CN110554128A - 基于代谢组学的人参治疗脾气虚体质潜在标志物代谢通路的研究方法 - Google Patents

基于代谢组学的人参治疗脾气虚体质潜在标志物代谢通路的研究方法 Download PDF

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CN110554128A CN201910825591.9A CN201910825591A CN110554128A CN 110554128 A CN110554128 A CN 110554128A CN 201910825591 A CN201910825591 A CN 201910825591A CN 110554128 A CN110554128 A CN 110554128A
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Abstract

本发明涉及一种基于代谢组学的人参治疗脾气虚体质潜在标志物代谢通路的研究方法，涉及医药领域。(1)采用超高液相色谱‑飞行时间质谱分析健康者、脾气虚体质患者及人参干预后的脾气虚体质患者三组血液代谢产物；(2)筛选出13个人参治疗脾气虚体质相关血液潜在标志物并进行鉴定；(3)筛选人参治疗脾气虚体质的相关代谢通路并进行分析。本发明可以及时根据脾气虚体质患者的血浆分析预测脾气虚体质，及早发现及早治疗，可降低脾气虚体质引起的发病，可更全面、高效、快速的从整体水平无偏向性的综合评价人参治疗脾气虚体质的作用机制，为人参作用机制的阐明及进一步开发提供依据。

Description

基于代谢组学的人参治疗脾气虚体质潜在标志物代谢通路的 研究方法
技术领域
本发明属医药领域，具体是一种基于代谢组学的人参治疗脾气虚体质潜在标志物代谢通路的研究方法。
背景技术
气虚体质是由于元气不足，以气息低弱、机体、脏腑功能状态低下为主要特征的一种体质状态，其内在实质变化主要有能量代谢低下、免疫功能低下等。气虚体质的形成是先天禀赋和后天环境因素作用的结果，是人群中最常见的偏颇体质类型之一，其自身的特殊性决定与某些疾病的发生发展以及预防有着密切的联系。因久病则耗气，曾经患有大病、一些慢性疾病或经历手术治疗的患者，会因气的生化不足，导致元气不足、气虚体弱。临床上很多亚健康症状如慢性疲劳、易感冒等一些疾病症状常因气虚体质而发生，而长期生活工作压力过大、脑力劳动过度、夜间工作等不良生活习惯亦可导致亚健康疲劳状态，引发气虚证。
人参(Panax ginseng C.A.Mey)为五加科多年生草本植物，被称为“百草之王”，具有大补元气、补益脾肺、生津止渴、安神益智等功效，主治劳伤虚损等气血津液不足之症。人参能够降低人体对于各种刺激的反应强度，表现为抗缺氧时间延长，抗疲劳强度增加，抗辐射强度增加，免疫力增强等，这些作用可以归纳为增强机体的适应性，减小应激刺激带来的损伤，因此，人参可作为一种适应原性物质。研究人参适应原作用的物质基础，能将人参用于应激慢性病的临床治疗药物的开发提供依据。
代谢组学是一门研究生物体内源性代谢物质的种类、数量及其在内外因素作用下变化规律的学科，测定物质多为参与生物体新陈代谢、维持生命活动正常功能和生长发育的小分子化合物。因为代谢物处于生物系统的生化活动调控末端，所以代谢组学反映的是已经发生的生物学事件。疾病的发生会引起体内代谢产物的变化，代谢组学关注的是机体在经历病理、生理剌激或基因修饰后代谢产物的整体性变化，以推测机体内部发生的变化，其全景式、整体互动性的特点与中医学“整体观”“辨证论治”“司外揣内”的思维模式不谋而合，传统中医证候的诊断标准和辨证指标体系主观性较强，代谢组学在中医药现代化建设中将中医药的优势和特点与现代科学技术相结合，可成为传统中医药与现代医药两种体系的“桥梁”。代谢组学在中医证候研究中在发现潜在疾病标志物、提供中医证候的物质基础、评价药效、寻找潜在治疗靶点，并用以精准治疗的新药研发等多方面展示了其在中医药现代化研究中的优势。在中医体质方面的研究表明它可以映射早期生化变化对疾病的扰动，从而提供开发预测性生物标志物的机会，这些生物标志物可以为疾病早期干预和对疾病机制的研究提供宝贵的见解。
发明内容
本发明提供一种基于代谢组学的人参治疗脾气虚体质潜在标志物代谢通路的研究方法，目的是针对现有药理学方法不能完整全面的阐释人参治疗脾气虚体质作用机制的难点，为人参进一步开发利用提供依据。
本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：
