KR20120046754A - 히드록시 지방산 화합물 및 질병 치료 및 진단을 위한 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
하기 식(I)의 화합물:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. 이러한 화합물은 대상에서 염증, 염증 질환 및 암을 검출하는데에 유용하고, 또한 이들 증상을 치료 및/또는 예방하는 것을 포함하는 치료 적용에 또한 유용할 수 있다. 약제학적 조성물, 조합물 및 보충제 뿐만아니라 상기 화합물을 이용한 치료 방법이 제공된다.
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. 이러한 화합물은 대상에서 염증, 염증 질환 및 암을 검출하는데에 유용하고, 또한 이들 증상을 치료 및/또는 예방하는 것을 포함하는 치료 적용에 또한 유용할 수 있다. 약제학적 조성물, 조합물 및 보충제 뿐만아니라 상기 화합물을 이용한 치료 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 질병 및 생리적 증상의 검출 및 치료에 유용한 화합물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 하이드록시 지방산, 이를 포함하는 조성물, 및 결장직장암, 염증 및 염증 질병의 치료 및 검출을 위해 이들 화합물을 이용하는 방법에 관한 것이다.
결장직장암(colorectal cancer)(CRC) 치사율은 모든 암들 중에서 가장 높은 것 중의 하나이고, 오직 폐암에만 두 번째이다(Canadian Cancer Statistics, 2008). 조기 검출의 공지된 이 점에도 불구하고, 대장내시경 및 분변잠혈반응검사에 기초한 스크리닝 프로그램은 국민수용성, 비용, 제한된 자원, 정밀도, 및 표준화와 같은 도전으로 애를 태우고 있다. 오직 CRC 스크리닝만을 위한 대장내시경의 사용은 실제적이지 않고1, CRC의 발달에 높은 위험성을 갖는 환자를 정확히 식별할 수 있는 최소-공격성 혈청-기초 시험(minimally-invasive serum-based test)이 현행 접근보다 높은 스크리닝 순응성 및 기존 위내시경 자원의 보다 양호한 이용을 가져온다는 것이 분야에서 공감대가 있다1 -3. CRC 환자로부터의 생물학적 샘플과 관련된 변경된 전사 수준4 -11, 이상형의(aberrantly) 메틸화 유전자 생성물12 -14 및 프로테오믹(proteomic) 패턴15 -18에 대한 다수의 보고가 있긴 하지만, 있다 하더라도 임상적으로 유용한 시험으로 진전되는 것은 거의 없다. 이는 분석 설계에서 기술적 장애, 재현성 있는 결과를 얻는 요구, 비용, 및 길이 조절 공정을 포함하는 다수의 이유에 기인할 수 있다. 더구나, 현재 사용되거나 개발중인 시험의 대부분은 종양-특이적 마커의 검출에 기초하고, 매우 초기 단계이거나, 위험에 처할 소지가 있으나 질병의 어떤 임상적 나타냄을 보이지 않는 대상을 확인하는데에 민감성이 불량하다.
CRC에 대한 원인이 되는 유전적 변경이 잘 특성화되어 있지만, 선종형폴립증유전자(APC) 및 유전성비용종성대장암(HNPCC)에 기인한 다수의 원인이 전체의 5% 미만이고, 대략 15%가 여전히 윤곽이 그려져야 하는19 저 침투도 돌연변이의 복잡한 패턴에 기인할 것 같은 유전성 가족 위험에 기인하는 것으로 주장되고 있다. CRC의 경우의 대략 80%가 음식물 및 생활스타일이 주요 위험 인자20 ,21이면서 산발성으로 일어나는 것으로 생각되고 있다. 또한, 개개의 미생물군집이 그들의 위장 생리 상태에 복잡하게 연결되어 있고, 그 자체로서 위험 인자22로서 포함될 수 있다. 대사가 음식물 및 생활 스타일에 의해 상당히 영향을 받고 미생물군집이 그의 대사 과정에 기여한다고 가정하면, CRC의 위험 인디케이터로서 대사 마커를 동정하는데 목적을 둔 노력이 거의 없다는 것은 놀라운 것이다. 이는 부분적으로 DNA 마이크로어레이 또는 표면-향상된 레이저 이탈/이온화(SELDI)가 전사 또는 단백질을 특징화시키는 유사한 방법으로 대사물을 이해할 수 있게 특성화시킬 수 있는 기반 기술 및 정보과학 접근의 결여에 기인할 수 있다.
그러므로, CRC 검출을 위한 정밀한 방법, 특히 상기 질병의 초기 단계를 검출할 수 있는 방법이 필요로 하고 있다.
대사물 분석을 위한 질량 분석-기초 시스템
최근에, 병행 방식으로23 -25, 샘플내의 다수의 대사 성분들을 동정할 수 있는 질량 분석-기초 시스템에서 진전이 이뤄졌다.
퓨리에 변환 이온 사이클로트론 공진 질량 분석계(FTICR-MS)는 전하를 띤 입자가 자기장에서 사이클로트론 운동을 나타내는 원리에 기초하고, 여기에서, 스핀 빈도가 질량에 비례한다26. FTICR-MS는 그의 높은 해상력(resolving power)과 밀리온당 1부(ppm)아래의 질량 정밀도로 이온을 검출할 수 있는 능력에 대해 알려져 있다. 액체 샘플 추출물은 전자 스프레이 이온화(ESI) 및 색체 분리23없는 대기압 화학적 이온화(APCI)를 이용하여 직접적으로 주입될 수 있고, 여기에서, 상이한 질량 대 전하(M/Z) 비를 갖는 이온은 퓨리에 변형물을 통해 동시에 해상될 수 있다. 정보과학 접근을 사용하여, 다중 샘플로부터의 스펙트럼 파일이 정확히 배열되고, 비교된 샘플에 걸쳐 피크 강도가 비교될 수 있다23. 고 해상은 또한 대사물 분류 및 동정을 위한 고체 기반, 및 새로이 대사 네트웍23 ,27을 구성할 수 있는 능력을 제공하면서, 샘플 내의 검출되는 모든 이온의 원소적 조성을 예견할 수 있게 한다.
그럼에도 불구하고, 질병의 초기 단계에서 CRC를 검출하는데에 이용할 수 있는 정밀한 혈청 마크없이, 질량-분석법-기초 진단 시스템이 임상 시험에서 널리 사용되지 않고 있다.
염증 및 질병에서의
바이오액티브
지질의
역활
염증은 암을 포함하는 많은 인간 질병에 임상적 근저를 이루는 성분이다. 염증이 어떻게 일어나고 신체에 의해 조절되는지, 및 음식 및 환경적 인자가 어떻게 염증에 충격을 주는지 이해하는 것이 질병 예방 및 치료에 있어 중요하다.
염증에서 바이오액티브 지질의 역활은 아라키돈산이 사이클로옥시게나제 및 리폭시게나제의 활성을 통해 다양한 프로(pro)-염증성 중재자인 프로스타글란딘 및 류코트리엔을 생기게 하는 것을 보여준 보르기트(Borgeat) 및 사무엘슨(Samuelsson)에 의해 1979년에 보고되었다(Borgeat P, Samuelsson B. Metabolism of arachidonic acid in polymorphonuclear leukocytes. Structual analysis of novel hydroxylated compounds. J. Biol Chem, 1979,254:7865-9). 그 이래로, 다중불포화 지방산(PUFAs)이 또한 유익한 건강 효과를 가질 수 있고, 암을 포함하는 다수의 염증-관련된 질환에 대해 보호할 수 있다는 것을 제시하는 보고된 다수의 데이터가 있다(Chapkin RS, Davidson LA, Ly L, et al. Immunomodulatory effects of (n-3) fatty acids: putative link to inflammation and colon cancer, J. Nutr. 2007, 137:200S-204S; Chapkin RS, McMurray DN, Lupton JR, Colon cancer, fatty acids and anti-inflammatory compounds. Curr . Opin . Gastroenterol. 2007, 23:48-54; Chapkin RS, Seo J, McMurray DN, et al., Mechanisms by which docosahexaenoic acid and related fetty acids reduce colon cancer risk and inflammatory disorders of the intestine. Chem . Phys . Lipids 2008, 153:14-23). 특히 관심 있는 것은 염증의 완화(resolution)에서 n-3 및 n-6 지방산의 역할이다.
PUFAs의 n-3 부류는 어유(fish oils)에서 풍부하고, 아실 쇄의 메틸 위치로부터 제 1 이중-결합의 위치에 의해 정의된다. 매우 긴 쇄 도코사헥사에노 산(DHA;22:6n-3) 및 에이코사펜타에노산((EPA;20:5n-3)은 어유에서 매우 풍부한 n-3 PFUAs이고, 보다 짧은 쇄 리놀렌 산(LNA; 18:3n-3)은 아마 및 캐놀라와 같은 종자(seed) 오일에서 풍부하다. n-3 지방산의 내생(endogeneous) 수준은 그들의 생체내 합성이 가능하지만 음식물에 의해 상당히 영향을 받는다. n-3 항-염증 활성의 정확한 메카니즘은 빈약하게 이해되어 있고, 성질에 있어 다양하다. 그러나, 많은 다면 발현 효과가 세포막 구조 및 유동성의 변화, 프로스타글란딘 합성의 억제, PPARa및 톨-라이크(Toll-like) 수용체를 통한 NF-κB의 조절, 단백질 표적화에서의 변경, 및 다양한 염증-완화 생성물로의 변환에 기인할 수 있다(Chapkin RS, Davidson LA, Ly L, et al. Immunomodulatory effects of (n-3) fatty acids: putative link to inflammation and colon cancer. J. Nutr. 2007, 137:200S-204S; Chapkin RS, McMurray DN, Lupton JR. Colon cancer, fatty acids and anti-inflammatory compounds. Curr . Opin. Gastroenterol. 2007, 23:48-54; Chapkin RS, Seo J, McMurray DN, et al. Mechanisms by which docosahexaenoic acid and related fatty acids reduce colon cancer risk and inflammatory disorders of the intestine. Chem . Phys . Lipids 2008, 153:14-23).
급성 염증은 감염, 상처 또는 외상에 단기간 반응이고, 다른 화학-유인제와 조합하여 감염 또는 상처 부위로 백혈구의 재순환을 가져오는 n-6 아라키돈산으로 부터 유래된 류코트리엔 및 프로스타글란딘과 같은 프로-염증 중재자의 방출에 의해 특징지어진다. 염증의 이 초기 파동은 그 후 곧 추가의 PMN 재순환이 또한 아라키돈산으로 부터 리폭시게나제-유래된 에이코사노이드를 생성하는 혈소판-백혈구 상호작용을 통해 체크되는 사그라짐 파동이 동반된다. 결과적인 리폭신은 매우 효능이 있고 픽토그램(pictogram) 양에서 작용한다. 이들은 또한 아스피린-자극되어, 아스피린에 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAIDs) 중 독특한 능력을 주어 염증의 완화를 촉진한다.
리폭신외에, n-3 매우-긴-쇄 지방산(VLCFA) 중재자의 유사한 역할이 확인되었다. 이들은 두 개의 특징적인 부류에 속한다: 레졸빈(완화-상 상호작용 생성물) 및 프로텍틴(뉴로프로텍틴으로 또한 언급되는 신경 조직의 초기 보호로부터 생기는). EPA로부터 기원하는 레졸빈은 E-시리즈로 언급되고, 레졸빈 E1(RvE1)이 프로토타입(prototypical) 멤버로 언급되며, 한편, DHA로부터 기원하는 레졸빈은 레졸빈 D1(RvD1)으로 전형화되는 D 시리즈를 나타낸다. 그러나, DHA는 또한 뉴로프로텍틴 D1과 같은 프로텍틴을 생성시킬 수 있다(Serhan CN. Novel chemical mediators in the resolution of inflammation: resolvins and protectins. Anesthesiol . Clin . 2006, 24:341-64; Serhan CN. Novel eicosanoid and docosanoid mediators: resolvins, docosatrienes, and neuroprotectins. Curr . Opin . Clin . Nutr . Metab . Care 2005, 8:115-21; Serhan CN, Gotlinger K, Hong S, et al. Anti-inflammatory actions of neuroprotectin D1/protectin D1 and its natural stereoisomers: assignments of dihydroxy-containing docosatrienes. J. Immunol . 2006, 176:1848-59). 리폭신과 같이, E 및 D 시리즈 레졸빈은 또한 아스피린에 의해 자극될 수 있다(Serhan CN, Hong S, Gronert K, et al. Resolvins: a family of bioactive products of omega-3 fatty acid transformation circuits initiated by aspirin treatment that counter proinflammation signals. J. Exp . Med . 2002, 196:1025-37).
많은 질병에서 염증의 중심 역할이 알려지면서, 염증 조절에 포함된 내생 대사 시스템의 확인이 최고 관심사이다. 급성 염증이 충분히 "완화되게 하는" 능력이 없는 것이 암 및 알쯔하이머 병과 같은 증상의 근저를 이루는 만성 염증 상태의 설정 을 뒷받침하는 주요한 이론이다. 특히, 염증성 내장 병(IDB), 크론 병, 대장염, 및 결장 암과 같은 장 염증 증상에 대한 프로-완화 중재자의 효과가 관련이 있다.
RvE1 및 LXA4 모두가 결장 염증에 대한 보호 효과에 관련된다. RvE1은 백혈구 침윤(infiltration)에서의 차단, 감소된 프로염증성 유전자 발현, 유도된 산화 질소 신타제에 의해 잔존률 및 유지되는 체중에서의 개선이 수반되어, 마우스에서 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산-유도된 대장염의 발달에 대해 보호하는 것으로 나타났다(Arita M, Yoshida M, Hong S, et al. Resolvin E1, an endogenous lipid mediator derived from omega-3 eicosapentaenoic acid, protects against 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2005, 102:7671-6). 유사하게, LXA4 유사체는 생체외(ex vivo) 인간 결장에서 케모킨 분비를 감소시키는 것으로 나타났고(Goh J, Baird AW, O'Keane C, et al. Lipoxin A(4) and aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A(4) antagonize TNF-alpha-stimulated neutrophil-enterocyte interactions in vitro and attenuate TNF-alpha-induced chemokine release and colonocyte apoptosis in human intestinal mucosa ex vivo. J. Immunol . 2001, 167:2772-80), 병원성적으로 유도된 위장염에 반응하여 유도된 유전자, 특히 NFκB에 의해 조절되는 유전자의 50%를 감쇠시켰다(Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, et al. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J. Immunol. 2002, 168:5260-7). 생체내에서, LXA4 유사체는 DSS-유도된 염증 대장염에서 장 염증을 감소시켜, 체중 감소, 혈변 및 치사율이 상당히 감소되었다(Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, et al. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J. Immunol. 2002, 168:5260-7).
구조적으로, 리폭신, 레졸빈 및 프로텍틴은 다양한 리폭시게나제, 사이클로옥시게나제 및 p450 효소에 의해 촉매되어 모 VLCFAs의 일-, 이- 및 삼-히드록실화 생성물이다. 이들 분자의 특정한 생리학적 효과가 상기 언급된 바와 같이 기록되었지만, 이 사그라짐"스톱 신호"가 어떻게 발휘되는지를 기록한 메카니즘은 미스테리로 남아있다.
본 발명자들은 염증을 감소시키고 전세포사멸사적, 항암 활성의 촉진에 역할을 하는 히드록실화 지방산의 신규의 부류를 본 명세서에서 기술한다.
본 발명의 목적은 염증, 염증 질환 및 암의 치료 또는 경감을 위한 화합물 및 관련된 약제학적 조성물 및 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 대상에서 염증, 염증 질환 및 암을 검출하는데에 유용한 화합물, 검출 또는 진단의 관련된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 면에 따르면, 하기 식(I)의 화합물이 제공된다:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다.
