)显示了各组细菌物种的量的变化的柱状图。图5(B)显示了检测到的成分细菌物种的分支图。同心圆从中心开始分别代表界、门、纲、目、科和属，并且一个点代表一个细菌的种。老年犬中增加的细菌物种和成年犬中增加的细菌物种以不同的颜色呈现。此外，还观察饮食的治疗效果，而接受高纤维试验饮食的狗的粪便中检测到的栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)和毛螺旋菌属(Lachnospira)显著增加，并且肠杆菌目(Enterobacteriales)(包括大肠杆菌属(Escherichia))显著减少(图6)。图6(A)显示了各组细菌物种的量的变化的直方图。图6(B)显示了检测到的成分细菌物种的分支图。在第0天和第21天典型增加的细菌物种以不同的阴影(shade)呈现。在第42天没有典型增加的细菌物种。
当采用LEfSe的Kruskal-Wallis检验的α水平设置为0.05以比较PICRUSTt在KEGGOrthology 3级水平(at KEGG Orthology class 3 level)上预测的功能基因组成时，与成年组相比，老年组的醚脂质代谢相关基因减少，组氨酸代谢相关酶、肽酶以及甘油磷脂和葡萄糖代谢相关酶更高，表明检测到营养代谢相关基因的差异(图7)。老年狗和成年狗增加的功能以不同的阴影呈现。此外，当给狗喂食高纤维试验饮食21天时，检测到与几种氨基酸(包括脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)代谢相关的基因增加(图8)。在第0天、第21天和第42天典型增加的功能以不同的阴影呈现。其中，第0天代表基础饮食21天后的粪便微生物组组成，第21天代表转换为试验配方饮食“B”21天后的粪便微生物组组成，第42天代表再恢复基础饮食21天后的粪便微生物组组成。
在整个饮食变化期间，对5只狗中检测到的细菌“簇”或分类群的组成比率(相对丰度)进行多因素分析(FactoMineR library)，得出视觉蜘蛛图，代表群组中观察到的总微生物群的总组成特征(图9)。分析表明，在三个研究时间点阶段(饮食)有明显的变化(movement)(第0天(开始喂食基础维持饮食3周后)；第21天(狗转换为高纤维试验饮食“B”后的3周)；和第42天(恢复喂食基础维持饮食后的3周))。
通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对群组中观察到的105个簇(细菌分类群)的相对丰度(组成)进行比较，可检测到细菌簇的子集。这些细菌簇或分类群代表了分层聚类算法(可根据要求提供数据)创建的相关图中最具影响力的细菌簇或分类群。该子集中的细菌簇限定为变量投影重要性(variable importance inprojection)(VIP)得分大于1。观察到总共26个细菌分类群(几乎占检测到的丰富分类群的25％)的VIP评分等于或大于1。这26个细菌分类群的子集代表了在描述微生物群与饮食的相互作用方面最具影响力的细菌分类群。图10是PLS-DA关联图，显示了在喂食饮食A3周后(第0天)，在转换为饮食B(第21天)和随后恢复到基础饮食A后(第42天)，5条狗的3天粪便样品中26个细菌簇(分类群)的粪便微生物群相对组成的相关性。当去除个体狗效应时，在生成的簇中可清楚地观察到饮食效应，饮食效应集中在PLS-DA中描述的26个分类群上(表5)。
讨论
在该研究中，与接受优质市售基础饮食的狗相比，观察到喂给高纤维试验饮食的狗的肠道菌群(微生物群)、功能基因组成(微生物组)和血液氨基酸组分的可检测变化。
26个细菌分类群的子集代表了在描述饮食中微生物群的组成变化方面最具影响力的细菌分类群，并且再恢复基线饮食后三周内，再次持续观察到组成变化，这表明治疗效果确实与饮食变化有关。这些研究结果描述了成分对狗肠道微生物群的影响，即使在类似形式的饮食和常量营养组成的饮食之间，并且表明通过营养优化的饮食计划，可对狗的微生物群产生长期影响。
通过喂给高纤维试验饮食，肠道菌群组成比率显著改变。喂给高纤维试验饮食后，栖粪杆菌(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blauti)、毛螺旋菌属(Lachnospira)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)增加。这些物种都属于梭菌簇IV和XIVa，通过短链脂肪酸的产生在消化道的环境稳定中发挥作用(Schmitz2016；Honneffer等人，2014)。
短链脂肪酸在诱导肠粘膜调节性T细胞分化中起重要作用；然而，没有观察到淋巴细胞亚群(包括外周血CD4+和Foxp3+淋巴细胞，即调节性T细胞)的重大变化。这可能是由于碳水化合物和脂肪酸(如丁酸)代谢相关基因显著增加的影响，尽管产生短链脂肪酸的细菌增加。另一方面，当动物接受高纤维试验饮食时，包括大肠杆菌在内的肠杆菌物种(已知其随年龄的增长在整个消化道广泛增加(Honneffer等人，2014))减少，这表明该研究中的试验饮食在菌群水平上改善了肠道环境。因此，其预计有助于预防消化系统疾病，提高胃肠道抵抗力。
研究了高纤维试验饮食诱导的功能基因组成的变化。当狗接受高纤维试验饮食时，与脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等几种氨基酸代谢相关的基因增加。通常认为代谢相关基因的增加对宿主有益，但是在喂给老年狗所述饮食后，血清天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸和脯氨酸降低。
老年狗的丝氨酸、甘氨酸和肌肽等几种氨基酸组分的水平低于成年组。还观察到饮食对循环氨基酸水平的治疗效果，包括当动物接受高纤维试验饮食时，观察到的天冬氨酸、丝氨酸、肌氨酸、脯氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、1-甲基组氨酸和3-甲基组氨酸、肌肽、鸟氨酸和精氨酸的减少。