采用超高液相色谱-飞行时间质谱分离并鉴定健康者、脾气虚体质患者及人参干预后的脾气虚体质患者三组血液代谢产物，获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出十三个人参潜在治疗脾气虚体质相关血液标志物并进行鉴定；利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库筛选出人参治疗脾气虚体质的相关代谢通路网络并进行分析；
获得人参治疗脾气虚体质的潜在标志物代谢通路的具体实现步骤如下：
1.志愿者诊断、纳入及排除标准：
根据《中医体质分类与判定》调查问卷，结合资深中医专家诊脉对志愿者体质进行判定。主症：气喘无力、动则出汗、神疲倦怠、食欲不振；次症：腹胀、二便无力、舌苔薄、脉细弱；证候诊断：主症2项加次症2项，纳入标准：(1)符合中医脾气虚型证候诊断标准；(2)患者本人签署或由其直系亲属代签知情同意书，志愿受试；(3)18周岁≤年龄≤50周岁者，性别不限；(4)在进入研究前至少15天内没有服用过任何其他药物，未参加其他临床研究者；排除标准：(1)对人参过敏者；(2)合并有心血管、肺、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病者，精神性疾病患者，妊娠或哺乳期妇女；(3)有重大医疗或手术病史，可能会显著影响研究结果或计划的手术；(4)进展性恶性肿瘤或其它严重消耗性疾病，易合并感染和出血者；(5)有严重的抑郁、焦虑症状、对黑暗空间恐惧者；(6)凡不符合纳入标准，依从性差，未按规定进行治疗，无法判断疗效或资料不全等影响疗效和安全性判断者；
2.志愿者干预法：
纳入脾气虚体质患者20例、健康者10例，分为健康对照组(健康组)、脾气虚体质对照组(脾气虚组)和脾气虚体质给药组(给药组)，每组10例，健康组志愿者正常生活不作干预；脾气虚组志愿者给予安慰剂治疗；给药组志愿者给予人参中药配方颗粒，江阴天江药业有限公司，批号：1706083，治疗，口服，每次1包，每日2次，共服用4周；
3.血液样本的采集和前处理：
分别对三组受试者干预前、后进行清晨空腹血液样本采集，采集后沉降1h，4℃、3000r·min-1，离心10min，密封，置于-80℃低温冰箱保存；测定前，将样本从-80℃低温冰箱中取出，4℃下解冻；每200μL血清加800μL乙腈，涡旋震荡1min，静置10min，4℃、12000r·min-1离心10min后取上清液，过0.22μm有机系滤膜，得到血液标本；
4.超高液相色谱-飞行时间质谱串联检测：
将每个血液标本分别进入LC-MS进行分离
色谱条件：色谱柱为C18 HPLC色谱柱(3.5μm,2.1mm×100mm)，分离条件为：柱温为30℃；流速0.3mL/min；流动相组成A：水+0.1％甲酸，B：乙腈；梯度洗脱程序见表1；进样量为5μL；自动进样器温度4℃。
表1色谱梯度洗脱程序
时间(分钟) 流速(毫升/分钟) A(％) B(％)
0 0.3 95 5
5 0.3 80 20
10 0.3 65 35
15 0.3 2 98
17 0.3 0 100
质谱条件：分别采用电喷雾正离子模式(+ESI)和负离子模式(-ESI)对样品进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型；毛细管电压3.5kV、锥孔电压65V、脱溶剂气温度350℃、干燥气流速9L/min、数据采集范围：50～3000m/z；
5.超高液相色谱-飞行时间质谱数据预处理
将超高液相色谱-飞行时间质谱采集的血液标本数据用安捷伦工作站MassHunter软件对所有原始质谱数据进行预处理，运用“查找化合物”项下的“按分子特征查找”，其中目标数据类型：小分子(色谱)；限制保留时间到：0-17(分钟)；使用峰高为以下值的峰：500(计数)；离子种类项：正离子+H、+Na、+K、+NH4，负离子-H、+CL、+Br、+HCOO、+CH3COO、+CF3CPP；峰间距容差：0.0025m/z，7ppm；同位素模型：常见有机分子；将指定电荷限制为下列最大值：1；绝对峰高：500(计数)；按以上分子特征查找化合物，导出“.cef”格式数据。运用Mass Profiler Professional(MMP)软件进行保留时间校准、峰对齐、基线校准、数据的归一化和对数转换，其中峰对齐中保留时间范围：0.1min；质量范围：5pp±2m Da；初始过滤器的最小绝对丰度：500；去除噪音：l；
6.利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：