상기 식(I)에서, R은 바람직하게는 C28-C36 지방족 그룹, 보다 바람직하게는 C28 지방족 그룹이다. 본 명세서에서 사용된바, 직쇄 지방족 그룹은 개방 쇄 포화 탄화수소, 예를 들어 올레핀 또는 알케닐 그룹을 의미한다. 본 명세서에서 사용된바, 히드록시 치환된(hydroxy substituted) 은 화합물이 탄화수소 쇄 중의 하나 이상의 수소 원자 대신에 하나 이상의 히드록시 치환체를 가질 수 있음을 의미한다.
어떠한 방법으로도 제한하려함이 없이, 상기 화합물은 특정 실시형태에서 하기 화합물들의 하나일 수 있다:
상기 화합물은 천연 자원으로부터 분리되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 모든 화합물은 단일 입체이성체 또는 그의 혼합물 및/또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로서 제공될 수 있다.
상기 화합물은 또한, 예를 들어 진단 분석, 생체 내 분석물 수준의 정량화 등에서, 표준물로서 사용을 용이하게 하기 위하여 표지될 수 있다. 비제한적인 실시형태에서, 화합물은 13C와 같은 안정한 동위원소, 32P 또는 35S와 같은 방사성 동위원소, 플루오레세인 또는 동등물과 같은 형광 태그로 표지된다. 대안적인 비-제한적 실시형태에서, 화합물은 시험관내 또는 생체내에서 검출을 용이하게 하기 위하여 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, 비오틴 등과 같은 효소 또는 단백질로 표지되거나 그에 콘쥬게이트된다(conjugated).
따라서, 본 발명은 추가로 검출 시약으로 표지된 식(I)의 화합물을 포함하는 표준물을 제공한다.
상기 기술된 표준물을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 이러한 키트는 지시서 및 분석물을 정량화하는데에, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 진단 분석을 수행하는데에 유용한 다른 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 면으로서, CRC를 치료, 예방 또는 경감하기에 충분한 양의 식(I)의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, CRC를 갖는 것으로 진단된, 또는 CRC를 갖는 것으로 의심되는 대상을 치료하는 방법이 제공된다.
추가적으로, 종양의 성장을 억제하는데에 충분한 양의 식(I)의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 종양 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 특정 실시 형태에서, 종양 성장의 억제는 성장의 완전한 억제를 포함하는 종양 성장 지연의 다양한 정도를 포함할 수 있다. 이러한 처리는 종양 크기에서의 감소를 또한 포함할 수 있다. 종양은 제한되는 것은 아니지만 위암, 췌장암, 난소암, 식도암, 및 다른 위-장/복부 암과 같은 대장 및 직장의 암을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 대상의 위장(GI) 질환을 치료, 예방 또는 경감하기에 충분한 양의 식(I)의 화합물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 위장(GI) 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. GI 질환은 염증 내장 질병(IBD), 크론병, 및/또는 대장염(colitis)과 같은 비-악성 질환이거나, 또는 용종(polyps) 또는 다양한-등급의 형성장애의 존재일 수 있다.
또한, 본 명세서에 염증 및/또는 염증-관련된 질환을 예방하기에 유효한 양으로 염증 및/또는 염증-관련된 질환의 예방을 필요로 하는 대상에게 식(I)의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상에서 염증 및/또는 염증-관련된 질환을 예방하는 방법이 제공된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 질병의 초기 신호를 포함하는, 질병의 진단 및 검출 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서에 대상의 CRC 건강 상태 또는 건강 상태에서의 변화를 진단하거나, 대상에서 CRC를 진단하거나 또는 CRC의 위험을 진단하기 위한 방법으로서,
a) 대상으로부터의 샘플을 분석하여 상기 샘플내의 식(I)의 화합물의 양을 정량하는 단계;
b) 대상의 샘플에서의 상기 화합물의 정량된 양을 하나 이상의 참조 샘플내의 상기 화합물의 대응하는 양에 비교하여 대상 샘플 내의 상기 화합물의 증감의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및
c) 대상의 CRC 건강 상태 또는 건강 상태에서의 변화를 진단하거나 대상에서의 CRC 또는 CRC의 위험을 진단하기 위한 상기 증감을 사용하는 단계를 포함하는, 대상의 CRC 건강 상태 또는 건강 상태에서의 변화를 진단하거나, 대상에서 CRC 또는 CRC의 위험을 진단하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명은 추가로 대상에서 식(I)의 화합물의 수준을 측정하고, 상기 수준을 정상 상태의 히드록실화 다중불포화 초(ultra) 긴-쇄 지방산(hPULCFAs)의 대응하는 표준 수준에 비교하는 것을 포함하는, hPULCFA 결핍 질환(hPDD)을 갖는 대상의 확인 및/또는 진단 방법에 관한 것이다.
이러한 방법은
a) 대상으로부터의 샘플을 분석하여 샘플 내의 식(I)의 화합물의 양을 정량하는 단계;
b) 대상 샘플 내의 상기 화합물의 정량된 양을 하나 이상의 참조 샘플 내의 상기 화합물의 대응하는 양에 비교하여 대상 샘플 내의 상기 화합물의 양에 있어서의 증감의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및
c) 대상 내의 hPDD를 진단하기 위해 상기 증감을 사용하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 식(I)의 화합물을 대상에서 hPDD를 개선 시키기에 충분한 양으로 투여하여 대상의 hPDD를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 투여되는 화합물의 양은 hPULCFA 수준을 상승시키기에, 보다 바람직하게는 hPULCFA 수준을 정상 상태로 회복시키기에 효과적이다.
"정상 상태"란 건강하다고 여겨지거나 달리 hPDD를 갖지 않은 것으로 여겨지는 대상에서의 hPULCAs 수준을 의미한다.
본 발명은 또한 염증의 마커로서, 및 항-염증 약물의 효과를 모니터링하기 위한 식(I)의 하나 이상의 화합물의 용도에 관한 것이다. 따라서,
a) 대상으로부터의 샘플을 분석하여 샘플 내의 식(I)의 화합물의 양을 정량하는 단계;
b) 대상 샘플 내의 상기 화합물의 정량된 양을 하나 이상의 참조 샘플 내의 상기 화합물의 대응하는 양에 비교하여 대상 샘플 내의 상기 화합물의 양에 있어서의 증감의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및
c) 대상 내의 염증 또는 염증 질병을 진단하기 위해 상기 증감을 사용하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
염증 또는 염증 질병을 진단하는 상기 방법에서, 염증은 IBD, 크론병, 및/또는 대장염과 같은 GI 질환에 의해 야기되거나, 염증 질병은 이를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 이러한 GI 질환을 진단하는 방법을 포함할 수 있다.
항-염증 약물의 효과를 모니터링하는 방법은
a) 상기 항-염증 약물로 처리된 대상으로부터의 샘플을 분석하여 샘플 내의 식(I)의 화합물을 정량하고;
b) 대상 샘플 내의 상기 화합물의 정량된 양을 하나 이상의 참조 샘플 내의 상기 화합물의 대응하는 양에 비교하여 대상 샘플 내의 상기 화합물의 양에 있어서의 증감의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함하고,
여기에서 대상 샘플 내의 상기 화합물의 양에 있어서의 증감은 대상에서 항-염증 약물에 의해 야기되는 효과를 나타낸다.
상기 방법에서, 상기 항-염증 약물로 처리된 대상은 전형적으로 염증 및/또는 염증 증상 또는 질병을 갖는 것으로 진단되거나 또는 의심될 것이다. 달리는, 상기 방법은 염증 및/또는 염증 증상 또는 질병을 갖는 것으로 진단되거나 의심되는 제 1 서브-그룹 또는 집단, 및 염증 및/또는 염증 증상 또는 질병의 생리학적 신호를 갖지 않거나 나타내지 않는 것으로 진단된 제 2 서브-그룹 또는 집단을 포함하는 대상의 한 그룹을 포함하는 비교 분석에 적용될 수 있다.
상기 진단 방법의 특정 실시형태에서, 대상으로부터의 샘플은 단계 a)에서 질량 분석법에 의해 분석되어 상기 화합물에 정밀한 질량 강도 데이터를 얻고, 상기 정밀한 질량 강도 데이터는 단계 b)에서 하나 이상의 참조 샘플로부터 얻어진 대응하는 정밀한 질량 강도 데이터에 비교되어 정밀한 질량 강도에서의 증감이 확인된다. 또한, 대상으로부터의 샘플은 추가로 분석되어 하나 이상의 내부 대조군 대사물에 대해 정밀한 질량 강도 데이터를 정량화하거나 얻을 수 있다. 이러한 실시형태에서, 화합물의 정량화된 양, 또는 얻어진 정밀한 질량 강도 데이터와 하나 이상의 내부 대조군 대사물에 대해 얻어진 정량화된 양 또는 정밀한 질량 강도 사이의 비가 결정될 수 있다. 이어서, 비교 단계 b)는 각 비를 하나 이상의 참조 샘플에 대해 얻어진 하나 이상의 대응 비들에 비교하는 것을 포함한다.
상기-기술된 진단 방법에서, 정량화 데이터는 퓨리에 변환 이온 사이클로트론 공진, 비행 시간(time of flight), 오비트랩(orbitrap), 사중극자 또는 삼중 사중극자 질량 분석기를 사용하여 얻을 수 있다. 제한되는 것은 아니지만 탠덤(tandem) 질량 분석기, NMR 또는 효소결합면역흡착 검사(ELISA) 방법을 포함하는 분석물을 정량화하는 다른 방법들이 또한 사용될 수 있다. 또한, 샘플은 대상으로 부터의 어느 생물학적 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플, 혈액 혈청 샘플, 척수액 샘플 등 일 수 있다. 추가로, 정밀한 질량 강도는 본 명세서에 기술된 바와 같은 추출 방법에 의해, 예를 들어 비극성 대사물은 유기 용매에 용해되고 극성 대사물은 수성 용매에 용해되는, 샘플에 액체/액체 추출을 수행하여, 얻어진 샘플 내의 이온화된 대사물을 나타낸다. 이 방식으로, 정밀한 질량 강도가 양 전자분무이온화, 음 전자분무이온화, 양성(negative) 대기압 화학 이온화, 음성 대기압 화학 이온화, 또는 이들 방법의 조합과 같은 이온화 방법을 사용하여 추출된 샘플의 이온화로부터 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 참조 샘플은 하나 이상의 참조 샘플을 포함할 수 있고, 시험 되는 질병 또는 증상에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 대상의 CRC 건강 상태 또는 건강 상태에서의 변화를 시험할 때, 또는 환자에서 CRC 또는 CRC의 위험을 진단할 때, 상기 하나 이상의 참조 샘플은 CRC를 갖는 것으로 진단되지 않고/않거나 CRC와 관련된 생리학적 증상을 나타내지 않는 한 명 이상의 건강한 개개인들로부터 얻어진다. hPDD에 대해 대상을 시험할 때, 하나 이상의 참조 샘플이 hPDD를 갖는 것으로 진단되지 않은, 일반적인 집단의 수준과 일치하는 hPULCFA 수준을 갖고/갖거나 hPDD와 결합된 생리학적 증상을 나타내지 않는 한 명 이상의 건강한 개개인들로부터 얻어질 것이다. 염증 또는 염증 질병을 진단하는 방법 경우, 하나 이상의 참조 샘플은 염증 또는 염증 질병을 갖는 것으로 진단되지 않고/않거나 염증 또는 염증 질병과 결합된 생리학적 증상을 나타내지 않는 한 명 이상의 건강한 개개인들로부터 올 것이다. 다른 한편, 항-염증 약물의 효과를 모니터링할 때, 하나 이상의 참조 샘플은 항-염증 약물을 투여하거나 이것으로 치료하기 전 취해진 같은 대상으로부터의 샘플일 수 있거나, 달리는, 염증 및/또는 염증 증상 또는 질병의 생리학적 신호를 갖지 않거나 나타내지 않는 것으로 진단된 한 명 이상의 건강한 개개인들로부터의 샘플일 수 있다.
또한, 다음 화합물들이 본 명세서에 제공된다:
이러한 화합물은 특별히 화합물 D046-124의 합성에서 중간체로서 유용하다:
또한, 본 명세서에 다음 단계들을 포함하는 화합물 D046-124를 제조하는 방법이 제공된다:
(i) 식(II)의 화합물을 식(III)의 화합물과, 식(IV)의 화합물을 생성하는 조건들에서 반응시키는 단계,
(ii) TBDPS 그룹을 제거하여 식(V)의 화합물을 생성하는 단계,
(iii) 식(V)의 화합물을 식(VI)의 화합물과, 식(VII)의 화합물을 생성하는 조건하에서 반응시키는 단계,
(iv) 식(VII)의 화합물을 촉매와, 식(VIII)의 화합물을 생성하는 조건하에서 반응시키는 단계,
(v) 식(VIII)의 화합물의 말단 에스테르 작용기를 카복실 산 그룹으로 가수분해시켜 표제 화합물을 생성하는 단계:
상기 방법은 추가로 화합물 D046-124를 단리하기 위하여 하나 이상의 정제 단계들을 포함할 수 있다. 또한, 식(VII)의 화합물은 특정한 비-제한적인 실시형태에서 상기 단계 (iv)에서 Pd 촉매의 존재하에서 수소화에서 1Atm 압력에서 탄산 칼슘과 반응시켜 삼중 결합을 이중 결합으로 선택적으로 전환시켜 식(VIII)의 화합물을 생성할 수 있다.
본 분야에 숙련된 자는 일상에 지나지 않는 실험을 하여 본 명세서에 기술된 특이적 과정들에 대한 수많은 동등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 본 발명의 범위에 드는 것으로 여겨지고, 이어지는 청구범위에 의해 커버된다.
본 발명의 이들 및 다른 특징들이 이어지는 도면을 참고로 한 하기 기술에서 명백해질 것이다.
도 1은 연구 설계이다. 이 연구는 세 개의 단계들을 포함하였다: 세 개의 독립적인 샘플 세트에서 FTICR-MS 대사체 발견(metabolomic), hPULCFAs와 같은 대사 바이오마커의 구조적 조사 및 결정, 및 삼중-사중극자(triple-quadrupole) MRM 표적 분석을 사용한 확인.
도 2는 세개의 독립적인 연구에서 CRC와 보통 환자 혈청 사이의 평균 샘플 피크 강도 배(fold) 변화의 분산 플롯이다. 모든 대상에 대한 샘플-특이적 피크는 대조군 집단의 평균에 대해 log2 정규화하고, 질량(Da)에 따라 플로팅했다. 비쌍 스튜던트 t-시험(레전드(legend) 참조)에 기초한 유의성에 따라 점들이 착색됐다. (a) GCI 발견 인구, (b) 세라케어(Seracare) 1 발견 집단, (c) 오사카 발견 집단. 회색으로 박스를 친 영역은 모든 세 개의 집단에서 대조군에 비해 CRC 환자에서 일치하게 감소된 440 내지 600Da에서의 질량의 덩어리를 나타낸다.
도 3은 질병 단계에 의한 대사물 446 및 448의 상대적 강도 및 각 발견 데이터세트에 대한 AUCs이다. (a) 각 샘플 세트에서 상대적 강도 대 질병 단계의 바 차트; (b) 대사물 446 및 448 경우 질병 단계와 대조군 사이의 P-값의 비교의 요약; (c) 각 발견 세트에서 마커 446 및 448 및 모든 CRCs 대 모든 대조군에 기초한 ROC 분석.
