CN112820348B - 一种检测血浆代谢与银屑病患者皮肤微生物区系相互作用的方法 - Google Patents

Abstract

血浆代谢在银屑病患者皮肤微生物区系的新的相互作用的应用，包括患者组信息和健康对照组信息收集、样本收集、微生物组DNA提取和16S测序、16S测序数据分析、LC‑MS代谢组学数据采集、GC‑MS数据采集、利用LC‑MS和GC‑MS代谢组学数据分析和统计分析。本发明综合了皮肤微生物组16S序列和血浆代谢组学数据，揭示了银屑病患者全球代谢稳态状态的改变及其与皮肤微生物区系的关系，揭示了血浆代谢在银屑病发病机制中的关键皮肤微生物区系新的相互作用的应用。本发明数据提供了牛皮癣患者皮肤微生物群调节血液代谢的潜在机制，这将有助于进一步了解银屑病的病理机制。

Description

一种检测血浆代谢与银屑病患者皮肤微生物区系相互作用的方法

技术领域

本发明属于皮肤病学技术领域，尤其涉及一种检测血浆代谢与银屑病患者皮肤微生物区系相互作用的方法。

背景技术

银屑病是全世界最常见的皮肤病之一，约有2％的人受到影响(Boehncke and

2015)。银屑病的症状通常会让人感到不舒服，而且更严重地影响到其他器官，而不仅仅是皮肤。目前银屑病的分子机制尚不清楚，难以发现新的治疗药物。在这种情况下，大多数患者不得不终生遭受这种疾病的折磨(Dubertret et al.,2006；Nestle et al.,2009)。

银屑病的病因在很大程度上仍不清楚，但据报道与许多方面有关，包括环境因素、遗传因素和免疫因素(Nestle et al.,2009)。据报道，肿瘤的发病、进展，甚至临床治疗后的复发都受这些因素的影响。最终，这些因素共同作用，形成银屑病特有的代谢特征。研究表明，银屑病患者的葡萄糖代谢、氨基酸代谢和脂代谢发生了显著变化(Zeng et al.,2017)(Zhu and Thompson,2019)。细胞增殖和凋亡的代谢调节作用被认为是银屑病非调节性角质形成细胞发病的关键(Pohla et al.,2020)(Luo et al.,2020)。此外，众所周知，银屑病的慢性炎症特征，代谢综合征与银屑病的相关特征，甚至银屑病与饮食相关的发病机制都暗示了代谢对银屑病的重要性(Wolters,2005)(Gisondi et al.,2018)。这些报告表明，全球代谢的改变可能与银屑病患者的特殊表型有关。然而，还有更多的信息需要回答。

微生物分布于人体的多个部位，在系统内稳态中起着非常重要的作用。大多数研究都集中在肠道微生物群上。它们的丰度和组成在不同条件下可能不同，而且与许多人类疾病有关(Chávez-Talavera et al.,2017)。越来越多的证据证明，微生物区系的活动在调节组织新陈代谢方面尤其关键(He et al.,2020；Liu et al.,2017)。近年来，有关微生物群在维持皮肤健康状态和调节皮肤相关疾病方面的作用已有报道(Byrd et al.,2018；Dréno et al.,2016；Zeeuwen et al.,2013)。对于银屑病，肠道菌群在疾病发生和发展中的作用已有报道。此外，肠道微生物区系也可以成为该病的潜在生物标志物(Myers et al.,2019；Thio,2018)。然而，目前关于皮肤微生物群的组织结构还很不清楚，也不清楚皮肤微生物群在调节银屑病患者整体代谢方面的潜在功能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的空白，提供一种血浆代谢在银屑病患者皮肤微生物区系的新的相互作用的应用。

本发明项目研究中，我们收集了严重斑块型银屑病患者和健康对照的皮肤微生物组样本和血浆样本。我们进行了皮肤微生物组的16S测序和血浆代谢组学分析。我们的结果揭示了银屑病患者皮肤微生物区系的改变，包括γ蛋白细菌的积累。功能预测揭示了代谢途径的变化。同时，我们的代谢组学数据显示银屑病患者的系统代谢发生了非常明显的变化。此外，我们还建立了一种新的皮肤微生物群与血浆代谢物的相关图谱。这些结果突出了皮肤微生物群在调节全球代谢中的作用，并为银屑病的病理观点提供了新的见解。