当狗接受高纤维试验饮食时，观察对肠道细菌群的群落组成比率的饮食治疗影响。值得注意的是，当动物接受高纤维试验饮食时，与其他哺乳动物健康相关的多种微生物水平显著增加。其中包括栖粪杆菌(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blauti)、毛螺菌属(Lachnospira)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的种，所有这些物种都属于梭菌簇IV和XIVa。这些细菌水平的增加与短链脂肪酸的产生、胃肠道管腔的酸化以及能量利用率的提高和不可消化碳水化合物的代谢有关。因此，它们是对病原体和机会性致病物种(例如来自变形杆菌且尤其是肠杆菌科的细菌，其中包括许多细菌病原体和机会性致病生物体)的感染具有增强的胃肠道抵抗力的指标。作为革兰氏阴性菌，其为固有地酸敏感的，并且在SCFA水平较高的环境中通常会被淘汰。在报告的研究中，还检测到这些表明胃肠道抵抗力的治疗效果，其中在动物接受试验饮食时在粪便中观察到的肠杆菌、包括大肠杆菌显著减少。当狗接受高纤维试验饮食时，还观察到微生物组的组成在功能基因和血清氨基酸组分方面的可检测变化，所述功能基因使用PICRUST从微生物群预测。尽管参与研究的所有狗都是健康的并且从而在本研究中没有强调这些变化的临床影响，但是肠道细菌群和微生物组的变化与胃肠道健康以及医学和兽医领域的许多慢性疾病有关。26个细菌分类群的组合最能描述饮食对微生物群的影响。喂食高纤维试验饮食增加了14个细菌序列簇的相对丰度，当通过数据库搜索指定细菌分类群时，这些序列簇包括布劳特氏菌属(Blautia)和苏黎世杆菌属(Turicibacter)的细菌健康特征的代表。因此，本研究中评估的高纤维试验饮食代表了可增强胃肠道微生物群和肠道微生物组的适当的饮食干预措施。
图示了上皮细胞、粘液屏障、免疫细胞和肠道菌群之间的主要相互作用。A：保持体内平衡的状态。管腔中存在多种细菌，树突状细胞直接或通过M细胞识别它们，以区分它们是否致病，然后进行免疫消除(由IL-22介导的粘蛋白和抗菌肽产生)或抗炎反应(调节性T细胞的诱导和分化)。肠道菌群(尤其是梭菌簇IV和XIVa)产生的短链脂肪酸通过促进肠上皮细胞(紧密连接)和粘蛋白产生之间的粘附加强粘膜屏障，并促进调节性T细胞分化。B：导致慢性肠炎的肠道菌群变化的状态。机会病原体(黄色)和致病菌(红色)相对增加，多样性丧失。认为在这种状态下，树突状细胞通过抗原呈递促进向Th1和Th17细胞的分化，并产生大量炎性细胞因子，如IL-17、IL-22和IFNγ，从而诱发肠炎。此外，属于梭菌簇IV和XIVa的细菌物种减少，从而减少短链脂肪酸的产生和调节性T细胞分化的诱导。随后，粘膜屏障的形成减弱，病原体的粘膜侵入增加并加重肠炎，形成恶性循环(引用参考文献3，部分修改)。
Figure BDA0003582181400000391
表6.每组特征
Figure BDA0003582181400000401
所有值均以平均值±标准差表示。
*Kruskal-Wallis检验
表7.各组血液检测结果
Figure BDA0003582181400000411
所有的值都以平均值±标准差表示。
*Kruskal-Wallis检验；**与成年组有显著差异(Dunnett检验)；
Figure BDA0003582181400000412
与第0天有显著差异(Friedman检验)；
Figure BDA0003582181400000413
与第21天有显著差异(Friedman检验)
表8.各组的血清氨基酸组分
Figure BDA0003582181400000421
所有的值都以平均值±标准差(nmol/mL)表示。
*Kruskal-Wallis检验；**与成年组有显著差异(Dunnett检验)；
Figure BDA0003582181400000431
与第0天有显著差异(Friedman检验)；
Figure BDA0003582181400000432
与第21天有显著差异(Friedman检验)
表9.各组肠道菌群α多样性指数
Figure BDA0003582181400000433
所有的值都以平均值±标准差表示。
*Kruskal-Wallis检验。

Claims (65)

1.一种适于给予伴侣动物的组合物，所述组合物包含至少3种选自以下成分：约0.005克/天至约0.165克/天的绿茶多酚，约0.5克/天至约33克/天的小麦，约0.2克/天至约30.8克/天的纤维素，总量为约0.1克/天至约11.0克/天的菊苣浆和/或甜菜浆；约0.08克/天至约2.2克/天的番茄渣(番茄红素)和约0.025克/天至约2.2克/天的低聚果糖。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包含所有的所述成分。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，所述组合物包含至少一种选自L-肉碱、硫酸软骨素、葡萄糖胺、叶黄素及羟脯氨酸胶原蛋白的其他成分。
4.根据权利要求3所述的组合物，所述组合物包含所有的所述其他成分。
5.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中组合的菊苣浆和/或甜菜浆的范围为0.1至6.6克/天。
6.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述组合物为完全营养食品，且所述食品的至少一部分包含干物质。
7.根据权利要求7所述的组合物，其中以所述食品中干物质的百分比计，所述食品的营养谱包含约7.5％至约19.8％膳食纤维、约10.0％至约19.8％粗脂肪、约2.5％至约44.0％蛋白质及约0.08％至约4.4％难消化蛋白质。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述组合物为不完全营养的，并且所述食品的至少一部分包含干物质。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物是补充剂、配料或增强剂。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中以所述组合物中干物质的百分比计，所述食品的营养谱为约0.9％至约99.9％膳食纤维、约1.0％至约19.8％粗脂肪、约2.5％至约44.0％蛋白质和约0.08％至约4.4％难消化蛋白质。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述伴侣动物为犬科动物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物用于药物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物用于治疗伴侣动物的胃肠失调、软便、稀便或胃肠失调。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物用于改变伴侣动物的微生物组。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物用于改变或增加伴侣动物的CD3+和/或CD4+淋巴细胞计数。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物用于改变或降低伴侣动物的循环甘油三酯水平。