도 4는 정상적 대상 및 CRC 환자로부터의 혈청의 추출된 질량 스펙트럼이다. GCI 발견 세트로부터의 5개 대표적 CRC 및 5개 대조군 샘플로부터의 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거치게 하고 API 음성 방식으로 Applied Biosystems QSTAR XLTM 질량 분석기 상에서 완전-스캔 검출을 하였다. 16분 내지 18분 사이에 용출하는 질량 범위 100 내지 700 Da 내의 모든 이온의 평균 강도가 각 집단에 대해 나타나 있다. 박스를 친 영역은 정상적 환자에서는 존재하나 CRC-양성 혈청으로부터는 결여된 스펙트럼 특징을 나타낸다.
도 5는 세라캐어(Seracare) 2 확인 샘플 세트의 삼중-사중극자 MRM 분석의 결과이다. (a) 지각 증상이 없는 대조군, 및 예비-처리 CRC 환자에서 13C-콜산(13C-cholic acid) 등가물로 표현되는 hPULCFAs 446, 448 및 450의 농도의 분산 플로트, (b) (a)에서의 대응하는 분산 플로트에 기초한 ROC 분석. 회색 점선 라인은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. (c) 질병 단계에 의한 hPULCFAs의 평균 농도 등가물의 바 차트. 오차(error) 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다. (d) 질병 단계에 의한 ROC 분석.
도 6은 지바(Chiba) 확인 샘플 세트의 삼중-사중극자 MRM 분석의 결과이다. (a) 지각 증상이 없는 대조군, 및 예비-처리 CRC 환자에서 13C-콜산 등가물로 표현되는 hPULCFAs 446, 448 및 450의 농도의 분산 플로트, (b) (a)에서의 대응하는 분산 플로트에 기초한 ROC 분석. 회색 점선 라인은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. (C) 질병 단계에 의한 hPULCFAs의 평균 농도 등가물의 바 차트. 오차(error) 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다. (D) 질병 단계에 의한 ROC 분석.
도 7은 바이오마커 m/z 446에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 8은 바이오마커 m/z 448에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 9는 바이오마커 m/z 450에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 10은 바이오마커 m/z 464에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 11은 바이오마커 m/z 466에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 12는 바이오마커 m/z 468에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 13은 인간 혈청으로부터 hPULCFA가 풍부한 분획을 얻는 정제 공정이다. 혈청의 건조된 유기 추출물을 초기에는 물/아세토니트릴 단계 용매 구배를 이용하는 역상 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 반 정제된 hPULCFA 풍부한 분획(F9)을 얻었다. 수개의 F9를 헥산/클로로포름/메탄올 단계 용매 구배를 이용하는 정규 상 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의한 2차 정제 단계를 위하여 조합하여 hPULCFA가 매우 풍부한 분획 7(F7_2)을 얻었다.
도 14는 지방산과 역상 컬럼에서 혈청 추출물을 분획 후 얻어진 결장직장암 바이오마커의 혼합물을 함유하는 단계 I 분획 9(F9)의 LC/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 15는 CRC 바이오마커가 대략 65% 풍부한 단계 II 분획 7(F7)의 LC/MS 스펙트럼이다.
도 16은 비정제된 인간 혈청 추출물의 총 이온 크로마토그램(A); 모든 이온의 추출된 질량 스펙트럼(B); 및 440 내지 520 Da 사이의 이온의 추출된 질량 스펙트럼(C)이다.
도 17은 본 명세서에 기술된 풍부함 과정에 이어지는 인간 hPULCFA-음성 혈청 추출물의 총 이온 크로마토그램(A); 추출된 질량 스펙트럼(B)이다. 어떤 hPULCFAs도 존재하지 않는다.
도 18은 본 명세서에서 기술된 풍부함 과정(enrichment procedure)에 이어지는 인간 hPULCFA-양성 혈청 추출물의 총 이온크로마토그램(A); 추출된 질량 스펙트럼(B)이다. hPULCFAs는 440과 600Da 사이에 존재한다.
도 19는 48시간 동안 총 혈청 추출물(도 16에 나타난 바와 같은)의 다양한 투여양으로 처리된 SW620 결장 암(colon cancer) 세포의 세포 증식 분석이다.
도 20은 hPULCFA-풍부한 추출물로 처리된 세포의 브라이트 필드(bright field) 조사이다. MCF-7 세포를 hPULCFAs가 풍부한(hPULCFA + ve) 또는 hPULCFAs가 결핍된(hPULCFA -ve) 반-정제된 추출물 80㎍/ml, 비히클 또는 1μM 독소루비신으로 24시간 동안 처리하고, 도립 광 현미경으로 영상화 했다. 세포의 증대가 각 패널의 상부 왼쪽에 나타나있다. 세포 생존성 및 형태에 대한 유의적인 효과는 다른 처리에 비교해서 hPULCFA +ve 처리(하부 왼쪽)로 명백하다.
도 21은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 처리에 이은 카스파제-중재된 전세포자멸사적(pro-apoptotic) 폴리-ADP-리보스 폴리머라제(PARP) 절단 단편에 대한 MCF7 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 22는 80㎍/ml hPULCFA-양성, hPULCFA-음성, 및 비히클로 12, 24 및 48 시간 동안 처리에 이어지는 SW620 결장 암 세포의 세포 증식률을 나타낸다.
도 23은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)의 처리에 이은 카스파제-중재된 전세포자멸사적 폴리-ADP-리보스 폴리머라제(PARP) 절단 단편에 대한 SW620 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 24는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)의 처리에 이은 예비-염증 전사 인자 NFκB에 대한 SW620 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 25는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)의 처리에 이은 NFκB 음성 조절 단백질 IκBα에 대한 SW620 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 26은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)의 처리에 이은 유도성 산화 질소 신타제 (iNOS 또는 NOS2)에 대한 SW620 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 27은 그리스(Griess) 시약 시스템을 사용하여 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 SW620 세포를 처리하고 이어지는 조절된 배지에서 산화 질소 생성물의 인디케이터로서 아질산염의 수준을 나타낸다
도 28은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 기초한 상대적 TNFα mRNA 전사 수준을 나타낸다. 삼각형은 20, 40 및 80㎍/ml의 증가하는 투여량을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 29는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바, 상대적 TNFα 세포 용해물 단백질 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 30은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바 조절된 배지에서 상대적 TNFα 단백질 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 31은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 기초한 상대적 iNOS mRNA 전사 수준을 나타낸다. 삼각형은 20, 40 및 80㎍/ml의 증가하는 투여량을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 32는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 웨스턴 블로트에 의해 결정된바, 세포 용해물 내의 상대적 iNOS 단백질 수준을 나타낸다. ns, 비-특이적(non-specific).
도 33은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 조절된 배지에서 산화 질소 생성의 인디케이터로서 아질산염(nitrite)의 상대적 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 34는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 기초한 상대적 COX2 mRNA 전사 수준을 나타낸다. 삼각형은 20, 40 및 80㎍/ml의 증가하는 투여량을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 35는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 기초한 상대적 IL-1β mRNA 전사 수준을 나타낸다. 삼각형은 20, 40 및 80㎍/ml의 증가하는 투여량을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 36은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바, 세포 용해물에서 상대적 상대적 IL-1β 단백질 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 37은 다양한 농도의 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 의해 결정된바, 상대적 TNFα 전사 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 38은 0.5 및 1mM 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바, 조절된 배지에서 상대적 TNFα 단백질 수준을 나타낸다.
도 39는 다양한 농도의 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 의해 결정된바, 상대적 iNOS 전사 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 40은 다양한 농도의 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 처리에 이은 조절된 배지에서 산화 질소 생성의 인디케이터로서 아질산염의 상대적 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 41은 다양한 농도의 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바, 조절된 배지에서 상대적 IL-1β 단백질 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 42는 6개의 hPULCFAs에 대한 세라캐어 예비-처리된 NSAID 효과를 나타낸다.
도 43은 6개의 hPULCFAs에 대한 바이오서브(Bioserve) 처리-후 NSAID 효과를 나타낸다.
도 44는 LPS 유도에 이은 hPULCFA-양성 추출물에서 TNF-알파 수준의 감소를 나타낸다.
도 45는 hPULCF-양성 추출물에서 LPS-유도된 산화 질소 신타제(NOS2)의 감소를 나타낸다. 상부 구획: 웨스턴 블로팅 분석; 하부 구획: 폰세아우(Ponceau) S 염색된 겔.
도 46은 hPULCFA-양성 추출물로 처리된 세포의 조절된 배지에서의 아질산염수준의 투여량-의존성 감소를 나타낸다.
도 47은 화합물 2에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 48은 화합물 2에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 49는 화합물 3에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 50은 화합물 4에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 51은 화합물 5에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 52는 화합물 6에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 53은 화합물 7에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 54는 화합물 7에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 55는 화합물 7 에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 56은 단편 A에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 57은 단편 A에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 58은 단편 A에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 59는 화합물 9에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 60은 화합물 9에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 61은 화합물 9 에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 62는 단편 B에 대한 IR 흡수 스펙트럼이다.
도 63은 단편 B에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 64는 단편 B에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 65는 화합물 11에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 66은 화합물 11에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 67은 화합물 12에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 68은 화합물 12에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 69는 화합물 12에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 70은 화합물 13에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 71은 화합물 13에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 72는 화합물 13에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 73은 단편 C에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 74는 단편 C에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 75는 단편 C에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 76은 단편 C에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 77은 화합물 15에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 78은 화합물 15에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 79는 화합물 15에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 80은 화합물 16에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 81은 화합물 16에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 82는 화합물 16에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 83은 화합물 17에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 84는 화합물 17에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 85는 화합물 17에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 86은 화합물 18에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 87은 화합물 18에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 88은 화합물 18에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 89는 화합물 D046 -124(본 명세서에서는 또한 GVK-FFS-09-06-PHM이라 언급됨)에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 90은 화합물 D046 -124에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 1은 연구 설계이다. 이 연구는 세 개의 단계들을 포함하였다: 세 개의 독립적인 샘플 세트에서 FTICR-MS 대사체 발견(metabolomic), hPULCFAs와 같은 대사 바이오마커의 구조적 조사 및 결정, 및 삼중-사중극자(triple-quadrupole) MRM 표적 분석을 사용한 확인.
도 2는 세개의 독립적인 연구에서 CRC와 보통 환자 혈청 사이의 평균 샘플 피크 강도 배(fold) 변화의 분산 플롯이다. 모든 대상에 대한 샘플-특이적 피크는 대조군 집단의 평균에 대해 log2 정규화하고, 질량(Da)에 따라 플로팅했다. 비쌍 스튜던트 t-시험(레전드(legend) 참조)에 기초한 유의성에 따라 점들이 착색됐다. (a) GCI 발견 인구, (b) 세라케어(Seracare) 1 발견 집단, (c) 오사카 발견 집단. 회색으로 박스를 친 영역은 모든 세 개의 집단에서 대조군에 비해 CRC 환자에서 일치하게 감소된 440 내지 600Da에서의 질량의 덩어리를 나타낸다.
도 3은 질병 단계에 의한 대사물 446 및 448의 상대적 강도 및 각 발견 데이터세트에 대한 AUCs이다. (a) 각 샘플 세트에서 상대적 강도 대 질병 단계의 바 차트; (b) 대사물 446 및 448 경우 질병 단계와 대조군 사이의 P-값의 비교의 요약; (c) 각 발견 세트에서 마커 446 및 448 및 모든 CRCs 대 모든 대조군에 기초한 ROC 분석.
도 4는 정상적 대상 및 CRC 환자로부터의 혈청의 추출된 질량 스펙트럼이다. GCI 발견 세트로부터의 5개 대표적 CRC 및 5개 대조군 샘플로부터의 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거치게 하고 API 음성 방식으로 Applied Biosystems QSTAR XLTM 질량 분석기 상에서 완전-스캔 검출을 하였다. 16분 내지 18분 사이에 용출하는 질량 범위 100 내지 700 Da 내의 모든 이온의 평균 강도가 각 집단에 대해 나타나 있다. 박스를 친 영역은 정상적 환자에서는 존재하나 CRC-양성 혈청으로부터는 결여된 스펙트럼 특징을 나타낸다.
도 5는 세라캐어(Seracare) 2 확인 샘플 세트의 삼중-사중극자 MRM 분석의 결과이다. (a) 지각 증상이 없는 대조군, 및 예비-처리 CRC 환자에서 13C-콜산(13C-cholic acid) 등가물로 표현되는 hPULCFAs 446, 448 및 450의 농도의 분산 플로트, (b) (a)에서의 대응하는 분산 플로트에 기초한 ROC 분석. 회색 점선 라인은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. (c) 질병 단계에 의한 hPULCFAs의 평균 농도 등가물의 바 차트. 오차(error) 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다. (d) 질병 단계에 의한 ROC 분석.
도 6은 지바(Chiba) 확인 샘플 세트의 삼중-사중극자 MRM 분석의 결과이다. (a) 지각 증상이 없는 대조군, 및 예비-처리 CRC 환자에서 13C-콜산 등가물로 표현되는 hPULCFAs 446, 448 및 450의 농도의 분산 플로트, (b) (a)에서의 대응하는 분산 플로트에 기초한 ROC 분석. 회색 점선 라인은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. (C) 질병 단계에 의한 hPULCFAs의 평균 농도 등가물의 바 차트. 오차(error) 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다. (D) 질병 단계에 의한 ROC 분석.
도 7은 바이오마커 m/z 446에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 8은 바이오마커 m/z 448에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 9는 바이오마커 m/z 450에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 10은 바이오마커 m/z 464에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 11은 바이오마커 m/z 466에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 12는 바이오마커 m/z 468에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 13은 인간 혈청으로부터 hPULCFA가 풍부한 분획을 얻는 정제 공정이다. 혈청의 건조된 유기 추출물을 초기에는 물/아세토니트릴 단계 용매 구배를 이용하는 역상 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 반 정제된 hPULCFA 풍부한 분획(F9)을 얻었다. 수개의 F9를 헥산/클로로포름/메탄올 단계 용매 구배를 이용하는 정규 상 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의한 2차 정제 단계를 위하여 조합하여 hPULCFA가 매우 풍부한 분획 7(F7_2)을 얻었다.
도 14는 지방산과 역상 컬럼에서 혈청 추출물을 분획 후 얻어진 결장직장암 바이오마커의 혼합물을 함유하는 단계 I 분획 9(F9)의 LC/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 15는 CRC 바이오마커가 대략 65% 풍부한 단계 II 분획 7(F7)의 LC/MS 스펙트럼이다.
도 16은 비정제된 인간 혈청 추출물의 총 이온 크로마토그램(A); 모든 이온의 추출된 질량 스펙트럼(B); 및 440 내지 520 Da 사이의 이온의 추출된 질량 스펙트럼(C)이다.
도 17은 본 명세서에 기술된 풍부함 과정에 이어지는 인간 hPULCFA-음성 혈청 추출물의 총 이온 크로마토그램(A); 추출된 질량 스펙트럼(B)이다. 어떤 hPULCFAs도 존재하지 않는다.
도 18은 본 명세서에서 기술된 풍부함 과정(enrichment procedure)에 이어지는 인간 hPULCFA-양성 혈청 추출물의 총 이온크로마토그램(A); 추출된 질량 스펙트럼(B)이다. hPULCFAs는 440과 600Da 사이에 존재한다.
도 19는 48시간 동안 총 혈청 추출물(도 16에 나타난 바와 같은)의 다양한 투여양으로 처리된 SW620 결장 암(colon cancer) 세포의 세포 증식 분석이다.