本发明提出的具体技术方案为：一种检测血浆代谢与银屑病患者皮肤微生物区系相互作用的方法，包括以下步骤：

(一)患者组信息和健康对照组信息收集：

发明人于2018年12月至2019年5月在宁夏医科大学总医院招募32例重症斑块型银屑病患者进行本研究，同时招募29名健康志愿者，患者年龄17～74岁，平均38.16岁；健康对照组平均年龄35.53岁，年龄23～54岁；采用银屑病面积和严重程度指数PASI评分标准、银屑病综合评估PGA评分标准和体表面积BSA评分标准对银屑病的严重程度进行量化；同时符合以下标准的患者包括：严重斑块型银屑病患者；病程至少半年的患者，以及之前接受过至少一个疗程的系统治疗但没有明显改善的患者；排除标准如下：有严重肝肾损害、精神疾病、造血功能障碍或其他严重器质性疾病的志愿者；两个月内接受免疫抑制或大剂量糖皮质激素或维甲酸治疗的患者；所有参与者，包括健康对照组和一周内接受任何皮肤护理或洗剂的银屑病患者；这些健康的志愿者没有任何免疫性疾病的病史，也没有任何皮肤病；所有样本和临床信息均在知情同意的情况下获得；本研究是按照“赫尔辛基宣言”进行的；

(二)样本收集：

皮肤微生物组样本是根据先前的报告收集的；简而言之，用PBS擦拭棉签，并用棉签擦拭2×2cm²的限定皮肤区域至少20次，以最大限度地增加微生物组DNA的数量，所有样品在-80℃下保存，直到提取；

在肝素钠抗凝管消耗一夜后于同一天采集血浆样本，然后样品在室温下以3000转/分离心10分钟，收集上清液，分成不同的试管，保存在-80℃；

(三)微生物组DNA提取和16S测序：

采用Mobio PowerSoil DNA分离试剂盒提取微生物组DNA并进行16S测序，用

 High-Fidelity PCR Master Mix和GC Buffer及引物515F和806R扩增16S rRNA基因的V4区，用AMPure XP磁珠纯化PCR产物后，用Illumina Novaseq6000平台通过双端测序策略进行分析；

(四)16S测序数据分析：

Illumina测序后，去除条形码和引物序列；具体标签由FLASH软件根据这些读数的重叠信息生成，然后应用Trimomatic软件去除劣质标签，得到干净的标签；用UCHIME软件进一步过滤干净的标签以排除嵌合序列，接下来，利用UPARSE软件将其余同源性>97％的序列归类为一个可操作分类单元OTU；分类信息通过搜索SSurRNA数据库进行注释，然后将OTU划分为不同的系统发育级别，即界、门、纲、目、科、属和种；利用QIIME软件对有效标签进行α多样性和β多样性分析，采用t检验和Wilcoxon rank-sum检验比较它们的相对丰富度和多样性差异；此外，线性判别分析结合效应大小LEFSE被用来鉴定能够区分银屑病患者和健康人的微生物；

(五)LC-MS代谢组学数据采集：

取每例患者100mL血浆样品，以含1mg/mL 2-氯-L-苯丙氨酸的300mL甲醇为内标，在冰水中短暂超声10min后，将所有样品置于-40℃中1h，在4℃下10000rpm离心15min，然后将样品重新悬浮在100ml 50％乙腈中；为了进行质量控制QC样品制备，将等量10mL的血浆提取物混合在一起；

为了收集LC-MS代谢组学数据，所有血浆样本由Biotree有限公司根据先前报道的方法水溶液，负离子模式流动相A为5mmol/L醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度分别为1％B 1min、99％B 8min、99％B 10min、1％B 10.1min、1％B 12min，流速设定为0.5mL/min；QExactive质谱仪分别在正模式和负模式下运行，喷雾电压分别为4.0kV和-3.6kV；其它ESI源条件为：鞘气体流量45arb，辅助气体流量15arb，毛细管温度400℃；所有MS1和MS2数据由XCalibur控制；所有分析使用UPLC HSS T3柱；有机试剂，包括甲醇、乙腈和甲酸购自德国CNW Technologies；