17.一种通过给予伴侣动物权利要求1至12中任一项所述的组合物改变伴侣动物的微生物组的方法。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述微生物组为伴侣动物的胃肠微生物组。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的方法，其中所述伴侣动物是犬科动物。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中根据权利要求17和18所述的伴侣动物或根据权利要求19所述的犬科动物是较老动物或老年动物。
21.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括测定伴侣动物的微生物组的健康的第一步骤，并且当在第一步骤中检测到健康或不健康的微生物组、优选不健康的微生物组时，将所述组合物给予所述伴侣动物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一步骤包括检测从所述伴侣动物获得的样品中的至少两个、优选至少三个或至少四个细菌分类群；其中，所述至少两个、优选至少三个或至少四个细菌分类群的存在指示健康的微生物组。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述伴侣动物是犬科动物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述细菌分类群选自栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、异杆菌属(Allobaculum)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、史雷克氏菌属(Slackia)、毛螺菌属(Lachnospira)、罗斯氏菌属(Roseburia)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的组中的至少两个。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述细菌分类群是选自毛螺菌科(Lachnospiraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)和苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)的组中的至少三个的细菌的科。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述细菌分类群是选自布劳特氏菌属(Blautia)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、链状杆菌属(Catenibacterium)、异杆菌属(Allobaculum)、梭杆菌属(Fusobacterium)及苏黎世杆菌属(Turicibacter)的组中的至少两个的细菌的属。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一步骤包括检测从所述伴侣动物获得的样品中的至少两个、优选至少三个或至少四个细菌分类群；其中，所述至少两个、优选至少三个或至少四个细菌分类群的存在指示不健康的微生物组。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述伴侣动物是犬科动物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述细菌分类群选自肠杆菌属(Enterobacteriales)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、变形菌门(Proteobacteria)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)的组中的至少两个。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述细菌分类群来自科，所述科选自梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaeae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、拟杆菌科(Bacteriodaceae)的组中的至少三个。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述细菌分类群来自细菌的属，所述细菌的属选自梭杆菌属(Fusobacterium)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、史雷克氏菌属(Slackia)、巨单胞菌属(Megoamonas)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、拟杆菌属(Bacteroides)的组中的至少两个。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一步骤包括将从所述伴侣动物获得的样品中的至少两个、优选至少三个或至少四种细菌分类群进行定量，以确定其丰度；以及将所确定的丰度与对照数据集中相同分类群的丰度进行比较；其中，所述至少两个、优选至少三个或至少四个细菌分类群的丰度相对于对照数据集的增加或减少指示不健康的微生物组。