도 20은 hPULCFA-풍부한 추출물로 처리된 세포의 브라이트 필드(bright field) 조사이다. MCF-7 세포를 hPULCFAs가 풍부한(hPULCFA + ve) 또는 hPULCFAs가 결핍된(hPULCFA -ve) 반-정제된 추출물 80㎍/ml, 비히클 또는 1μM 독소루비신으로 24시간 동안 처리하고, 도립 광 현미경으로 영상화 했다. 세포의 증대가 각 패널의 상부 왼쪽에 나타나있다. 세포 생존성 및 형태에 대한 유의적인 효과는 다른 처리에 비교해서 hPULCFA +ve 처리(하부 왼쪽)로 명백하다.
도 21은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 처리에 이은 카스파제-중재된 전세포자멸사적(pro-apoptotic) 폴리-ADP-리보스 폴리머라제(PARP) 절단 단편에 대한 MCF7 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 22는 80㎍/ml hPULCFA-양성, hPULCFA-음성, 및 비히클로 12, 24 및 48 시간 동안 처리에 이어지는 SW620 결장 암 세포의 세포 증식률을 나타낸다.
도 23은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)의 처리에 이은 카스파제-중재된 전세포자멸사적 폴리-ADP-리보스 폴리머라제(PARP) 절단 단편에 대한 SW620 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 24는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)의 처리에 이은 예비-염증 전사 인자 NFκB에 대한 SW620 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 25는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)의 처리에 이은 NFκB 음성 조절 단백질 IκBα에 대한 SW620 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 26은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)의 처리에 이은 유도성 산화 질소 신타제 (iNOS 또는 NOS2)에 대한 SW620 세포 용해물의 웨스턴(이뮤노블로트)이다.
도 27은 그리스(Griess) 시약 시스템을 사용하여 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 SW620 세포를 처리하고 이어지는 조절된 배지에서 산화 질소 생성물의 인디케이터로서 아질산염의 수준을 나타낸다
도 28은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 기초한 상대적 TNFα mRNA 전사 수준을 나타낸다. 삼각형은 20, 40 및 80㎍/ml의 증가하는 투여량을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 29는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바, 상대적 TNFα 세포 용해물 단백질 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 30은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바 조절된 배지에서 상대적 TNFα 단백질 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 31은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 기초한 상대적 iNOS mRNA 전사 수준을 나타낸다. 삼각형은 20, 40 및 80㎍/ml의 증가하는 투여량을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 32는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 웨스턴 블로트에 의해 결정된바, 세포 용해물 내의 상대적 iNOS 단백질 수준을 나타낸다. ns, 비-특이적(non-specific).
도 33은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 조절된 배지에서 산화 질소 생성의 인디케이터로서 아질산염(nitrite)의 상대적 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 34는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 기초한 상대적 COX2 mRNA 전사 수준을 나타낸다. 삼각형은 20, 40 및 80㎍/ml의 증가하는 투여량을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 35는 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 기초한 상대적 IL-1β mRNA 전사 수준을 나타낸다. 삼각형은 20, 40 및 80㎍/ml의 증가하는 투여량을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 36은 hPULCFA +ve 및 -ve 추출물(80㎍/ml)로 1㎍/ml LPS-자극된 RAW293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바, 세포 용해물에서 상대적 상대적 IL-1β 단백질 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 37은 다양한 농도의 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 의해 결정된바, 상대적 TNFα 전사 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 38은 0.5 및 1mM 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바, 조절된 배지에서 상대적 TNFα 단백질 수준을 나타낸다.
도 39는 다양한 농도의 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 정량적 리얼-타임 rtPCR에 의해 결정된바, 상대적 iNOS 전사 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 40은 다양한 농도의 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 처리에 이은 조절된 배지에서 산화 질소 생성의 인디케이터로서 아질산염의 상대적 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 41은 다양한 농도의 순수 합성 hPULCFA D046-124로 1㎍/ml LPS-자극된 RA W293 마크로파지 세포의 예비-처리에 이은 ELISA에 의해 결정된바, 조절된 배지에서 상대적 IL-1β 단백질 수준을 나타낸다. *p<0.05 대 +LPS 단독 처리.
도 42는 6개의 hPULCFAs에 대한 세라캐어 예비-처리된 NSAID 효과를 나타낸다.
도 43은 6개의 hPULCFAs에 대한 바이오서브(Bioserve) 처리-후 NSAID 효과를 나타낸다.
도 44는 LPS 유도에 이은 hPULCFA-양성 추출물에서 TNF-알파 수준의 감소를 나타낸다.
도 45는 hPULCF-양성 추출물에서 LPS-유도된 산화 질소 신타제(NOS2)의 감소를 나타낸다. 상부 구획: 웨스턴 블로팅 분석; 하부 구획: 폰세아우(Ponceau) S 염색된 겔.
도 46은 hPULCFA-양성 추출물로 처리된 세포의 조절된 배지에서의 아질산염수준의 투여량-의존성 감소를 나타낸다.
도 47은 화합물 2에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 48은 화합물 2에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 49는 화합물 3에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 50은 화합물 4에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 51은 화합물 5에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 52는 화합물 6에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 53은 화합물 7에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 54는 화합물 7에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 55는 화합물 7 에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 56은 단편 A에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 57은 단편 A에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 58은 단편 A에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 59는 화합물 9에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 60은 화합물 9에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 61은 화합물 9 에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 62는 단편 B에 대한 IR 흡수 스펙트럼이다.
도 63은 단편 B에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 64는 단편 B에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 65는 화합물 11에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 66은 화합물 11에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 67은 화합물 12에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 68은 화합물 12에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 69는 화합물 12에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 70은 화합물 13에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 71은 화합물 13에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 72는 화합물 13에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 73은 단편 C에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 74는 단편 C에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 75는 단편 C에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 76은 단편 C에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 77은 화합물 15에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 78은 화합물 15에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 79는 화합물 15에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 80은 화합물 16에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 81은 화합물 16에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 82는 화합물 16에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 83은 화합물 17에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 84는 화합물 17에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 85는 화합물 17에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 86은 화합물 18에 대한 NMR 스펙트럼이다.
도 87은 화합물 18에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 88은 화합물 18에 대한 MS 스펙트럼이다.
도 89는 화합물 D046 -124(본 명세서에서는 또한 GVK-FFS-09-06-PHM이라 언급됨)에 대한 LC 크로마토그래프이다.
도 90은 화합물 D046 -124에 대한 MS 스펙트럼이다.
지금까지, 결장직장암(colorectal cancer)(CRC)의 초기 위험을 검출할 정밀한 혈청 마커가 없었다. 이 필요를 해결하기 위하여, 질량 분석법-기초 발견 플랫폼이 치료-경험이 없는 CRC 환자의 혈청 대사체 내의 대사 바이오마커를 동정하기 위하여 사용되었다. "비-타겟" 접근은 신규 화합물을 검출하는 이 점을 갖고, 그러므로, 바이오마커-추진된 접근에 이상적으로 적합하였다. 질량 분석법-기초 발견 플랫폼의 사용은 삼중-사중극자 다중-반응-모니터링(TQ-MRM)에 기초한 정량적 진단 방법으로 쉽게 번역되는 부가된 이 점을 또한 갖는다.
바이오마커 발견은 퓨리에 변환 이온 사이클로트론 공진 질량 분석계(FTICR-MS)를 사용하여 수행하였다. 상이한 대륙으로부터의 세 개의 독립적인 집단으로부터의 CRC 환자 및 대조군의 포괄적인 대사 프로파일(USA 및 일본; 총 n=222)이 얻어졌고, 가장 좋은 상호-연구 바이오마커가 결정되었다. 이들 및 관련된 마커의 구조적 특성화가 MS/MS 및 NMR 기술을 사용하여 수행되었다. 상업적인 임상적 이용성 평가가 USA 및 일본으로부터의 두 개의 추가의 독립적인 집단(populations)(n=220)에서 세 개의 바이오마커에 대한 표적화 고-처리량 삼중-사중극자 MRM(TQ-MRM) 방법을 사용하여 수행되었다.
이들 포괄적인 대사체(metabolomic) 분석은 대조군과 관련하여 CRC 환자 샘플의 모두 세 개의 독립적인 집단(cohort)에서 C28-C36 히드록실화 다중불포화 초 긴-쇄 지방산(hPULCFAs)의 상당히 감소된 수준을 밝혀냈다. C28 분자에 대한 구조 밝힘 연구는 두 개의 히드록실 치환(446, 448 및 450)이나 세 개의 히드록실 치환(464, 466 및 468)을 품거나 불포화 정도를 다양화시키는 두 개의 집단(families)을 밝혀냈다. TQ-MRM 방법은 두 개의 추가의 독립적인 연구에서 FTM 결과를 성공적으로 재현시켰다. 총체적으로, 두 개의 대륙 지역의 5개의 독립적인 집단에서 두 개의 바이오마커를 평가하였다(세 개는 FTICR-MS에 의해 및 두 개는 TQ-MRM에 의해). 10개의 결과적인 수용체(receiver)-작동자(operator) 특성 곡선 AUGs가 0.85 내지 0.98(평균=0.91±0.04) 범위이었다.
이들 앞서 알려지지 않은 대사물의 전신(systemic) 대사 조절부전(dysfunction)은 CRC의 존재와 매우 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 대사물은 혈청과 같은 생물학적 샘플내에서 측정가능하였고, 그들의 농도에서의 감소는 인종 또는 지리학적 배경에 관계없이 CRC의 존재에 매우 민감하고 특이적이다. 그러므로, 이들 대사물의 측정은 CRC의 조기 검출 및 스크리닝을 위한 유용한 도구를 제공한다.
유용한 바이오마커인 것 외에, 본 명세서에 기술된 hPULCFAs는 세포 증식을 감소시키고, 세포자살(apoptosis)을 촉진하는데에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. hPULCFAs는 또한 NFκB, IκBα, NOS2, COX2, TNF-알파 및 SOD를 포함하는 일련의 염증 단백질을 사용한 조사를 통해, 및 조절된 세포의 배지 중의 아질산염 수준을 측정하여 입증된 바와 같이 항-염증 활성을 갖는다. 항-염증 활성은 또한 CRC 및 NSAIDs를 갖는 건강한 대상의 임상적 시험을 통해 입증되었고, 이에 의해, NSAIDs 사용은 결핍 대상에서 hPULCFAs 수준의 증가를 가져왔다.
모든 것을 함께 취했을 때, 본 발명자들은 하기에서 추가로 상세히 언급될 치료 및 진단 적용에서 기술된 hPULCFAs의 사용에 대해 넓은 범위의 지지를 제공했다.
따라서, 본 명세서에서, 식(I)에 따른 화합물이 제공된다:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다.
상기 식(I)에서, R은 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40을 포함하는, 24 내지 40개의 어떤 수의 C 원자를 함유하는 C24 - C40 직쇄 지방족 그룹을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 탄화수소 쇄는 C28 -C36 지방족 그룹, 특히 C28 지방족 그룹이다. 본 명세서에서 사용된바, 직쇄 지방족 그룹은 개방쇄 포화 탄화수소, 예를 들어 올레핀 또는 알케닐 그룹을 의미한다. 본 명세서에서 사용된바, 하이드록시 치환된은 화합물이 탄화수소 내의 하나 이상의 수소 원자 대신에 하나 이상의 히드록시 치환체를 가질 수 있다는 것을 의미한다.
상기 언급된 바와 같이, R의 탄화수소 내의 적어도 하나의 탄소는 히드록시(OH) 그룹으로 치환된다. 쇄 내의 OH 치환의 수는 지방 아실 쇄의 길이를 따라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 OH 치환을 포함하는, 1 내지 10의 어느 수일 수 있다. 그러나, 그에 대한 일부 실시형태에서 보다 적은 OH 치환체, 예를 들어 1 내지 4, 및 특히 2 또는 3개의 치환체인 것이 바람직할 수 있다. 아실 쇄의 길이를 따라 이들 OH 치환체의 위치는 탄소 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24에서, 또는 보다 긴 쇄일 경우 C25, C26, C27, C28, C29, C30, C31, C32, C33, C34, C35, C36, C37, C38, C39, C30, 및 이들의 조합을 포함하는 바와 같이 변할 수 있다.
상기 화합물에서 이중 결합의 수는 일반적으로 지방 아실 쇄의 길이에 의존하고, 따라서, C 원자의 수에 의해 제한된다. 따라서, 이중 결합의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 수 있고, 보다 바람직하게는 3 내지 6개의 이중 결합이 아실 쇄의 길이를 따라 다양하게 위치된다.
상기 화합물은 천연 자원으로부터 분리될 수 있거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 화합물은 생물-공학 접근을 통해, 예를 들어 화합물을 합성하는데에 요구되는 대사 효소를 함유하는 유전적으로 조작된 박테리아 또는 포유동물 세포 배양물(또는 바이오반응기)을 사용하여 생성될 수 있다.
기술된 화합물은 또한 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 또는 약제학적 조합물의 일부로서 하나 이상의 별개의 활성제 또는 약물과 함께 약제학적 조성물 내에 제공될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 별개로 또는 조합된 제제 또는 조합물로 다른 약물 또는 약제학적 조성물과 함께 치료 계획으로 투여될 수 있다.
식(I)의 화합물의 조합물이 본 명세서에 또한 제공된다. 이러한 조합물은 조합물 또는 혼합물 내의 다양한 화합물의 시너지 또는 첨가 효과에 기인하여 매우 유용할 수 있다.
또한, 식(I)의 화합물 또는 이를 포함하는 조합물이 보충제, 식품성 의약(neutraceuticals)으로서 제조되거나, 제조되어 건강 이익을 갖는 기능성 식품에 들어갈 수 있다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 필요로 하는 대상, 바람직하게는 인간에 투여하기 위해 약제학적으로 허용되는 비히클(vehicle)과 함께 제형화된다. 이러한 조성물용의 제형화 방법은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 표준 참고 텍스트, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985]에 교시되어 있다. 본 발명의 조성물은 단일 화합물 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 제 2 약물 또는 시약과 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명에서 유용한 것으로 예상되는 제제, 예를 들어 정맥내 제제를 포함하는 주사가능한(injectable) 제제는 제한되는 것은 아니지만 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에, 조성물은 멸균성이고, 쉬운 시린져빌리티(syringability)가 존재할 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건에서 안정해야 되고, 박테리아 및 균류(fungi)와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보전되어야 한다. 비히클은 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜등), 이들의 적절한 혼합물, 및 오일(예, 식물유)을 함유하는 용매 또는 분산액 매체일 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 원하는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항균류제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티머로잘 등에 의해 달성될 수 있다. 일부 경우에, 조성물 내에 등장화제, 예를 들어 슈가, 염화 나트륨, 또는 폴리알코올, 예를 들어 만니톨 및 소르비톨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 장기간(prolonged) 흡수가 조성물 내에 흡수를 지연하는 시약, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 포함하여 이뤄질 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 본 발명의 조성물을 요구되어 지는 대로 상기 열거된 성분들의 하나 또는 조합을 갖는 적절한 용매 중에 요구되는 양으로 혼입하고, 필터 멸균에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기초 분산액 매체 및 상기 열거된 성분들로부터의 요구되는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 본 발명의 조성물을 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조의 바람직한 방법은, 임의로 앞서 멸균-여과된 그의 용액으로부터의 어느 부가적인 원하는 성분을 더하여, 본 발명의 화합물의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조이다.