(六)GC-MS数据采集：

提取的血浆样品再悬浮在30mL甲氧胺盐酸盐20mg/mL吡啶溶液中，在80℃孵育30min；用40mLN，O-双三甲基硅基、三氟乙酰胺、与1％三甲基硅基二乙胺在70℃下衍生化1.5h后，逐渐降温至室温；为了进行质量控制QC样品制备，将等量10mL的血浆提取物混合在一起，在质控样品中加入另外5mL饱和脂肪酸甲酯，用于GC-MS分析；GC-TOF-MS分析使用Agilent 7890气相色谱仪和Pegasus HT飞行时间质谱仪，采用DB-5MS毛细管色谱柱30m*250μm*0.25μm，载气为氦气，前进口吹扫流量为3mL/min，气体流量为1mL/min，温度梯度设置为50℃，保温1min，然后以20℃/min的速率提高到310℃，然后保持6min；前注入温度为280℃，传输线温度为280℃，离子源温度为250℃；在电子碰撞模式下，能量为-70eV，质谱数据以全扫描方式获得，m/z范围为50-500，在溶剂延迟4.85min后，以每秒12.5个光谱的速率进行，用1个μL样品进样进行分析；

(七)利用LC-MS和GC-MS代谢组学数据分析：

用软件ProteoWizard将原始LC-MS数据转换为mzXML格式，用XCMS对数据进行处理，GC-MS原始数据用Chroma TOF软件处理，经过峰识别、峰对齐、峰提取、保留时间校正和峰积分，得到三维数据矩阵；为了保证代谢组学数据的重现性和可靠性，对质控样品中峰的相对标准偏差RSD>30％进行了筛选；通过与保留时间RT和质荷比m/z指标在由HMDB在线数据库www.hmdb中的光谱信息组成的库中的比较来鉴定剩余的峰；GC-MS数据与Leco-FiehnRtx5数据库匹配；峰值强度用曲线下面积进行量化，对数据矩阵进行进一步处理，去除50％以上样本中有缺失值的峰，并用最小值的一半填充剩下的缺失值，然后，通过将数据归一化到内标的峰值强度来生成新的数据矩阵；

(八)统计分析：

使用Microsoft Excel和R软件版本3.5.1进行统计分析，用Wilcoxon秩和检验和MetaStat软件计算银屑病患者和健康对照组不同水平门、纲、目、科、属的细菌分类群差异丰度；α多样性指数的差异由学生t检验确定，用相似性分析ANOSIM分析银屑病患者与对照组β多样性的差异，为了解银屑病患者与正常人代谢组学特征的差异，采用主成分分析PCA和正交投影潜在结构判别分析OPLS-DA多元统计分析方法，OPLS-DA分析中VIP>1投影变量重要性和t检验中p值<0.05的小分子被认为是显著改变的代谢物；皮尔逊相关性被用来计算皮肤微生物区系和血浆代谢物之间的关系。

有益效果：

本发明综合了皮肤微生物组16S序列和血浆代谢组学数据，揭示了银屑病患者全球代谢稳态状态的改变及其与皮肤微生物区系的关系。揭示了血浆代谢在银屑病发病机制中的关键皮肤微生物区系新的相互作用的应用。本发明数据提供了牛皮癣患者皮肤微生物群调节血液代谢的潜在机制。这将有助于进一步了解银屑病的病理机制。