采用偏最小二乘法判别(PLS－DA)分析方法进行外部模型验证来证明模型的有效性；在排列实验中，左端任何一次随机排列产生的R2、Q2均小于右端，说明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列y变量的预测能力，即证明了模型有效，可以继续后面差异代谢物的寻找；通过模型验证后，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)方法进行分析，观测组间分布与组别关系发现：正离子模式和负离子模式下的OPLS-DA得分图显示3组血液样本代谢产物组内相对集中，但分布在不同区域，说明脾气虚组的生理及物质代谢状况已发生了明显改变，而给予人参治疗后给药组有向健康组回归趋势，说明人参能够调节脾气虚体质患者的体内代谢趋于健康；采用PLS-DA模型的重要变量因子，即VIP值(VIP＞1.0)，并结合t检验的P值(P<0.05)来寻找健康组与脾气虚组的差异代谢物信息；在其中筛选与给药组共同具有显著性差异影响的化合物作为人参影响脾气虚体质患者的生物标志物。将代谢物信息经人类代谢组数据库(The human metabolome database)检索，初步比对并推测出13个代谢标志物；
7.潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：
根据分子量推测可能的化学式，通过计算不饱和度、结合同位素峰相对强度进行筛选，初步鉴定该化合物及化学式，在Qualitative Analysis of Mass Hunter软件中查找该化合物碎片离子，分析确认是否为鉴定化合物的碎片离子，将结果与数据库中化合物进行比对确认，其它化合物的鉴定同上所述，标志物及含量变化具体见表2；
表2潜在生物标志物的鉴定及在各组的含量变化
*P<0.05,**P<0.01。脾气虚/健康：脾气虚组与健康组比较，给药/脾气虚：给药组与脾气虚组比较
8.潜在生物标记物的分析：
进一步利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes andgenomes)数据库对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路分析，得出13个代谢标志物通过影响体内的抗氧化及免疫功能、能量代谢、甘油、脂肪酸、糖代谢及胆汁酸代谢进而参与了人参治疗脾气虚体质的主要代谢过程，13个代谢标志物形成了相互交错的代谢网络，阐释了人参治疗脾气虚体质的作用机制。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明利用超高液相色谱-飞行时间质谱串联技术结合多元统计分析对脾气虚体质患者血液代谢产物进行分析，发现人参治疗脾气虚体质的相关潜在标志物。
(2)进一步通过该技术分析人参治疗脾气虚体质的相关潜在标志物的含量变化，对潜在标志物进行代谢通路分析，得到人参治疗脾气虚体质的代谢通路。
(3)从整体水平全面、快速、高效综合评价人参治疗脾气虚体质的作用机制，为天然植物的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。
附图说明
图1是本发明的基于超高液相色谱-飞行时间质谱技术的健康组、脾气虚组的偏最小二乘法-判别分析载荷图。A.正离子模式；B.负离子模式；
图2是本发明的基于超高液相色谱-飞行时间质谱技术的健康组、脾气虚组和给药组大鼠血液标本的偏最小二乘法-判别分析得分图；A.正离子模式；B.负离子模式，菱形代表脾气虚组，圆形代表给药组，正方形代表健康组；
图3是本发明使用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genesand genomes)数据库平台进行分析的代谢通路总结图。方框中为已识别的潜在生物标志物。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明方法的具体实现过程如下：
采用超高液相色谱-飞行时间质谱分离并鉴定健康者、脾气虚体质患者及人参干预后的脾气虚体质患者三组血液代谢产物，获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出十三个人参潜在治疗脾气虚体质相关血液标志物并进行鉴定；利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库筛选出人参治疗脾气虚体质的相关代谢通路网络并进行分析；
获得人参治疗脾气虚体质的潜在标志物代谢通路的具体实现步骤如下：
1.志愿者诊断、纳入及排除标准：