본 발명의 화합물의 경구 투여용 고체 투여 형태는 제한되는 것은 아니지만 삼킬 수 있는 캡슐, 정제, 환약(pills), 롤리팝(lollipops), 분말, 과립, 엘릭서르(elixirs), 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 혀밑 또는 구강 정제, 트로치(troches) 등을 포함한다. 이러한 고체 투여 형태에서, 화합물은 적어도 하나의 불활성, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제 또는 소화흡수되는 식용성 담체, 예를 들어 나트륨 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트 및/또는 a) 충전제 또는 증량제(extenders), 예를 들어 전분, 락토즈, 슈크로즈, 글루코즈, 만니톨, 및 규산(silicic acid), b) 결합제, 예를 들어, 카복시메틸셀룰로즈, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 슈크로즈,및 아카시아, c) 휴멕턴트(humectants), 예를 들어, 글리세롤, d) 붕해제, 예를 들어 아가-아가, 탄산 칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정한 실리케이트, 및 탄산 나트륨, e) 파라핀과 같은 용액 지연제, f) 흡수 촉진제, 예를 들어 4급 암모늄 화합물, g) 습윤제(wetting agents), 예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트, h) 흡수제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트 점토, 및 i) 윤활제, 예를 들어 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 이들의 혼합물과 혼합되거나 대상 음식에 직접 혼입된다. 캡슐, 정제 및 환약 경우에, 투여 형태는 완충제를 또한 포함할 수 있다. 유사한 형태의 고체 조성물은 락토즈 또는 밀크 슈가 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로 이용될 수 있다. 조성물 및 제제 중의 본 발명의 화합물의 퍼센트는 물론 변할 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 중의 화합물의 양은 적절한 투여량이 얻어지는 정도이다.
정제, 드라제, 캡슐, 환약, 및 과립의 고체 투여 형태는 코팅 및 껍질, 예를 들어 장용성 코팅 및 약제학적 제형화 분야에서 잘-알려진 다른 코팅과 함께 제조될 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 함유할 수 있고, 또한 본 발명의 화합물을, 오직 또는 바람직하게는 장 관(intestinal tract)의 특정 부분에서, 임의로 지연된 방법으로 방출하는 조성물 형태일 수 있다. 이용될 수 있는 조성물을 묻는(embedding) 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 조성물은 또한 적절하다면 하나 이상의 상기 언급된 부형제와 함께 마이크로-캡슐화된 형태일 수 있다.
경구 투여용 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서르를 포함한다. 본 발명의 화합물 외에, 액체 투여 형태는 본 분야에서 흔히 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물 또는 다른 용매, 용해제 및 유화제, 예를 들어 에틸 아코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아마이드, 오일(특히, 목화씨유, 땅콩 옥수수유, 점 올리브(germ olive) 유, 캐스터 유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제외에, 경구 조성물은 또한 보조제, 예를 들어 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 풍미제(flavoring agents), 및 방향제(perfuming agents)를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물 외에, 현탁제는 현탁화제, 예를들어, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정성 셀룰로즈, 알루미늄 메타히드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가, 및 트라가칸트, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 질병을 치료 및/또는 예방하기 위하여 대상, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 조성물은 제한되는 것은 아니지만 경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 국소적으로(topically), 피하, 직장, 진피, 혀밑, 구강내, 비강내 또는 흡입을 포함하는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여의 제제 및 경로뿐만 아니라 투여의 투여량 및 빈도는 치료하려는 증상의 심각성뿐만 아니라 환자-특이적 인자, 예를 들어 연령, 체중 등에 기초하여 본 분야에 숙련된 자에 의해 일상적으로 선택될 수 있다.
본 분야에 숙련된 자는 문헌[Mordenti, Man versus Beast: Pharmacokinetic Scaling in Mammals, 1028, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 75, No. 11, November 1986]에 언급된 바와 같이, 종간 약동역학 스캐일링(scaling)이 종간 약물 성질(disposition)에서 근저를 이루는 유사성(및 차이)을 연구하기 위하여, 시험되지 않은 종에서의 약물 성질을 예견하기 위하여, 다양한 종에서의 약동역학 동등성을 한정하기 위하여, 및 실험 동물 모델을 위한 투여 계획을 설계하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 인식한다.
상기 화합물 및 조성물을 염증 및 염증-관련된 질환, 예를 들어, 암의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 식(I)의 화합물 또는 이러한 화합물을 포함하는 조성물이 CRC를 갖는 것으로 진단된 또는 CRC를 갖는 것으로 의심되는 대상에게 질병을 치료, 예방 또는 경감하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 식(I)의 화합물은 또한 다른 비-악성 GI 질환, 예를 들어 IBD, 크론병, 및 대장염을 치료하거나 예방하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 화합물 및 조성물은 예를 들어 염증 및 염증-관련된 질환, 예를 들어 암을 예방하는 계획에서 대상에게 식(I)의 화합물을 투여하여 예방적 방법에서 또한 유용할 수 있다.
상기 화합물 및 조성물은 또한 hPULCFA 결핍 질환(hPDD)라고 언급되는 hPULCFAs를 결핍하는 대상의 확인 및 진단 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 대상은 상승된 염증 위험, 급성 염증을 충분히 사그라지게 하는 능력이 없는 위험, 및/또는 염증 관련된 질병 상태를 가질 수 있다. 유사하게, 상기 화합물 및 조성물은 또한 대상에서 hPDD를 치료하는데에 사용될 수 있고, 이에 의해 식(I)의 화합물 및 이 화합물을 포함하는 조성물을 대상에서 hPPD를 개선하는데에 충분한 양으로 투여된다.
식(I)의 하나 이상의 화합물을 염증의 마커로서, 및 항-염증 약물의 효과를 모니터링하기 위하여 또한 사용할 수 있다.
상기 방법에서 사용되는 생물학적 샘플은 신체 내 어느 곳, 예를 들어 제한되는 것은 아니지만, 혈액(혈청/혈장), 척수액(CSF), 소변, 대변, 숨(breath), 침saliva), 또는 종양, 인접한 정상 평활 및 골격 근, 지방 조직, 간, 피부, 머리칼, 뇌, 신장, 췌장, 폐, 결장(colon), 위, 또는 다른 것을 포함하는 어느 고체 조직의 생검으로부터 유래할 수 있다. 특히 관심 있는 것은 혈청 또는 CSF인 샘플이다. 용어 "혈청"이 본 명세서에서 사용되지만, 본 분야에 숙련된 자는 혈장 또는 전혈(whole blood) 또는 전혈의 서브-분획이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
혈액 샘플이 환자에게서 뽑아낼 때, 샘플이 가공될 수 있는 수개의 방법이 있다. 가공의 범위는 전혀 가공되지 않거나(즉, 냉동된 전혈), 특별한 세포 타입의 분리처럼 복잡할 수 있다. 가장 흔한 일상적 과정은 전혈으로부터의 혈청 또는 혈장의 제조를 포함한다. 고체-상 지지체, 예를 들어 여과 페이퍼 또는 다른 고정성 물질에 혈액 샘플을 스포팅하는 것을 포함하는 모든 혈액 샘플 가공 방법 또한 본 발명에 의해 고려된다.
상기 기술된 가공된 혈액 샘플은 이어서 추가로 가공되어 가공된 혈청 샘플 내에 함유된 생화학 물질의 검출 및 측정에 이용되는 방법론적인 분석 기술과 적합하게 된다. 가공의 타입은 어떤 추가의 가공이 없는 것과 같이 거의 없거나 구별 추출 및 화학적 유도체화와 같이 복잡할 수 있다. 추출 방법은 초음파처리, 속스렛 추출(soxhlet extraction), 마이크로파 도움을 받은 추출(MAE), 초임계 유체 추출(SFE), 가속화된 용매 추출(ASE), 가압된 액체 추출(PLE), 가압된 열 수 추출(PHWE) 및/또는 메탄올, 에탄올, 알코올과 물의 혼합물, 또는 에틸 아세테이트 또는 헥산과 같은 유기 용매와 같은 흔한 용매 중에서의 계면활성제 도움받은 추출(PHWE)을 포함할 수 있다. HTS 분석을 위한 대사물의 바람직한 추출 방법은 액체/액체 추출에 의해 수행하고, 이에 의해 비-극성 대사물이 유기 용매에 용해되고, 극성 대사물은 수성 용매에 용해된다.
샘플을 분해하는 단계는 질량 분석기(MS)를 이용하여 샘플을 분석하는 것을 포함한다. 예를 들어, 제한하려 함이 없이, 이러한 질량 분석기는 FTMS, 오비트랩, 비행시간(TOP) 또는 사중극자 타입일 수 있다. 달리는, 질량 분석기는 추가의 예비-검출기 질량 필터가 장착될 수 있다. 예를 들어, 제한하려 함이 없이, 이러한 기구는 흔히 사중극자-FTMS(Q-FTMS), 사중극자-TOP(Q-TOF) 또는 삼중 사중극자(TQ 또는 QQQ)라고 언급된다. 또한, 질량 분석기는, n>=2일 경우, 모 이온 검출 방식(MS) 또는 MSn 방식으로 작동될 수 있다. MSn 방식은 모 이온이 충돌 유도된 분리(CID) 또는 다른 단편화 과정에 의해 단편화되어 단편 이온을 생성하고, 하나 이상의 상기 단편이 질량 분석기에 의해 검출되는 상황을 언급한다. 이어서, 이러한 단편들은 추가로 단편화되어 추가의 단편들을 생성할 수 있다. 달리는, 샘플은 액체 또는 가스 크로마토그래피 시스템을 사용하여 또는 직접 주입하여 질량 분석기에 도입될 수 있다.
추출된 샘플은 본 분야에 공지된 어느 적절한 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 어느 방법에서도 제한하려 함이 없이, 생물학적 샘플의 추출물은 직접 주사에 의해 또는 크로마토그래피 분리를 따라, 본질적으로 어느 질량 분석 플랫폼상에서 분석할 수 있다. 전형적인 질량 분석기는 샘플 내의 분자를 이온화시키는 공급원(source), 및 이온화된 분자 또는 분자의 단편들을 검출하기 위한 검출기로 구성된다. 흔한 공급원의 비-제한적인 실시예는 전자 충격, 전자분무이온화(ESI), 대기압 화학 이온화(APCI), 대기압 광 이온화(APPI), 매트릭스 도움받은 레이져 탈착 이온화(MALDI), 표면 향상된 레이져 탈착 이온화(SELDI), 및 그들의 유도물(derivations)을 포함한다. 흔한 질량 분리 및 검출 시스템은 사중극자, 사중극자 이온 트랩, 선형 이온 트랩, 비행 시간(TOF), 자기 섹터, 이온 사이클로트론(FTMS), 오비트랩, 및 그들의 유도물 및 조합물을 포함할 수 있다. 다른 MS-기초 플랫폼상의 FTMS의 이 점은 많은 경우 저 해상(resolution) 기구에 의해 놓치는 오직 수백 달톤에 의해 차이가 나는 대사물의 분리를 허용하는 고 해상 능력이다.
용어 "대사물"은 수준 또는 강도가 샘플 내에서 측정되고, 질병 상태를 진단하는 마커로서 사용될 수 있는 특정한 작은 분자를 의미한다. 이들 작은 분자는 본 명세서에서 "대사물 마커", 또는 "대사물 성분", 바이오마커", 또는 "생화학적 마커"로 언급될 수 있다.
대사물은 일반적으로 상기 방법에서 사용된 질량 분석 기술에 의해 측정된바 그들의 정밀한 질량에 의해 특징 지워진다. 정밀한 질량은 또한 "정밀한 중성 질량" 또는 "중성 질량"으로 언급될 수 있다. 대사물의 정밀한 질량은 본 명세서에서 달톤(Da)으로 그에 대해 실질적으로 동등한 질량으로 주어진다. "그에 대해 실질적으로 동등한"은 정밀한 질량에서 +/- 5ppm 차이는 본 분야에 숙련된 자에 의해 인식되는 바와 같이 같은 대사물을 나타낸다. 정밀한 질량은 중성 대사물의 질량으로 주어진다. 본 분야에 숙련된 자에 의해 인식되는 바와 같이, 샘플의 분석 동안 생기는 대사물의 이온화는 하나 이상의 수소 원자의 손실 또는 이득 및 전자의 손실 또는 이득을 일으킬 것이다. 이는 정밀한 대사물을 "이온화된 질량"으로 변화시키며, 이 이온화된 질량은 정밀한 질량과 이온화 동안 수소 질량(다른 부가물, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모니아, 및 본 분야에 알려진 다른 것) 및 전자 질량 손실 및 수득에 의해 차이가 난다. 달리 특정화되지 않으면, 정밀한 중성 질량이 본 명세서에서 언급될 것이다.
유사하게, 대사물이 분자 식에 의해 기술될 때, 중성 대사물의 분자식이 주어질 것이다. 자연적으로, 이온화된 대사물의 분자식은 이온화 동안 손실되거나 얻어진 수소(또는 다른 부가물, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모니아, 및 본 분야에 알려진 다른 것들)의 수에 의해 중성 분자식과 다를 것이다.
데이터는 분석 동안 수집되며, 하나 이상의 대사물에 대한 정량화 데이터가 얻어진다. "정량화 데이터"는 샘플 내에 존재하는 특정 대사물의 수준 및 강도를 측정하여 얻어진다.
정량화 데이터는 하나 이상의 참조 샘플로부터의 대응하는 데이터에 비교하여 비교된다. "참조 샘플"은 특별한 질병 상태 또는 증상에 대해 어느 적절한 참조 샘플이다. 본 분야에 숙련된 자에 의해 이해되는 바와 같이, 하나 이상의 참조 샘플이 정량화 데이터에 대한 비교를 위해 사용될 수 있다.
샘플을 분석하는 단계는 상기 기술된 바와 같을 수 있다. 상기 하나 이상의 참조 샘플은 대조군 개인으로부터 얻어진 제 1 참조 샘플일 수 있다. "내부 대조군 대사물(metabolite)"은 대상 또는 환자에 자연적으로 존재하는 내생 대사물을 언급한다. 질병 상태 또는 증상 동안에 걸쳐 변하지 않는 어느 적절한 내생 대사물은 내부 대조군 대사물로 사용될 수 있다.
대사물 마커 대 내부 대조군 대사물의 비의 사용은 본 명세서에서 기술된 방법의 특정한 실시형태에서 대사물 마커의 절대적인 수준의 측정보다 안정하고 재현가능한 측정을 제공한다. 내부 대조군 대사물이 모든 샘플에 자연적으로 존재하고, 질량 상태에 걸쳐 상당하게 변하는 것으로 나타나지 않기 때문에, 샘플-대-샘플 변화성(핸들링, 추출 등에 기인하여)은 최소화된다.
정의
용어 "유효량"은 예를 들어 연구자 또는 임상의에 의해 구하고자 하는 조직, 계(system), 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도해 내는 화합물, 약물 또는 약제학적 제제의 양을 의미한다. 더욱이, "치료적 유효량"은 이러한 양을 투여받지 않은 대응하는 대상에 비교하여 개선된 치료, 치유, 예방, 또는 질병, 질환, 또는 부작용의 개선, 또는 질병 또는 질환에서 진전 속도에서의 감소를 가져오는 어느 양을 의미한다. 상기 용어는 또한 그의 범주 내에 정상적 생리 기능을 향상시키는데 효과적인 양들을 의미한다.
"히드록실" 및 "히드록시"는 --OH를 언급한다.
"약제학적 제제" 또는 "약물"은 대상에 적절히 투여되었을 때 원하는 치료 또는 예방 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 언급한다.
모든 화학적 화합물은 (+) 및 (-) 입체이성체 모두뿐만 아니라 (+) 또는 (-) 입체이성체 어느 하나를 포함한다.
본 명세서의 다른 화학적 용어는 문헌[The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1985)] 및 문헌[The Condenced Chemical Dictionary(1981)]에 예시된 바와 같이 본 분야에서의 통상적인 사용에 따라 사용된다.
본 발명은 하기 실시예들에서 추가로 예시된다.