具体实施方式

检测血浆代谢与银屑病患者皮肤微生物区系相互作用的方法。

通过本发明内容中所述应用步骤，产生如下结果：

(一)银屑病患者皮肤微生物区系组成的改变。

我们招募了32名重度斑块型银屑病患者(PASI＞12)和29名健康对照者来鉴定银屑病相关菌群。经质量控制后，仅26例患者和10例对照的DNA样本量就足以进行16S测序。总体而言，按照97％的相似度，我们总共获得了83998个有效标签和7887个OTU。根据Silva132数据库进行分类后，对7606个OTU进行了不同系统发育水平的注释。根据物种积累曲线，目前的测序和样品足以进行分类群鉴定。然而，对照组和银屑病患者在皮肤种类数量上没有显著差异。此外，银屑病患者皮肤的α多样性指数，包括观察到的物种总数、Shannon指数、ACE指数、Simpson指数和Chao1指数与对照组无显著差异。为了找出银屑病患者中改变的微生物区系，我们在属水平上进行了t检验。银屑病患者肠道和皮肤中广泛分布的乳酸菌的平均丰度增加，而乳酸菌在人体肠道和皮肤中起着乳酸产生的作用。这可能表明乳酸菌在调节皮肤细胞增殖方面具有潜在的积极作用，这与之前的报告一致，即乳酸菌能够促进紫外线损伤后的皮肤修复(Im et al.,2018)。同时，致病蛋白细菌(门)-γ蛋白细菌(纲)中的热单胞菌和黄体单胞菌也有所增加，提示银屑病患者的皮肤存在致病环境。为了进一步分析银屑病中微生物区系的变化，我们应用了另一种广泛使用的统计分析工具MetaStat来筛选显著变化的微生物。乳酸菌也被鉴定为一种重要的改变。此外，银屑病患者血清中的另一种γ蛋白细菌弧菌也明显升高。综上所述，这些数据提示银屑病患者病原菌，特别是γ蛋白细菌的数量增加。

为了进一步回答与银屑病相关的改变，我们进行了LEfSe分析。主要区别在于银屑病患者中未确定的蓝藻(分类不明的蓝藻和目的蓝藻)的丰度增加。在较低的分类水平上也观察到了一些差异。银屑病患者显示柠檬酸杆菌属的数量减少。综上所述，这些数据表明银屑病患者的共生肠道微生物群组成发生了变化，表明微生物群落失调。

(二)银屑病患者皮肤微生物群的功能预测。

为了进一步回答银屑病中皮肤肠道微生物区系改变对功能的影响，我们使用PICRUST软件基于16S测序数据预测了KEGG通路(Langille et al.,2013)。代谢途径是预测的最丰富的途径，约占50％。其中碳水化合物代谢和其他氨基酸代谢明显降低。相比之下，银屑病患者的嘧啶和嘌呤代谢(核苷酸代谢)、糖酵解/糖异生、氧化磷酸化和甲烷代谢(能量代谢)、辅因子和维生素的代谢以及其他次生代谢物的生物合成均较健康对照组增加。

(三)银屑病患者血浆代谢谱研究。

许多论文中都报道了与组织代谢相关的微生物区系改变(Olson et al.,2018)(Liu et al.,2017)。另一方面，我们的数据显示皮肤微生物区系介导的小分子代谢受到牛皮癣的影响。因此，我们应用气相色谱和超高压液相色谱-质谱联用技术对银屑病患者的代谢改变进行了研究。总的来说，共获得3562个特征和716个代谢物。PCA分析显示银屑病患者和健康对照组之间的代谢谱有非常明显的分离，证明了不同的代谢活性。经统计分析，我们得到117个明显改变的代谢物(VIP＞1和p＜0.05)。其中，我们发现了几种微生物产生的代谢物，这些代谢物也发生了显著的变化。这些化合物包括牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、脱氧胆酸甘氨酸结合物(GDCA)、鹅去氧胆酸甘氨酸结合物(GCDCA)和L-犬尿氨酸(Agus et al.,2018；Chávez-Talavera et al.,2017；He et al.,2020)。为了发现代谢途径的改变，我们利用MetabAnalyst(www.metaboanalyst.ca)对差异表达的代谢物进行了KEGG途径分析。与微生物区系代谢活动高度相关的支链氨基酸代谢(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成)发生了显著改变(Liu et al.,2017)。此外，反映组织炎症状态的α-亚麻酸和亚油酸代谢也发生了显著改变(Sergeant et al.，2016)。