根据《中医体质分类与判定》调查问卷，结合资深中医专家诊脉对志愿者体质进行判定。主症：气喘无力、动则出汗、神疲倦怠、食欲不振；次症：腹胀、二便无力、舌苔薄、脉细弱；证候诊断：主症2项加次症2项，纳入标准：(1)符合中医脾气虚型证候诊断标准；(2)患者本人签署或由其直系亲属代签知情同意书，志愿受试；(3)18周岁≤年龄≤50周岁者，性别不限；(4)在进入研究前至少15天内没有服用过任何其他药物，未参加其他临床研究者；排除标准：(1)对人参过敏者；(2)合并有心血管、肺、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病者，精神性疾病患者，妊娠或哺乳期妇女；(3)有重大医疗或手术病史，可能会显著影响研究结果或计划的手术；(4)进展性恶性肿瘤或其它严重消耗性疾病，易合并感染和出血者；(5)有严重的抑郁、焦虑症状、对黑暗空间恐惧者；(6)凡不符合纳入标准，依从性差，未按规定进行治疗，无法判断疗效或资料不全等影响疗效和安全性判断者；
2.志愿者干预法：
纳入脾气虚体质患者20例、健康者10例，分为健康对照组(健康组)、脾气虚体质对照组(脾气虚组)和脾气虚体质给药组(给药组)，每组10例，健康组志愿者正常生活不作干预；脾气虚组志愿者给予安慰剂治疗；给药组志愿者给予人参中药配方颗粒，江阴天江药业有限公司，批号：1706083，治疗，口服，每次1包，每日2次，共服用4周；
3.血液样本的采集和前处理：
分别对三组受试者干预前、后进行清晨空腹血液样本采集，采集后沉降1h，4℃、3000r·min-1，离心10min，密封，置于-80℃低温冰箱保存；测定前，将样本从-80℃低温冰箱中取出，4℃下解冻；每200μL血清加800μL乙腈，涡旋震荡1min，静置10min，4℃、12000r·min-1离心10min后取上清液，过0.22μm有机系滤膜，得到血液标本；
4.超高液相色谱-飞行时间质谱串联检测：
将每个血液标本分别进入LC-MS进行分离
色谱条件：色谱柱为C18 HPLC色谱柱(3.5μm,2.1mm×100mm)，分离条件为：柱温为30℃；流速0.3mL/min；流动相组成A：水+0.1％甲酸，B：乙腈；梯度洗脱程序见表1；进样量为5μL；自动进样器温度4℃。
表1色谱梯度洗脱程序
时间(分钟) 流速(毫升/分钟) A(％) B(％)
0 0.3 95 5
5 0.3 80 20
10 0.3 65 35
15 0.3 2 98
17 0.3 0 100
质谱条件：分别采用电喷雾正离子模式(+ESI)和负离子模式(-ESI)对样品进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型；毛细管电压3.5kV、锥孔电压65V、脱溶剂气温度350℃、干燥气流速9L/min、数据采集范围：50～3000m/z；
5.超高液相色谱-飞行时间质谱数据预处理
将超高液相色谱-飞行时间质谱采集的血液标本数据用安捷伦工作站MassHunter软件对所有原始质谱数据进行预处理，运用“查找化合物”项下的“按分子特征查找”，其中目标数据类型：小分子(色谱)；限制保留时间到：0-17(分钟)；使用峰高为以下值的峰：500(计数)；离子种类项：正离子+H、+Na、+K、+NH4，负离子-H、+CL、+Br、+HCOO、+CH3COO、+CF3CPP；峰间距容差：0.0025m/z，7ppm；同位素模型：常见有机分子；将指定电荷限制为下列最大值：1；绝对峰高：500(计数)；按以上分子特征查找化合物，导出“.cef”格式数据。运用Mass Profiler Professional(MMP)软件进行保留时间校准、峰对齐、基线校准、数据的归一化和对数转换，其中峰对齐中保留时间范围：0.1min；质量范围：5pp±2m Da；初始过滤器的最小绝对丰度：500；去除噪音：l；
6.利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：
采用偏最小二乘法判别(PLS－DA)分析方法进行外部模型验证来证明模型的有效性；如图1所示，在排列实验中，左端任何一次随机排列产生的R2、Q2均小于右端，说明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列y变量的预测能力，即证明了模型有效，可以继续后面差异代谢物的寻找；通过模型验证后，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)方法进行分析，如图2所示，观测组间分布与组别关系发现：正离子模式和负离子模式下的OPLS-DA得分图显示3组血液样本代谢产物组内相对集中，但分布在不同区域，说明脾气虚组的生理及物质代谢状况已发生了明显改变，而给予人参治疗后给药组有向健康组回归趋势，说明人参能够调节脾气虚体质患者的体内代谢趋于健康；采用PLS-DA模型的重要变量因子，即VIP值(VIP＞1.0)，并结合t检验的P值(P<0.05)来寻找健康组与脾气虚组的差异代谢物信息；在其中筛选与给药组共同具有显著性差异影响的化合物作为人参影响脾气虚体质患者的生物标志物。将代谢物信息经人类代谢组数据库(The human metabolome database)检索，初步比对并推测出13个代谢标志物；