33.根据权利要求32所述的方法，其中确定的丰度相对于对照数据集的减少指示不健康的微生物组。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细菌分类群选自栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、异杆菌属(Allobaculum)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、史雷克氏菌属(Slackia)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、罗斯氏菌属(Roseburia)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的组中的至少两个。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述细菌分类群是选自毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae,)和苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)的组中的至少三个的细菌的科。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述细菌分类群是选自布劳特氏菌属(Blautia)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、链状杆菌属(Catenibacterium)、异杆菌属(Allobaculum)、梭杆菌属(Fusobacterium)、苏黎世杆菌属属(Turicibacter)的组中的至少两个的细菌的属。
37.根据权利要求32所述的方法，其中确定的丰度相对于对照数据集的增加指示不健康的微生物组。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述细菌分类群选自肠杆菌目(Enterobacteriales)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、变形菌门(Proteobacteria)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)的组中的至少两个。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述细菌分类群是选自梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaeae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、拟杆菌科(Bacteriodaceae)的组中的至少三个的科。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述细菌分类群选自梭杆菌属(Fusobacterium)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、史雷克氏菌属(Slackia)、巨单胞菌属(Megoamonas)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、拟杆菌属(Bacteroides)的组中的至少两个的细菌的属。
41.根据权利要求32至40中任一项所述的方法，其中所述伴侣动物是犬科动物。
42.根据权利要求32至41中任一项所述的方法，其中所述对照数据集包括来自处于相同生命阶段的伴侣动物、优选犬科动物的数据集。
43.根据权利要求17至42中任一项所述的方法，其中根据权利要求17至18、20、21至22、27、32至40、42中任一项所述的伴侣动物或根据权利要求19、20、23至26、28至31、41、42中任一项所述的犬科动物是幼犬。
44.根据权利要求17至42中任一项所述的方法，其中根据权利要求17至18、20、21至22、27、32至40、42中任一项所述的伴侣动物或根据权利要求19、20、23至26、28至31、41、42中任一项所述的犬科动物是成年犬科动物、较老犬科动物或老年犬科动物。
45.根据权利要求17至44中任一项所述的方法，所述方法还包括改变根据权利要求17至18、20、21至22、27、32至40、42、43中任一项所述的伴侣动物或根据权利要求19、20、23至26、28至31、41、42、43、44中任一项所述的犬科动物的微生物组组成的步骤。
46.根据权利要求21至45中任一项所述的方法，其中所述第一步包括在至少两个时间点测定权利要求17至18、20、21至22、27、32至40、42、43、45中任一项所述的伴侣动物的微生物组的健康，或测定权利要求19、20、23至26、28至31、41、42、43、44、45中任一项所述的伴侣动物的微生物组的健康。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述两个时间点相隔至少约3个月。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述两个时间点相隔至少约6个月。
49.根据权利要求22至48中任一项所述的方法，其中所述样品来自胃肠道。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述样品选自粪便样品、回肠样品、空肠样品、十二指肠样品及结肠样品。
51.根据权利要求17至50中任一项所述的方法，其中在给予所述组合物之前和之后测定所述微生物组的健康。
52.根据权利要求17至51中任一项所述的方法，其中通过DNA测序、RNA测序、蛋白质序列同源性或指示细菌分类群、分支、亚型、科或属的生物标记物检测权利要求24、27至29和32至34中任一项的细菌分类群，或权利要求25、30、35和39中任一项的细菌的科，或权利要求26、31、36和40中任一项的细菌的属。
53.根据权利要求19、20、23至26、28、29至31及41至45中任一项所述的方法，其中所述犬科动物是狗。