(四)皮肤微生物区系与血浆代谢的新相互作用。

许多论文报道了肠道微生物区系与血液代谢的相关性(Liu et al.,2017)(He etal.,2020)，而对皮肤微生物区系与血液代谢的关系知之甚少。在本发明研究中，我们对在属水平上注释的皮肤微生物区系与已鉴定的血浆代谢物进行了Pearson相关分析。健康对照和银屑病患者的皮肤微生物区系和血浆代谢物的相关性不同，表明血浆代谢物的改变高度归因于皮肤微生物群的改变。有趣的是，在银屑病患者中，大多数未鉴定的蓝藻和血浆代谢物之间的关联，以及健康对照中柠檬酸杆菌和血浆代谢物之间的关联都消失了。此外，在银屑病患者中弧菌与血浆代谢物之间建立了新的相关性。值得注意的是，与银屑病特定皮肤细菌相关的代谢产物是与核苷酸代谢有关的D-核糖、5-磷酸核糖、核糖醇和2-脱氧-D-核糖。然而，银屑病患者的微生物区系主要与脂质相关，包括十一碳二酸、(R)-3-羟丁酸、5(S)-HETE、顺-9，10-环氧硬脂酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸。这些结果提示银屑病患者皮肤微生物区系的代谢从核苷酸代谢转向脂质代谢。

为了弄清皮肤微生物区系和血浆新陈代谢之间的关系，我们随后使用了来自健康对照组和SLE患者的所有样本进行了皮尔逊相关分析。血脂与弧菌之间的相关性仍然很强，进一步提示皮肤微生物区系在调节脂质代谢中的作用。有趣的是，受试者工作特征(ROC)曲线分析显示5(S)-HETE(曲线下面积，Auc＝0.705)和二十二碳五烯酸(22n-3)(Auc＝0.702)是系统性红斑狼疮分类的潜在生物标志物。

现有技术研究了银屑病患者血液代谢组、肠道菌群的变化。然而，了解银屑病的发病机制是不够的，因为这种疾病主要发生在皮肤上。本发明研究采用16S测序方法分析银屑病患者皮肤微生物区系的变化，并应用LC-MS代谢组学方法分析银屑病患者血浆代谢组的变化。结果表明，银屑病患者血浆代谢动态平衡紊乱，并与皮肤微生物区系的改变有关。

我们进一步从属水平上确认了皮肤微生物区系弧菌对银屑病患者脂代谢的关键作用。此外，我们还发现包括5(S)-HETE和二十二碳五烯酸(22n-3)在内的几种脂质是区分正常人和银屑病患者的潜在生物标志物。在我们的非靶向代谢组学研究之后，银屑病患者的许多血浆代谢物发生了显著变化。途径分析显示氨基酸代谢途径和脂类代谢途径均富集。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径是由微生物区系介导的支链氨基酸代谢，据报道与许多疾病有关(Liu et al.,2017；Liu et al.,2020)。此外，还丰富了不饱和脂肪酸生物合成、甘油脂代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢等多种脂质代谢途径。甘油脂对膜的流动性起着非常重要的作用，为膜的生物发生提供了基石，此前也被报道为银屑病患者潜在的诊断生物标志物(Zeng et al.,2017)。此外，亚油酸和α-亚麻酸代谢的改变反映了银屑病的炎症状态(Boehncke,2018)。此外，微生物区系介导的胆汁酸代谢(TcdA、TCDCA和GDCA)因其在脂质代谢中的作用而广为人知，而L-犬尿氨酸则因其在炎症调节中的作用而广为人知(Cervenka et al.,2017；Vítek and Haluzík,2016)。总之，代谢组研究结果表明，微生物区系在调节银屑病患者的脂质代谢和炎症反应中起着重要作用。