7.潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：
根据分子量推测可能的化学式，通过计算不饱和度、结合同位素峰相对强度进行筛选，初步鉴定该化合物及化学式，在Qualitative Analysis of Mass Hunter软件中查找该化合物碎片离子，分析确认是否为鉴定化合物的碎片离子，将结果与数据库中化合物进行比对确认，其它化合物的鉴定同上所述，标志物及含量变化具体见表2；
表2潜在生物标志物的鉴定及在各组的含量变化
*P<0.05,**P<0.01。脾气虚/健康：脾气虚组与健康组比较，给药/脾气虚：给药组与脾气虚组比较
8.潜在生物标记物的分析：
进一步利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes andgenomes)数据库对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路分析，得出13个代谢标志物通过影响体内的抗氧化及免疫功能、能量代谢、甘油、脂肪酸、糖代谢及胆汁酸代谢进而参与了人参治疗脾气虚体质的主要代谢过程，13个代谢标志物形成了相互交错的代谢网络，阐释了人参治疗脾气虚体质的作用机制。相关代谢通路参与了人参治疗脾气虚体质的代谢过程，如图3所示。
发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种基于代谢组学的人参治疗脾气虚体质潜在标志物代谢通路的研究方法，其特征在于，包括下列步骤：
采用超高液相色谱-飞行时间质谱分离并鉴定健康者、脾气虚体质患者及人参干预后的脾气虚体质患者三组血液代谢产物，获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出十三个人参潜在治疗脾气虚体质相关血液标志物并进行鉴定；利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库筛选出人参治疗脾气虚体质的相关代谢通路网络并进行分析；
获得人参治疗脾气虚体质的潜在标志物代谢通路的具体实现步骤如下：
1.志愿者诊断、纳入及排除标准：
根据《中医体质分类与判定》调查问卷，结合资深中医专家诊脉对志愿者体质进行判定，主症：气喘无力、动则出汗、神疲倦怠、食欲不振；次症：腹胀、二便无力、舌苔薄、脉细弱；证候诊断：主症2项加次症2项，纳入标准：(1)符合中医脾气虚型证候诊断标准；(2)患者本人签署或由其直系亲属代签知情同意书，志愿受试；(3)18周岁≤年龄≤50周岁者，性别不限；(4)在进入研究前至少15天内没有服用过任何其他药物，未参加其他临床研究者；排除标准：(1)对人参过敏者；(2)合并有心血管、肺、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病者，精神性疾病患者，妊娠或哺乳期妇女；(3)有重大医疗或手术病史，可能会显著影响研究结果或计划的手术；(4)进展性恶性肿瘤或其它严重消耗性疾病，易合并感染和出血者；(5)有严重的抑郁、焦虑症状、对黑暗空间恐惧者；(6)凡不符合纳入标准，依从性差，未按规定进行治疗，无法判断疗效或资料不全等影响疗效和安全性判断者；
2.志愿者干预法：
纳入脾气虚体质患者20例、健康者10例，分为健康对照组(健康组)、脾气虚体质对照组(脾气虚组)和脾气虚体质给药组(给药组)，每组10例，健康组志愿者正常生活不作干预；脾气虚组志愿者给予安慰剂治疗；给药组志愿者给予人参中药配方颗粒，江阴天江药业有限公司，批号：1706083，治疗，口服，每次1包，每日2次，共服用4周；
3.血液样本的采集和前处理：
分别对三组受试者干预前、后进行清晨空腹血液样本采集，采集后沉降1h，4℃、3000r·min-1，离心10min，密封，置于-80℃低温冰箱保存；测定前，将样本从-80℃低温冰箱中取出，4℃下解冻；每200μL血清加800μL乙腈，涡旋震荡1min，静置10min，4℃、12000r·min-1离心10min后取上清液，过0.22μm有机系滤膜，得到血液标本；
4.超高液相色谱-飞行时间质谱串联检测：
将每个血液标本分别进入LC-MS进行分离