54.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，所述组合物用于增加在伴侣动物的胃肠道或粪便中存在的栖粪杆菌(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、异杆菌属(Allobaculum)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、史雷克氏菌属(Slackia)毛螺菌属(Lachnospira)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的数量，与给予所述组合物之前所述伴侣动物中存在的所述细菌的数量相比。
55.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，所述组合物用于减少梭杆菌属(Fusobacterium)、特别是死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)或来自艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)或大肠杆菌/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)或地中海杆菌属(Mediterraneibacter)的种或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或艰难梭菌(Clostridium difficile)的数量。
56.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，与给予所述组合物之前所述伴侣动物中存在的所述细菌的数量相比，所述组合物用于减少在伴侣动物的胃肠道或粪便中存在的肠杆菌目(Enterobacteriales)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、变形菌门(Proteobacteria)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)的数量。
57.一种方法，所述方法用于通过给予权利要求1所述的组合物在伴侣动物的胃肠道和/或粪便中增加选自栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、毛螺菌属(Lachnospira)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)中的至少一种细菌分类群的细菌计数，和/或用于通过给予权利要求1所述的组合物在伴侣动物的胃肠道和/或粪便中减少梭杆菌属(Fusobacterium)、特别是死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)或来自艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)或大肠杆菌/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)或地中海杆菌属(Mediterraneibacter)的种或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或艰难梭菌(Clostridium difficile)所组成的组中至少一种细菌的数量。
58.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物用于减少肠杆菌目(Enterobacteriales)细菌、优选大肠杆菌属(Escherichia)或梭杆菌属(Fusobacterium)、特别是死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)或来自艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)的种或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或艰难梭菌(Clostridium difficile)的数量。
59.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，所述组合物用于在伴侣动物的微生物组中增加脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸相关基因中的至少一种的基因表达。
60.一种方法，所述方法通过给予伴侣动物权利要求1至16中任一项所述的组合物增加所述伴侣动物的微生物组中的脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸相关基因中的至少一种的基因表达。
61.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，所述组合物用于改变伴侣动物的循环氨基酸水平。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述循环氨基酸水平被降低，所述循环氨基酸水平选自天冬氨酸、丝氨酸、肌氨酸、脯氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、1-甲基组氨酸和3-甲基组氨酸、肌肽、鸟氨酸和精氨酸的水平。
63.一种改变伴侣动物中的循环氨基酸水平的方法，所述方法包括通过给予权利要求1至16中任一项所述的组合物减少伴侣动物中的下组中氨基酸的任何一种：所述氨基酸的组包括天冬氨酸、丝氨酸、肌氨酸、脯氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、1-甲基组氨酸和3-甲基组氨酸、肌肽、鸟氨酸和精氨酸。
64.一种通过给予伴侣动物权利要求1至16中任一项所述的组合物增加或改变所述伴侣动物中的CD3+和/或CD4+淋巴细胞计数的方法。
65.一种通过给予伴侣动物权利要求1至16中任一项所述的组合物降低或改变所述伴侣动物中的循环甘油三酯计数的方法。
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