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病。越来越多的证据表明皮肤微生物群在疾病发病机制中的作用(Grice,2014；Li et al.,2019；Picardo and Ottaviani,2014)。在我们的研究中，与健康人相比，一些皮肤微生物群发生了显著变化，这与之前的研究一致(Chang etal.,2018)。其中致病蛋白杆菌(门)-γ蛋白细菌(类)的致病菌热单胞菌和黄体单胞菌明显增多，提示这些细菌在银屑病发病中起着重要的病理作用。弧菌被列为最强大和显著增加的细菌分类群，因其作为霍乱病原体的作用而广为人知(Conner et al.,2016)。提示病理性微生物区系堆积可能是银屑病发病的原因。这一结论也可以通过对这些皮肤微生物区系的功能分析来证实。银屑病患者皮肤微生物组介导的核苷酸代谢和氨基酸代谢活性较健康对照组升高，因为这些小分子代谢途径是皮肤细胞增殖的关键。皮肤微生物与血液代谢之间的相互作用很少被研究。在这篇文章中，我们分析了显著改变的皮肤微生物区系和显著改变的血浆代谢物之间的皮尔逊相关性。这些结果强调了皮肤微生物区系在调节脂质代谢中的作用，特别是病原体弧菌。与此同时，这些数据也表明皮肤微生物群在皮肤内稳态中的作用，这对于维持皮肤的免疫屏障至关重要(Belkaid and Tamoutounour,2016)。

Claims (4)

1.一种检测血浆代谢与银屑病患者皮肤微生物区系相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（一）患者组信息和健康对照组信息收集：

招募32例重症斑块型银屑病患者和29名健康志愿者，患者年龄17 ~ 74岁，平均38.16岁；健康对照组平均年龄35.53岁，年龄23 ~ 54岁；采用银屑病面积和严重程度指数PASI评分标准、银屑病综合评估PGA评分标准和体表面积BSA评分标准对银屑病的严重程度进行量化；其中重症斑块型银屑病患者同时符合以下标准：严重斑块型银屑病患者，病程至少半年的患者，以及之前接受过至少一个疗程的系统治疗但没有明显改善的患者；排除标准如下：有严重肝肾损害、精神疾病、造血功能障碍或其他严重器质性疾病的志愿者，两个月内接受免疫抑制或大剂量糖皮质激素或维甲酸治疗的患者；所有参与者，包括健康对照组和一周内接受任何皮肤护理或洗剂的银屑病患者；这些健康的志愿者没有任何免疫性疾病的病史，也没有任何皮肤病；所有样本和临床信息均在知情同意的情况下获得；以上步骤是按照“赫尔辛基宣言”进行的；

（二）样本收集：

用PBS擦拭棉签，并用棉签擦拭2×2cm²的限定皮肤区域至少20次，以最大限度地增加微生物组DNA的数量，所有样品在-80℃下保存，直到提取；

在肝素钠抗凝管消耗一夜后于同一天采集血浆样本，然后样品在室温下以3000转/分离心10分钟，收集上清液，分成不同的试管，保存在-80℃；

（三）微生物组DNA提取和16S测序：

采用Mobio PowerSoil DNA分离试剂盒提取微生物组DNA并进行16S测序，用Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix和GC Buffer及引物515F和806R扩增16S rRNA基因的V4区，用AMPure XP磁珠纯化PCR产物后，用Illumina Novaseq6000平台通过双端测序策略进行分析；

（四）16S测序数据分析：

Illumina测序后，去除条形码和引物序列；具体标签由FLASH软件根据这些读数的重叠信息生成，然后应用Trimomatic软件去除劣质标签，得到干净的标签；用UCHIME软件进一步过滤干净的标签以排除嵌合序列，接下来，利用UPARSE软件将其余同源性>97%的序列归类为一个可操作分类单元OTU；分类信息通过搜索SSurRNA数据库进行注释，然后将OTU划分为不同的系统发育级别，即界、门、纲、目、科、属和种；利用QIIME软件对有效标签进行α多样性和β多样性分析，采用t检验和Wilcoxon rank-sum检验比较它们的相对丰富度和多样性差异；此外，线性判别分析结合效应大小LEFSE被用来鉴定能够区分银屑病患者和健康人的微生物；

（五）LC-MS代谢组学数据采集：

取每例患者100mL血浆样品，以含1mg/mL 2-氯-L-苯丙氨酸的300mL甲醇为内标，在冰水中短暂超声10min后，将所有样品置于-40℃中1h，在4℃下10000rpm离心15min，然后将样品重新悬浮在100mL 50%乙腈中；为了进行质量控制QC样品制备，将等量10mL的血浆提取物混合在一起；