色谱条件：色谱柱为C18 HPLC色谱柱(3.5μm,2.1mm×100mm)，分离条件为：柱温为30℃；流速0.3mL/min；流动相组成A：水+0.1％甲酸，B：乙腈；梯度洗脱程序见表1；进样量为5μL；自动进样器温度4℃；
表1色谱梯度洗脱程序
时间(分钟) 流速(毫升/分钟) A(％) B(％) 0 0.3 95 5 5 0.3 80 20 10 0.3 65 35 15 0.3 2 98 17 0.3 0 100
质谱条件：分别采用电喷雾正离子模式(+ESI)和负离子模式(-ESI)对样品进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型；毛细管电压3.5kV、锥孔电压65V、脱溶剂气温度350℃、干燥气流速9L/min、数据采集范围：50～3000m/z；
5.超高液相色谱-飞行时间质谱数据预处理
将超高液相色谱-飞行时间质谱采集的血液标本数据用安捷伦工作站Mass Hunter软件对所有原始质谱数据进行预处理，运用“查找化合物”项下的“按分子特征查找”，其中目标数据类型：小分子(色谱)；限制保留时间到：0-17(分钟)；使用峰高为以下值的峰：500(计数)；离子种类项：正离子+H、+Na、+K、+NH4，负离子-H、+CL、+Br、+HCOO、+CH3COO、+CF3CPP；峰间距容差：0.0025m/z，7ppm；同位素模型：常见有机分子；将指定电荷限制为下列最大值：1；绝对峰高：500(计数)；按以上分子特征查找化合物，导出“.cef”格式数据，运用MassProfiler Professional(MMP)软件进行保留时间校准、峰对齐、基线校准、数据的归一化和对数转换，其中峰对齐中保留时间范围：0.1min；质量范围：5pp±2m Da；初始过滤器的最小绝对丰度：500；去除噪音：l；
6.利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：
采用偏最小二乘法判别(PLS－DA)分析方法进行外部模型验证来证明模型的有效性；在排列实验中，左端任何一次随机排列产生的R2、Q2均小于右端，说明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列y变量的预测能力，即证明了模型有效，可以继续后面差异代谢物的寻找；通过模型验证后，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)方法进行分析，观测组间分布与组别关系发现：正离子模式和负离子模式下的OPLS-DA得分图显示3组血液样本代谢产物组内相对集中，但分布在不同区域，说明脾气虚组的生理及物质代谢状况已发生了明显改变，而给予人参治疗后给药组有向健康组回归趋势，说明人参能够调节脾气虚体质患者的体内代谢趋于健康；采用PLS-DA模型的重要变量因子，即VIP值(VIP＞1.0)，并结合t检验的P值(P<0.05)来寻找健康组与脾气虚组的差异代谢物信息；在其中筛选与给药组共同具有显著性差异影响的化合物作为人参影响脾气虚体质患者的生物标志物，将代谢物信息经人类代谢组数据库(The human metabolome database)检索，初步比对并推测出13个代谢标志物；
7.潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：
根据分子量推测可能的化学式，通过计算不饱和度、结合同位素峰相对强度进行筛选，初步鉴定该化合物及化学式，在Qualitative Analysis of Mass Hunter软件中查找该化合物碎片离子，分析确认是否为鉴定化合物的碎片离子，将结果与数据库中化合物进行比对确认，其它化合物的鉴定同上所述，标志物及含量变化具体见表2；
表2潜在生物标志物的鉴定及在各组的含量变化
*P<0.05,**P<0.01，脾气虚/健康：脾气虚组与健康组比较，给药/脾气虚：给药组与脾气虚组比较
8.潜在生物标记物的分析：
进一步利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes andgenomes)数据库对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路分析，得出13个代谢标志物通过影响体内的抗氧化及免疫功能、能量代谢、甘油、脂肪酸、糖代谢及胆汁酸代谢进而参与了人参治疗脾气虚体质的主要代谢过程，13个代谢标志物形成了相互交错的代谢网络，阐释了人参治疗脾气虚体质的作用机制。
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