실시예들
1. CRC 환자에서 hPULCFAs 의 감소된 혈청 수준
재료 및 방법
환자 샘플 선택
제 1 발견 프로젝트를 위해 사용된 임상적 샘플은 Genomics Collaborative, Inc.(GCI)로부터 수득하였고, 한편 제 2 발견 프로젝트 및 하나의 확인 프로젝트를 위한 샘플은 Seracare Lifesciences로부터 입수하였다. 이들 회사는 특히 연구 목적의 혈청 및 조직 샘플의 수집 및 저장에 전문적이다. 샘플은 표준화된 프로토콜 및 작업 과정을 이용하는 세계적인 창시의 일부로서 외과 의사들 팀에 의해 일치하는 방법으로 수집, 가공 및 저장되었다. 모든 샘플은 적절히 동의 되었고, 임상적 프로토콜은 윤리 검토 국에 의해 승인되었다. 발견 및 확인 집단을 위한 GCI 및 세라캐어(Seracare) 바이오뱅크로부터의 환자 샘플 선택을 위한 포함 기준은 수술, 화학 또는 방사선 치료를 포함하는 어떤 형태의 치료 전 혈청이 취해져야 한다는 것이었다. 모든 샘플은 GCI 및 세라캐어에서 공인된 병리학자에 의해 독립적으로 입증된 상세한 병리학 보고서가 동반되었다. GCI 발견 샘플 세트는 40명의 예비-처리 CRC 환자 및 50명의 대조군으로부터의 혈청 샘플을 포함하고, 세라캐어 발견 세트는 26명의 예비-처리 CRC 및 25명의 대조군으로부터의 샘플을 포함하며, 확인 세라캐어 세트는 70명의 예비처리 CRC 및 70명의 대조군을 포함하였다. 오사카 의학 대학교(Osaka Medical University)에 의해 제공된 발견 샘플은 위원회의 표준 수집 프로토콜에 따라 가망성 있게 수집된 46명의 예비-수술 CRC 환자 및 35명의 대조군을 포함하고, 정당하게 동의 되었다. 40명의 예비-수술 CRC 환자 및 40명의 대조군을 포함한, 지바(Chiba) 일본 확인 집단(population)용 샘플을 윤리 검토된 프로토콜 및 정당한 동의하에 가망성 있게 수집되었다. 질병 스테이징(staging)을 포함하는 집단의 요약은 표 1에 나타나 있다. 모든 샘플은 무작위 방법으로 가공 및 분석되었고, 결과는 다음 분석을 언블라인드하였다(unblinded).
표 1: 본 연구에서 사용된 케이스-대조군 모집단의 요약
샘플 추출
혈청 샘플을 분석을 위해 녹이기까지 -80℃에서 저장하고, 오직 한번 녹였다. 모든 추출은 얼음 위에서 수행하였다. 혈청 샘플을 먼저 순서적으로 동등한 부피의 혈청을 1% 수산화 암모늄 및 에틸 아세테이트(EtOAc)로 3회 추출하여 FTICR-MS 분석을 위해 제조하였다. 샘플을 3500 rpm에서 4℃에서 10분간 추출들 사이에 원심분리하고, 유기층을 제거하며, 새로운 튜브에 옮겼다(추출물 A). 제3 EtOAc 추출후, 0.33% 포름산을 첨가하고, 두번 더 EtOAc 추출을 하였다. 최종 유기 추출 후, 나머지는 수성 성분을 추가로 물로 2회 추출하고, 단백질을 3:1 아세토니트릴로 침전시켜 제거하였다(추출물 B). 이어서 EtOAc 대 부탄올(BuOH)의 1:5 비를 질소하에서 증발시켜 최초의 BuOH 출발 부피로 만들었다(추출물 C). 모든 추출물을 FTICR-MS 분석까지 -80℃에서 저장하였다.
FTICR
-
MS
분석
샘플 추출물(분획 C)을 음성 ESI를 위해, 메탄올:0.1%(v/v)수산화 암모늄(50:50, v/v) 중에서 10배 희석시켰다. APCI를 위하여 분획 A 샘플 추출물들을 희석 없이 직접적으로 주입하였다. 모든 샘플은 7.0 활성적으로 차폐된 초전도성 자극이 장착된 Brucker Daltonics APEX III FTICR-MS(Brucker Daltonics, Billerica, MA) 상에서 수행하였다. 샘플들을 ESI 및 APCI를 사용하여 시간당 600μL의 유동 속도로 직접적으로 주입하였다. 이온 전달/검출 파라미터를 세린, 테트라-알라닌, 레세르핀, 휴렛-패커드 튜닝 혼합물(mix) 및 부신피질자극 호르몬 단편 4-10의 표준 혼합물을 사용하여 최적화하였다. 또한, 장치 조건들을 장치 제조자의 권유에 따라 100-1000 amu의 질량 범위에 걸쳐 이온 강도 및 넓은-밴드 축적을 최적화하도록 튜닝하였다(turned). 상기 언급된 표준물의 혼합물을 100-1000 amu의 취득 범위에 걸쳐 질량 정밀도에 대해 각 샘플 스펙트럼을 내부적으로 캘리브레이트(calibrate)하는데에 사용하였다. FTICR 데이터를 선형 최소-제곱 회기선을 사용하여 분석하고, 질량 축 값을 각 내부 표준 질량 피크가 이론적 질량과 비교하여 < 1 PPM의 질량 에러를 갖도록 캘리브레이션하였다. Brucker Daltonics Inc,로부터의 XMASSTM 소프트웨어를 사용하여, 1 메가 워드의 데이터 파일 크기를 획득하고, 두 메가워드로 제로-필링하였다(zero-filled). SINm 데이터 변환을 퓨리에 변환 및 크기 계산하기 전에 수행하였다. 각 분석으로부터의 질량 스펙트럼을 통합하여 정밀한 질량 및 각 피크의 절대 강도를 함유한 피크 목록을 만들었다. 100-1000 m/z의 범위 내의 화합물들을 분석하였다. 상이한 이온화 모드 및 극성에 걸쳐 데이터를 비교하고 요약하기 위하여, 모든 검출된 질량 피크를, 수소 부가물 형성을 가정하면서, 그들의 대응하는 중성 질량으로 전환시켰다. 이어서 자가-발생된 이차원(질량 대 샘플 강도) 어레이를 DISCOV AmetricsTM 소프트웨어(Phenomenomic Discoveries Inc., Saskatoon, SK, Canada)를 사용하여 만들었다. 다중 파일로부터의 데이터를 통합하고, 이 결합된 파일을 가공하여 모든 유일한 질량들을 결정하였다. 각 유일한 질량의 평균을 결정하여, y-축을 나타냈다. 분석하기 위하여 최초로 선택된 각 파일에 대한 컬럼을 만들어 x-축을 나타내었다. 이어서 선택된 각 파일에서 발견되는 각 질량에 대한 강도를 그의 대표적인 x,y 좌표에 채웠다(filled). 강도 값을 함유하지 않는 좌표들은 빈칸으로 남겨두었다. 각 스펙트럼을 피크-골라잡아 검출된 모든 대사물의 질량 및 강도를 얻었다. 모든 모드로부터의 데이터를 이어서 합쳐서 샘플당 하나의 데이터 파일을 만들었다. 이어서 모든 90개의 발견 혈청 샘플로부터의 데이터를 합쳐서 정렬하여 이차원적 대사물 어레이를 만들고, 이 어레이에서 각 샘플은 열(column)에 의해 나타내지며, 각 유일한 대사물은 단일 행에 의해 나타내지고, 어레이에서 각 셀은 주어진 샘플 경우의 대사물 강도에 대응한다. 이어서 어레이 표들을 "통계학적 분석"에서 기술된 통계학적 분석을 위해 사용하였다.
완전-스캔 Q-
TOF
및
HPLC
-연결된 탠덤(
tandem
) 질량 분석
5개 CRC 및 5개 정상 샘플로부터의 에틸 아세테이트 추출물을 질소 가스 하에서 증발시키고 70 μL의 이소프로판올:메탄올:포름산 (10:90:0.1)중에서 재구성했다. 10 μL의 재구성된 샘플은 완전 스캔을 위하여 HPLC(HP 1100 with HypersilTM ODS 5 ㎛, 125 x 4 mm column, Agilent Technologies)를 거치게 하고, 30 μL는 1ml/분의 유동 속에서 MS/MS를 위하여 HPLC를 거치게 하였다. HPLC로부터의 용출물은 음성 방식으로 APCI 공급원이 장착된 ABI QSTAR® XL 질량 분석기를 사용하여 분석하였다. 완전 스캔 모드에서 스캔 타입은 1.0000 초의 축적 시간, 50 내지 1500 Da의 질량 범위, 및 55분의 지속 시간을 갖는 비행 시간(time-of-flight)(TOF)이었다. 공급원 파라미터는 다음과 같다: 이온 공급원 가스 1(GS1) 80; 이온 공급원 가스 2(GS2) 10; 커튼(Curtain) 가스(CUR) 30; 분무기 전류(Nebulizer Current)(NC) -3.0; 온도 400℃; 디클루스터링 전위(Declustering Potential)(DP) -60; 포커싱 전위(Focusing Potential(FP) -265; 디클루스터링 전위 2(DP2) -15. MS/MS 모드에서, 스캔 타입은 생성물 이온이고, 축적 시간은 1.0000 초이며, 스캔은 50 내지 650 Da이고, 지속 시간은 55 분이다. 모든 공급원 파라미터는 상기와 같고, 충돌 에너지(CE)는 -35V이며, 충돌 가스(CID, 질소)는 5 psi이다. MS3 작업(work)시, 여기 에너지는 180V에 세팅되었다.
CRC 바이오마커의 예비적 분리 및 NMR 분석
박층 크로마토그래피 방법 경우, 모든 화학 물질 및 매체는 Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON으로부터 구입하였다. 모든 용매는 HPLC 등급이었다. 분석 TLC는 예비-코팅된 실리카 겔 TLC 알루미늄 시트(EM science, Kiesegel 60 F254, 5 x 2 cm x 0.2 mm) 상에서 수행되었다. 화합물들은 UV 광(254/366nm)하에서 또는 요오드 증기 탱크 안에 위치시키고 플레이트들을 1%(w/v) 황산 세륨(ceric sulfate) 및 4% (v/v) H2SO4를 함유하는 5% 수성(w/v) 포스포몰리브드 산 용액에 침지시키고, 이어서 가열하여 시각화시켰다. NMR 스펙트럼은 Bruker Avance spectrometer상에 기록하였고; 1H(500 MHz)경우, δ값들이 CDCl3(7.24 ppm에서 CHCl3)에 참조되었고, 13C NMR(125.8 MHz)은 CDCl3(77.23 ppm)에 대해 참조 되었다.
시판 혈청의 에틸 아세테이트 추출물(180 mL 혈청, 500 mg 추출물)을 단계 구배 용출; 아세토니트릴-물 25:75 내지 100% 아세토니트릴과 함께 역상 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 거쳤다. 수집된 분획들을 LC/MS 및 MS/MS에 의해 분석하였다. CRC 바이오마커를 함유하는 분획들을 모았다(12.5 mg). 이 과정을 수차례 반복하여 약 60 mg의 CRC 바이오마커 풍부 분획을 얻었다. 이어서, 이 조합된 샘플을 단계 구배 용출;헥산-클로로포름-메탄올로 FCC를 거치게 하고, 모아진 분획들을 LC/MS 및 MS/MS 분석을 거치게 하였다. 바이오마커 풍부 분획 표지된 샘플 A(5.4 mg, 약 65%)를 NMR에 의해 분석하였다. 이어서 샘플 A(3 mg)를 과량의 에테르 함유 디아조메탄으로 처리하고 실온에서 밤새 유지하였다. 용매를 제거후, 샘플을 NMR에 의해 분석하였다.
삼중-사중극자 다중-반응-모니터링(TQ-MRM) 방법
추출 전 혈청에 10 ㎍/ml[13C1] 콜산을 첨가하면서 비-표적화된 FTICR-MS 분석에 대해 기술된 바와 같이 추출하여 36 nM의 [13C1] 콜산의 최종 에틸 아세테이트 농축물을 얻었다. 에틸 아세테이트 유기 분획을 각 샘플의 분석을 위해 사용하였다. 란독스(Randox) 혈청 추출물로부터 에틸 아세테이트 중의 일련의 [13C1] 콜산 희석액을 사용하여 0.00022㎍/ml 내지 0.222 ㎍/ml 범위의 표준 곡선을 만들었다. 100㎕의 샘플을 유동-주사 분석에 의해 APCI 프로브를 가진 TurboVTM이 장착된 4000QTRAPTM으로 주입하였다. 담체 용매는 90% 메탄올:10% 에틸 아세테이트이었고, APCI 공급원으로 360 ㎕/분의 유동 속도로 주입되었다. 공급원 가스 파라미터는 다음과 같다: CUR:10.0, CAD:6, NC:-3.0, TEM:400, GSI:15, 계면 히터 온(interface heater on). "화합물" 세팅은 다음과 같았다:진입 전위(EP): -10, 및 충돌 셀 배출 전위(CXP): -20.0. 방법은 C28 분자(445.3-383.4 Da, 447.4-385.4 Da, 및 449.4-405.4 Da)의 각각에 대한 하나의 모 이온 전이, 및 내부 표준물(408.3-343.4 Da)에 대한 단일 전이의 다중 반응 모니터링(MRM)에 기초한다. 전이의 각각을 2.3 초의 총 사이클 시간 동안 250 ms에 대해 모니터링 하였다. 샘플당 총 획득 시간은 대략 1 분이었다. 모든 받아들여진 분석은 >0.98의 선형 회귀 등식에 대해 R2 상관계수를 보였다. 세개 C28 분자의 각각에 대한 [13C1]콜산 등가물을 익스트러폴레이트된(extrapolated) 농도를 0.0148 ㎍/ml(36nM, 각 샘플의 에틸 아세테이트 추출물 중에 존재하는 이론치 양)로 나누어 각 샘플에서 [13C1] 콜산의 회수 퍼센트를 결정하여 계산하였다. [13C1]콜산 등가물로 나타내진 대사물 농도는 이어서 익스트러폴레이트되고, 회수 퍼센트로 나누어 정규화시키고, 적절한 추출 희석 인자로 곱하여 최종 혈청 농도를 얻었다.
통계학적 분석
FTICR-MS 정밀 질량 어레이 배열을 DISCOVA metricsTM 버젼 3.0(Phenomenome Discoveries Inc., Sakatoon)을 사용하여 수행하였다. FTICR-NS 데이터의 통계학적 분석 및 그래프를 MicrosoftTM Office ExcelTM 2007, 및 삼중-사중극자 MRM 데이터의 분포 분석을 사용하여 수행하고, JMP버젼 8.0.1을 사용하여 수행하였다. 메타 분석(Fisher's Inverse Chi-square Method)을 SAS 9.2 및 R 2.9.0을 사용하여 수행하였다. 두개-꼬리의 비쌍 스튜던츠 t-시험을 CRC와 대조군 사이의 유의성을 결정하기 위하여 사용하였다. 0.05 미만의 P-값은 유의적으로 여겨졌다. ROC 곡선을 JROCFIT(www.jrocfit.org)의 연속적 데이터 모드를 사용하여 만들었다.