为了收集LC-MS代谢组学数据，所有血浆样本使用1290 UHPLC进行分析，阳离子模式流动相A为0.1%甲酸水溶液，负离子模式流动相A为5 mmol/L醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度分别为1%B 1min、99%B 8min、99%B 10min、1%B 10.1min、1%B 12min，流速设定为0.5mL/min；QExactive质谱仪分别在正模式和负模式下运行，喷雾电压分别为4.0kV和−3.6kV；ESI源条件为：鞘气体流量45arb，辅助气体流量15arb，毛细管温度400℃；所有MS1和MS2数据由XCalibur控制；所有分析使用UPLC HSS T3柱；有机试剂，包括甲醇、乙腈和甲酸；

（六）GC-MS数据采集：

提取的血浆样品再悬浮在30L甲氧胺盐酸盐20 mg/mL吡啶溶液中，在80℃孵育30min；用40mL N，O-双三甲基硅基、三氟乙酰胺、与1%三甲基硅基二乙胺在70℃下衍生化1.5h后，逐渐降温至室温；为了进行质量控制QC样品制备，将等量10mL的血浆提取物混合在一起，在质控样品中加入另外5mL饱和脂肪酸甲酯，用于GC-MS分析；GC-TOF-MS分析使用Agilent7890气相色谱仪和Pegasus HT飞行时间质谱仪，采用DB-5MS毛细管色谱柱30m*250μm*0.25μm，载气为氦气，前进口吹扫流量为3mL/min，气体流量为1mL/min，温度梯度设置为50℃，保温1min，然后以20℃/min的速率提高到310℃，然后保持6min；前注入温度为280℃，传输线温度为280℃，离子源温度为250℃；在电子碰撞模式下，能量为-70 eV，质谱数据以全扫描方式获得，m/z范围为50-500，在溶剂延迟4.85min后，以每秒12.5个光谱的速率进行，用1个μL样品进样进行分析；

（七）利用LC-MS和GC-MS代谢组学数据分析：

用软件ProteoWizard将原始LC-MS数据转换为mzXML格式，用XCMS对数据进行处理，GC-MS原始数据用Chroma TOF软件处理，经过峰识别、峰对齐、峰提取、保留时间校正和峰积分，得到三维数据矩阵；为了保证代谢组学数据的重现性和可靠性，对质控样品中峰的相对标准偏差RSD>30%进行了筛选；通过与保留时间RT和质荷比m/z指标在由HMDB在线数据库中的光谱信息组成的库中的比较来鉴定剩余的峰；GC-MS数据与Leco-Fiehn Rtx5数据库匹配；峰值强度用曲线下面积进行量化，对数据矩阵进行进一步处理，去除样本中50%以上有缺失值的峰，并用最小值的一半填充剩下的缺失值，然后，通过将数据归一化到内标的峰值强度来生成新的数据矩阵；其中，所述最小值为峰值强度的最小值；

（八）统计分析：

使用Microsoft Excel和R软件版本3.5.1进行统计分析，用Wilcoxon秩和检验和MetaStat软件计算银屑病患者和健康对照组不同水平门、纲、目、科、属的细菌分类群差异丰度；α多样性指数的差异由学生t检验确定，用相似性分析ANOSIM分析银屑病患者与对照组β多样性的差异，为了解银屑病患者与正常人代谢组学特征的差异，采用主成分分析PCA和正交投影潜在结构判别分析OPLS-DA多元统计分析方法，OPLS-DA分析中VIP>1投影变量重要性和t检验中p值<0.05的小分子被认为是显著改变的代谢物；皮尔逊相关性被用来计算皮肤微生物区系和血浆代谢物之间的关系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述皮尔逊相关性被用来计算皮肤微生物区系和血浆代谢物之间的关系中，银屑病患者皮肤微生物组介导的核苷酸代谢和氨基酸代谢活性较健康对照组升高。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在银屑病患者中弧菌与血浆代谢物之间建立了新的相关性。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，与银屑病特定皮肤细菌相关的代谢产物是与核苷酸代谢有关的D-核糖、5-磷酸核糖、核糖醇和2-脱氧-D-核糖。