결과
FTICR 대사체(metabolomic) 프로파일링
기술된 연구를 위한 실험적 작업의 흐름이 도 1에 요약되어 있다. 처리-받지않은 CRC 환자 및 건강한 대조군(표 1에 요약됨)의 세 개의 독립적인 집단으로부터의 혈청의 비-표적화 대사체 프로파일을 24-개월 기간(즉, 각 연구를 대략 12개월에 의해 분리)에 걸쳐 만들었다. 제 1 연구는 Genomics Collaborative, Inc(GCI)로부터 얻은 40명의 CRC 환자 및 50명의 대조군 대상을 포함하였다; 제2 연구는 세라캐어 라이프사이언시스 인크.로부터 얻은 26 명의 CRC 대상 및 25 명의 대조군을 포함하고, 제 3 연구는 일본 오사카(Monden et al.)로부터 가망성 있게 모아진 46명의 CRC 및 35 명의 대조군을 포함하였다. 모든 경우에, 혈청 대사물을 액체 추출 공정(상기 방법 참조)을 통해 포획하고, FTICR 질량 분석기상에 음성 전자분무 이온화(nESI) 및 음성 대기압 화학 이온화(nAPCI)를 사용하여 추출물을 직접 주입하였다. 각 연구 경우의 모든 대상의 결과적인 스펙트럼 데이터는 1 PPM 질량 정밀도안에 배열되고, 배경 피크는 뺐으며, 샘플-특이적 스펙트럼 피크 각각의 강도를 포함하는 2차원적 어레이 표를 커스텀 인포매틱스 소프트웨어(custom informatics software)를 사용하여 만들었다. 세 개 독립적인 연구 경우 CRC 환자와 대조군 프로파일 사이의 대사 차이는 도 2A 내지 2C에 나타난 바와 같이 검출된 질량 범위에 걸쳐 대조군 평균-정규화된 로그 비(ratio) 피크 강도를 플로팅하여 시각화하였다. 각 독립적인 연구에서, 대략 440 내지 600 Da사이의 스펙트럼 영역은 대조군에 대해 CRC 환자에서 강도에서 일치하게 감소된 피크를 보였다(도 2에서 녹색, 황색, 오렌지색 및 적색 포인트). 평균하여, 이 질량의 덩어리들은 대조군에 비해 CRC 환자 혈청에서 50% 내지 75% 감소를 보이고, p-값은 각 연구에서 1x10-5 이하이다.
각 발견 연구 사이의 겹침은 각 연구로부터 p-값에 기초한 톱 50개의 질량을 등급화하고, 그들을 도 2에 나타난 바와 같이 다른 연구에서 유의적 차이(CRC와 대조군 사이 p<0.05)를 나타내는 질량들과 비교하여 추가로 조사하였다. 예를 들어, GCI 발견 세트에서 가장 낮은 p 값들을 갖는 톱 50개의 대사물 중 46개(92%)가 세라캐어 1 데이터세트에서 유의적으로 차이가 나는 것으로 또한 발견되었으며, 한편, 50개 GCI 질량 중 31개가 오사카 데이터세트에서 p<0.05를 갖는 것으로 검출되었다. 마찬가지로 오사카 연구에서 톱 50개의 대사물 들은 GCI 및 세라캐어 1 연구에서 p<0.05를 보이는 대사물 들과 각각 88% 및 94% 중복성을 보였다. 이들 결과들은 세 개의 연구 전체에서 유의적으로 차이가 나는 질량들 중에서 매우 높은 정도의 공통을 나타냈고, 사실, 각 연구에서 톱 50개의 질량의 63%가 다른 두 연구의 적어도 하나의 톱 50개 안에 또한 존재했다(표 2.1 참조). 톱 50개 랭크-순서화된 질량들 중, 하나 보다 많은 연구에서 확인된 것들만 상기 강조된 440 내지 600 Da 질량 범위 안에 존재하는 것으로 발견되고, 두 연구 중 어디에서도 CRCs와 대조군 사이에 유의적으로 차이가 나는 이 영역 밖에서 검출되는 단일 피크는 없었다. 모든 세 개의 연구에서 배타적으로(exclusively) 검출되는 대사물 차이에 대한 필터링(또한 ESI 및 APCI에서 검출되는 C13 동위 원소 피크 및 중복 질량의 제거)은 표 3에 나타난 바와 같은 개별 12C 대사물을 나타내는 13개의 질량을 가져왔다. 질량들은 각 연구 내의 환자 샘플 전체에 걸쳐 유사한 표현(expression) 프로파일을 나타내어, 이들이 관련될 수 있음을 제시한다(Person 상관계수에 의해 평가되는 바와 같이, 나타나지 않음). 446 및 448의 공칭 질량을 갖는 두 개의 가장 작은 분자량 분자들의 바 차트가 도 3에 나타나있다. 대사물의 감소와 질병 단계 사이에는 상관 관계가 거의 또는 전혀 없게 관찰되었고(도 3A 및 3B), 리시버(receiver)-오퍼레이터(operator) 특성 곡선 분석은 결합된 모든 단계에 대해 모든 세 개의 연구에 걸쳐 0.91±0.03의 곡선 하의 평균 면적(AUC)을 가져왔다(도 3C; 나타난 개별 AUCs).
합리적인 분자 식의 컴퓨터 배정이 이어서 상기 확인된 13개의 질량에 대해 수행되었다. 배정은 앞서 기술된 바와 같이23, 일련의 수학적 및 케모메트릭(chemometric) 규칙에 기초하였다. 이 규칙은 정밀한 예견을 위한 고 질량 정밀에 의존한다. 알고리즘은 정의된 구속(constraints) 내의 검출된 정밀한 질량에 배정될 수 있는, 정확한 질량에 기초한, 탄소, 수소, 및 다른 원소의 수를 산정한다. 논리적인 추정 상의 분자 식이 표 3에서 질량들에 대해 산정되고, 28, 30, 32 또는 36 개의 탄소 및 4 내지 6개의 산소를 함유하는 원소 조성물을 가져왔다. 다양한 형태의 지방 가용성 비타민, 스테로이드 및 지방산을 포함하는 수개 부류의 대사물이 이론적으로 이들 원소 조성물에 맞는다. 본 발명자들은 이 정보를 구조 조성 연구를 위해 적절한 분자를 선택하는 추후 섹션에서 사용하였다. 집합적으로, 이들 결과는 대조군에 비교하여 CRC 환자의 혈청에서 길이가 28 내지 36 개의 탄소 범위의 유지적으로 가용성인 산소화된 대사물의 일치하는 50% 내지 75%의 감소를 나타내었다.
표 2: 각 발견 프로젝트의 톱 50개의 가장 식별력이 있는 질량 사이에서 겹침 퍼센트(스튜던츠 t-테스트 기초) 및 남은 집단에서 p<0.05를 보이는 질량
표 2.1: 각 발견 프로젝트의 톱 50개의 식별력이 있는 질량(스튜던츠 t-테스트에 기초하여). 회색 빛의 질량은 세 개의 연구중 두 개에서 톱 50개에서 검출되었다. 검출된 정밀한 질량, 산정된 예견된 분자식(회색의 질량 경우), 백만당 부로(PPM) 검출된 질량과 예견된 분자식의 질량 사이의 질량 차이, 분석 모드(전자 분무 이온화, ESI; 대기압 화학적 이온화, APCI), 대조군 대상 대 CRC 환자의 평균 피크 강도 사이의 p-값(비쌍(unpaired) 스튜던츠 t-테스트에 기초하여), 및 CRC 환자와 대조군 사이의 평균 피크 강도 비가 나타나있다.
[표 2.1]
표 3: 세 개 발견 프로젝트 모두를 포함하여 톱 50개의 질량 중에서 검출된 13 개 질량의 목록. p-값에 기초한 랭크 순서. 검출된 정밀한 질량, 산정된 예견된 분자식(회색의 질량 경우), 백만당 일부로(part per milion, PPM) 검출된 질량과 예견된 분자식의 질량 사이의 질량 차이, 분석 모드(전자 분무 이온화, ESI; 대기압 화학적 이온화, APCI), 대조군 대상 대 CRC 환자의 평균 피크 강도 사이의 p-값(비쌍(unpaired) 스튜던츠 t-테스트에 기초하여), 및 CRC 환자와 대조군 사이의 평균 피크 강도 비가 나타나있다.
HPLC
-연결된 탠덤 질량 분석
상기 기술된 FTICR-MS 작업에서 사용된 GCI 집단으로부터의 혈청의 선택된 에틸 아세테이트 추출물을 완전-스캔 APCI 음이온 모드의 사중극자 비행시간(Q-TOF) 질량 분석기에 연결된 HPLC를 사용하여 재-분석하였다. FTICR-MS 결과와 일치하게, 역-상 HPLC에 이어 16 내지 18 분 유지 시간에서 대략 440 내지 600Da의 피크 덩어리가 증상이 없는 대조군 혈청에서 검출되었으나, CRC 환자 혈청에서는 결여되었다(도 4). 모두 6개의 C28 바이오마커(m/z 446, m/z 448, m/z 450, m/z 464, m/z 466 및 m/z 468) 및 남은 C32 및 C36 마커의 많은 것으로부터의 분자 이온이 정상적 혈청 클러스터 내에서 검출가능하였다. 16-18분 유지 시간 내의 400Da 이하의 추출된 질량은, 다른 유지 시간들에서 추출된 질량 스펙트럼이 한 것처럼(나타나지 않음), 양 집단(도 4, 박스의 오른쪽까지의 면적)에서 유사한 피크 강도를 나타내어, CRC 환자 혈청 경우 이 고갈된(depleted) 대사 영역의 특이성을 강화하였다.
탠덤 질량 분석 단편화 핑거프린트가 다음으로 6개의 C28 바이오마커(표 4, 또한 도 7 내지 12 참조)에 대해 및 보다 높은 C32 및 C36 바이오마커(표 4.1 참조)에 대해 만들어졌다. 6개의 C28 바이오마커의 MS/MS 및 MS 단편화 데이터는 H2O (m/z 427, 429, 431, 445, 447 및 449)의 손실, H2O (m/z 409, 411, 413, 427, 429, 431)의 2 분자의 손실, CO2 (m/z 401, 403, 405, 419, 421, 423)의 손실 및 CO2 및 H2O (m/z 383, 385, 387, 401, 403, 405)의 손실로부터 생기는 피크에 의해 지배되어, 카복실산 작용성 및 두 개 이상의 히드록실 그룹의 존재를 나타냈다. 분자 식, 분자의 유기 성질 및 탠덤 MS 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 대사물이 지방 가용성 비타민, 예를 들어 레티놀 및 레티노 산(비타민 A), 칼시페롤(비타민 D), 토코페롤(비타민 E), 필로퀴논(비타민 K), 스테로이드 또는 담즙 산, 또는 긴쇄 다중불포화 히드록시 지방산을 포함하는 분자의 하나 이상의 가능성 있는 부류의 유도체 또는 유사체일 수 있다고 가설을 세웠다. 탠덤 질량 분석 단편화 핑거프린트가 따라서 표준물 5S,6S-(7E,9E,11Z,14Z)-디하이드록시에이코사테트라에노 산(1), 15S-히드록시-(5Z,8Z,11Z,13E)-에이코사테트라에노산(2) 및 8R-히드록시-(5Z,9E,11Z,14Z)-에이코사테트라에노 산(3), α-토코페롤(4),γ-토코페롤(5), 13-(6-히드록시-2,7,8-트리메틸크로만-2-일)-2,6,10-트리메틸트리데카노산(6), 16-(4,5-디메틸-3,6-디옥소 사이클로헥사-1,4-디에닐)-2,6,10,14-테트라메틸헥사데카노산(7), 6-히드록시-2,7-디메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데실)크로만-8-카르브알데히드(8), 6-히드록시-2,7-디메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데실)크로만-8-카복실산(9), 칼시페롤(10), 콜르칼시페롤(11), 에르고스테롤(12), 필로퀴논(13), 레티놀(14) 및 3β,7α-디히드록시-5-콜레스테노산(15)에 대해 만들어졌다(표 5). 비타민 A, D, E, K 및 스테로이드성 분자(4-15)에 대한 MS/MS 데이터는 대사체 바이오마커 어느 것에도 유사성을 보이지 않았다; 비타민 E 타입 분자 경우, 모두가 그들의 크로만 고리(4, 5, 6, 7, 8 및 9 경우 각각 m/z 163, 149, 149, 149, 163 및 179)의 특징인 진단 단편들을 가졌고, 비타민 D 및 유사체 경우, 진단 단편들이 측쇄(10, 11 및 13 경우 각각 m/z 271, 273 및 253)의 손실의 결과로 형성되었으며, 필로퀴논(13) 경우 퀴논 고리 시스템에 대한 진단 단편 m/z 187이 지배적이었고, 비타민 A(14) 경우, 단편 m/z 269(M+H-H2O)는 사이클로헥실 고리 잔기를 잃어 레티놀에 대한 진단 m/z 145를 형성하고, 3β,7α-디히드록시-5-콜레스테노산(15)경우, m/z 277에서 진단 레트로 디엘 알더 단편을 관찰하였다. 이에 더하여, 15(예를 들어 체노데옥시콜산 및 콜산)에서 처럼 프레그난 고리시스템을 갖는 다른 카복실산 표준물은 MS/MS 단편화 경우(나타나지 않음) CO2의 손실을 나타내지 않는다. 그러나, 히드록시 지방 산 표준물 1, 2 및 3(표 5)의 MS/MS 단편화 데이터는 CRC 바이오마커의 Ms/MS에 의해 생성되는 것과 유사하고, 다양한 히드록실화 긴-쇄 지방산29-33에 대해 다른 사람에 의해 기술된 것과 일치하는 주변(peripheral) 절단 이온을 보였다. 예를 들어 마커 m/z 446은 주변 절단 이온 427 [M - H - H2O]-, 401 [M- H - CO2]-, 408 [M - H - 2H2O]-, 383 [M - H - CO2 - H2O]- 및 365 [M - H - CO2 - 2H2O]- 및 쇄 절단 이온, 223, 205, 277 뿐만 아니라 다른 것을 보였다(표 5 및 도 7 참조). 유사한 이온이 다른 C28, C32 및 C36 대사물에 대해 얻어졌다(표 4, 표 4.1 참조). 집합적으로, 이들 추론은 대사체(metabolomic) 마커가 비타민 A, D, E, K 및 스테로이드의 유사체일 것 같지 않고, 오히려 수개 불포화 및 히드록시 그룹을 함유하는 긴-쇄 지방산 분자와 같다는 것을 제시하였다. 본 발명자들은 집합적으로 이들 대사물을 히드록시 다중 불포화 초 긴-쇄 지방산(hPULCFAs; 여기에서, "초(ultra)는 C30 및 긴쇄 지방산34를 언급하는데에 사용되었다)으로 언급한다.
표 4: 선택된 28-탄소 함유 질량의 탠덤-MS 분석
* 이온은 MS3 실험으로부터 얻어졌다.
표 4.1: hPULCFAs의 MSMS
[표 4.1]
표 5: 다양한 표준물의 탠덤 질량 분석 결과. 5S,6S-(7E,9E,11Z,14Z)-디하이드록시에이코사테트라에노산(1), 15S-히드록시-(5Z,8Z,11Z,13E)-에이코사테트라에노산(2) 및 8R-히드록시-(5Z,9E,11Z,14Z)-에이코사테트라에노산(3)(표 6), α-토코페롤(4),γ-토코페롤(5), 13-(6-히드록시-2,7,8-트리메틸크로만-2-일)-2,6,10-트리메틸트리데카노산(6), 16-(4,5-디메틸-3,6-디옥소 사이클로헥사-1,4-디에닐)-2,6,10,14-테트라메틸헥사데카노산(7), 6-히드록시-2,7-디메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데실)크로만-8-카르브알데히드(8), 6-히드록시-2,7-디메틸-2-(4,8,12-트리메틸트리데실)크로만-8-카복실산(9), 칼시페롤(10), 콜레칼시페롤(11), 에르고스테롤(12), 필로퀴논(13), 레티놀(14) 및 3β,7α-디히드록시-5-콜레스테노산(15). * 이 전문용어는 지방산 단편화에 특이적이다.
이어서, NMR 분석이 이어지는 벌크(bulk) 혈청 추출물 및 두 단계 플래쉬 크로마토그래피 접근을 이용하는 풍부 전략이 hPULCFAs의 추가의 구조적 특성화를 제공하기 위하여 수행되었다. 먼저, 물-아세토니트릴 용매 구배를 이용하는 역 상 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(FCC)를 수행하고, 결과적인 분획을 LC/MS에 의해 분석하였다. hPULCFAs를 함유하는 분획(분획 9, 도 14)을 모아서 클로로포름-메탄올 혼합물을 사용하는 정규 상 FCC를 거치게 하여 대략적으로 65% 풍부 반-정제된 분획 표지된 샘플 A(도 15 참조)를 수득하였다. 샘플 A에 대한 LC 및 탠덤 질량 분석(MS2 및 MS3) 데이터를 마커의 풍부함을 추적 및 확인하기 위하여 사용하였다. 샘플 A 및 그의 메틸 에스테르에 대한 핵 자기 공명(NMR, 1H, 13C 및 2D) 분석은 sp2 탄소에 부착된 수소 원자 경우 공명의 일부 억압을 관찰하면서 매우 긴 쇄 다중 불포화 히드록시 지방산과 일치하는 공명 및 상관 관계(도 6)를 밝혀냈다.
표 6: CRC 바이오마커 풀(pool)(샘플A) 및 그들의 메틸 에스테르의 1H NMR 데이터
* NMR 용매는 CDCl3이고, 시그널은 HMQC 및 HMBC와 같은 2D NMR 실험을 사용하여 배정됨.
다중 반응
모니터링
(
MRM
) 방법을 사용하여 독립적인 확인
CRC 환자의 혈중의 hPULCFAs의 감소된 수준은 두개 이상의 독립적인 집단에서 탠덤 질량 분석 접근(방법 참조)을 사용하여 추가로 확인하였다. 이 접근은 분석물2 8 , 35을 정량화하기 위하여 모-딸 단편 이온 조합(다중-반응 모니터링; MRM이라 언급됨)의 측정에 기초를 둔다. 본 발명자들은 방법에서 기술된 바와 같이 4개의 산소(모 질량 446, 448 및 450; 각각 C28H46O4, C28H48O4 및 C28H50O4)를 갖는 28 탄소 hPULCFAs의 세 개를 측정하는 분석을 개발하였다. 결과는 hPULCFAs의 표지된 표준물의 합성이 분석시 여전히 진행중에 있기 때문에 내부 표준물로서 각 샘플에 스파이크된(spiked) [13C1]콜산(CAEs) 에 대한 등가물로서 보고된다. 제 1 연구는 70명의 치료-받지 않은 CRC 대상 및 70명의 매치된 대조군을 포함하고, 이들 모두는 USA로부터의 백인이었다. 각 대상에 대한 세 개의 28-탄소 hPULCFAs(공칭 질량 446, 448 및 450에 따라 명명)의 CAEs는 도 5a에 나타나있다. 각 대사물의 유의적으로 보다 낮은 수준(p<0.001, 도 5a에 나타난 바와 같이 실제적인 값)이 대조군에 비해 처리-받지않은 CRC-양성 대상에서 관찰되었다. ROC 분석은 각 28-탄소 함유 hPULCFAs에 대해 0.87±0.005의 AUCs를 나타냈다(도 5b). 질병 단계에 의해 환자를 플로팅하면 단계 I 내지 III 사이에서 약간의 추가의 감소를 나타냈고, 단계 IV 대상은, 비록 오직 7명의 대상에서 나타났지만, 가장 적은 감소를 나타냈다(도 5c 및 5d). 단계에 의한 28-탄소 풀의 상응하는 평균 AUCs는 단계 I 경우 0.87, 단계 II 경우 0.88, 단계 III 경우 0.94, 및 단계 IV 경우 0.66이었다.
본 발명인들은 다음으로 일본 지바(Nomura et al.)로부터의 또 다른 CRC 독립 집단 및 대조군 대상을 특성화하기 위하여 MRM 방법을 사용하였다. 40명의 예비-처리된 CRC 대상 및 40명의 대조군으로부터의 혈청을 분석하고, CRC-양성 그룹에서 다시 유의적인 감소를 관찰하였다(도 6a). 세 개의 대사물에 대한 대응하는 평균 AUC는 0.97±0.014 이었다(도 6b). 이 연구에서, 단계와의 유의적인 상관 관계가 단계 I, II 및 III/IV 사이의 모든 비교(도 6c 및 6d)에서 관찰되었다(p<0.05). 단계에 의한 AUCs는 단계 I경우 0.93, 단계 II 경우 0.97, 및 단계 III/IV 경우 0.1이었다(두 단계 IV는 단계 III과 그룹지어졌다; 도 6 d).
논의
본 명세서에 건강한 무증상의 대조군에 비해 치료-받지않은 CRC 환자의 혈청에서 감소된, 28 내지 36개의 탄소를 함유하고 히드록실 및 카복실 작용기를 갖는 긴-쇄 탄화수소-계 대사물의 발견 및 예비 구조적 특성화가 기술되어 있다. 바이오마커 발견을 위한 유동 주입 기술과 연결된 고 해상(resolution) FTICR-MS 를 이용한 비-표적화 대사체의 유용성이 세 개의 독립적인 시험 집단에 상기 기술을 적용하여 시험 되었다. 종종 복잡한 알고리즘에 의존하고(리뷰39 참조) 바이어스40을 가져올 수 있는 바이오마커36 -38의 성능을 확인하기 위하여 단일 샘플 세트를 반으로 쪼개어 종종 사용되는 "트레이닝/시험 세트" 접근과 대조적으로, 본 발명자들은 고도의 확고함 및 샘플링 바이어스의 최소의 챈스를 보장하기 위하여, 세계적으로 다중 지역에서 수집한 상이한 윤리 배경의 대조군과 세 개의 별개 샘플 세트 매치된 경우들에 대해 완전히 독립적인 발견 분석을 실시하였다. 오사카 세트에서 발견된 톱 50명의 대사 식별자 중, 44 및 47이 또한 GCI 및 세라캐어 세트에서 각각 유의적으로 변화하였다. 이 놀라운 상호-연구 일치는 비-표적화 FTICR-MS 기술이 유일한 재현성 바이오마커 발견 엔진이 아니고, 질병-관련된 대사체 변화는 지리적 위치 종족에 걸쳐 고도로 보존될 수 있다는 것을 나타낸다. 비-표적화 FTICR-MS 발견의 간단한 분석으로의 번역은 두 개의 추가의 독립적인 시험 집단에 이 단순화된 방법을 사용하고, 이어서 3 FTICR-MS 연구로부터 생성된 ROC AUCs를 TQ-MRM 방법으로 부터 생성된 ROC AUCs와 비교하여, 두 바이오마커 후보자에 대한 표적화 TQ-MRM 방법을 개발하여 또한 시험하였다. 유사한 결과가 단순화된 방법을 사용하여 얻어졌다. 총체적으로, 집합적으로 222 명의 처리-받지않은 CRC 환자 샘플과 220명의 질병-없는 무증상 대조군을 포함하는 5개의 독립적인 연구 집단을 두개의 상이한 분석 방법을 사용하여 평가하였다. 정말로, hPULCFAs의 감소와 CRC 사이의 보고된 연결이 샘플의 5개 독립적인 세트에 걸쳐 양성 거짓 결과일 가능성은 매우 낮다. 메타-분석을 Fisher's Inverse Chi - squre 방법 (Reject H 0 if P = - 2 ∑ k i =1 log p i > C; p = 5개 독립적인 샘플의 P-값, k = 5개 상이한 샘플, C = 2k 자유도를 갖는 chi-square 분포의 상부 테일( X 2 0 .05, 10 = 18.31))41, 42을 사용하여 양성 거짓 비율에 대해 수행하였다. 메타-분석에 기초하여, 마커 446 및 448 경우의 결과적인 P-값은 2.96 x 10-47 및 8.11 x 10-49에서 각각 개별적인 p-값 보다 유의적이었다. 본 발명자들은 그러므로, 높은 확신으로 이들 대사물에서의 감소는 CRC의 존재와 상호관련 있음을 말할 수 있다.
FTICR-MS는 추출, 이온화, 및 통계학적 상관 정보와 결합하여 정밀한 질량에 기초한 확신 있는 분자 식 예견에 대해 충분한 해결을 제공하였다. 다중 원소 조성물이 이론적으로는 소정의 바이오마커 질량에 배정될 수 있지만, 오직 28 내지 32개의 탄소 및 4 내지 6개의 산소를 갖는 식이 두 개 또는 세 개의 발견 세트에서 검출된 공동 질량에 일치하게 배정될 수 있었다. hPULCFAs의 샘플-대- 샘플 표현 프로파일 사이의 고도의 통계학적 상호작용(즉, 대상들에 걸쳐 마커들의 상대적 강도사이의 고도의 상관관계)이 있지만, 본 발명인들은 이들이 같은 신진대사의 시스템의 모든 부분인가 및 그러므로 관련된 조성을 나타내야 하는 지를 의심했다. 음이온화 모드에서의 검출은 질소가 어느 조성물에도 존재할 가능성을 또한 감소시켰다. 물과 이산화 탄소의 지배적인 손실을 보여주는 탠덤 질량 분석과 결합한 이 정보는 본 발명인들이 표 3 및 표 2.1에 나타난 분자식을 확신 있게 제안하게 했다. 이론적으로는 상기 분자 식 부류와 맞는 다수의 분자 후보 부류가 또한 탠덤 MS를 사용하여 배제되었다. 예를 들어, 본 발명인들은 스테로이드 또는 비타민 D에서와 같은 축합된 고리 시스템을 나타내는 어떤 단편, 및 비타민 E 토코페롤에서 관찰되는 것과 같은 크로만 고리 시스템을 나타내는 어떤 단편도 관찰하지 못했다. 비타민 K 및 레티놀, 및 담즙 산, 예를 들어 콜산 및 3β,7α-디하이드록시-5-콜레스테노산을 포함하는 수개의 다른 부류의 분자는 비교할만한 단편화 패턴을 나타내지 않았다. 그러나, 특히 CO2 및 H2O 손실로부터 생기는 딸 이온, 및 hPULCFAs로부터 공지된 히드록시 지방산 표준물 및 레졸빈 및 프로텍틴(하기 언급됨)과 같은 문헌에 보고된 다른 지방산으로의 쇄 절단 이온의 상대적 풍부함에서, 단편화 패턴에서의 유사성은 히드록실화 긴-쇄 지방산-타입 종을 제시했다. C28 시리즈(질량 446, 448, 450, 464, 466 및 448) 경우의 탠덤-MS 데이터의 조사는 본 발명인이 합리적으로 카복시-말단 쇄 단편인 -CH2-CH=CH-CH2-CH2-COOH를 나타내는 것으로 예견한, 일치하는 113 Da 딸 이온을 밝혀냈다. 또한, [M-(CO2+H2O)] 딸 이온으로부터의 54 (-CH=CH-CH2-CH2-)의 일치하는 손실은 446, 448, 464 및 466 경우 관찰되었으나, 450 및 468 분자에서는 관찰되지 않아, 1) 450 및 468이 포화 카복시 말단 이온을 가질 수 있고, 2) 분자의 이 영역 내에 히드록실 잔기가 없기 쉽다는 것을 제시한다. 모든 C28 및 다른 마커의 MS/MS 데이터는 1(베이스 피크는 m/z 115에서 쇄 절단 이온이다)에 대해 관찰된 바와 같이 1,2-디올 모티프(motif)와 함께 얻어진 진단 단편을 보여주지 못했고, 풀래쉬-컬럼 크로마토그래피를 통해 풍부하게 된 분획들 상에 대한 NMR은 δ 2.78(이중 결합 탄소 사이의 메틸렌 방해) 및 δ5.12-5.90(이중 결합 탄소들 상의 수소)에서의 1H NMR 시그날에 대해 얻어진, 예상되는 것보다 낮은 인테그레이션 값을 보여줬다. 누적적으로, 이들 결과는 분자 내의 히드록시 그룹이 카복시 말단으로부터 적어도 7개의 탄소의 sp2 탄소 사이에서 탄소 원자에 결합 되기 쉽다는 것을 예시하였다.
구조 분석에 기초하여, 6개의 C28 바이오마커에 대한 구조가 하기 표 6.1에 나타난 바와 같이 제안되었다:
표 6.1: CRC 바이오마커 및 제안된 구조
[표 6-1]
흥미롭게도, 본 명세서에서 보고된 대사물 마커는 인간-특이적 대사 시스템을 나타낸다. 본 발명인들은 래트, 마우스 및 소를 포함하는, 다수 종으로부터의 혈청 샘플, 및 모두 이들 hPULCFAs(결과는 나타나지 않음)의 어느 검출가능한 수준을 나타내는데 실패한, 세포주, 조절된 배지, 종양 및 GCI 발견 세트에서의 환자로부터의 정상적 결장 조직, 및 뇌, 간, 동물성 지방, 및 다양한 종으로부터의 다른 조직을 포함하는 다수의 상이한 샘플 공급원으로부터의 혈청 샘플을 분석했다. 본 발명인들은 포화 C28 및 긴-쇄 지방산43 ,44에 있어서 풍부한 폴리코사놀 추출물을 포함하는 다양한 식물 조직 또는 곡물에서 이들 분자를 검출할 수 없었다. 이는 이 분자들이 특이적 p450-중재된 및/또는 마이크로비오틱(microbiotic) 공정과 같은 인간-특이적 대사 과정으로부터 기원한다는 것을 제시한다. 종양 또는 정상적 결장 조직에서의 검출 결여는 이 대사물이 "종양 마커"가 아니고, 단계 I 암에서의 고 비율 연결과 결합하여, 감소가 종양 짐(burden)의 결과일 것 같지는 않다는 것을 제시한다. 그러나, 일부의 늦은 단계 일본 경우에서 관찰된 수준의 추가의 감소(도 6)는 hPULCFAs의 보다 낮은 수준이 정말로 이 그룹에서 진전 률을 나타낸다면 설명될 수 있을 것이다. 또한, 본 명세서에서 보고된 모든 대조군 그룹에서, 대상들은 종양 또는 진전된 신조직 형성이 없다라고 대장내시경으로 확인되지 않았다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 평균 위험 대상에서 Collins에 의한 대장내시경 결과에 기초하여, 무증상 집단의 10% 이하가 진전된 신조직 형성에 대해 양성이다45. 그러므로, CRC에 대해 위험에 있거나 있지 않은 대상 사이를 구분하는 이들 대사물의 능력은 본 발명인들의 결과에서는 과소평가되기 쉽다.
히드록실 그룹을 함유하는 이 길이의 지방-산 분자는 예전에 보고되지 않았지만, 이들은 급성 염증의 완화를 촉진하는데에 중요한, 각각 n3 필수 지방산 EPA 및 DHA로부터 기원하는 레졸빈 및 프로텍틴으로 알려진 히드록실화 매우 긴-쇄 지방산의 부류를 닮은 것으로 보인다. 급성 염증을 충분히 "완화되게 하는" 능력의 부재가 암46 및 알쯔하이머 병47을 포함하는 다수 증상의 근저를 이루는 만성 염증 상태의 설정 뒤에 있는 선도적 이론이다. 특히, IDB, 크론병, 대장염, 및 결장직장암과 같은 장 염증 증상에 대한 선-완화(pro-resolution) 긴 쇄 히드록실 지방산 중재자의 효과가 관련이 있다. 레졸빈 E1(RvE1) 및 리폭신 A4(LXA4) 모두는 결장 염증에 대한 보호 효과와 관련되어 있다. RvE1은 잔존률 및 유지된 체중48에서의 개선과 함께, 백혈구 침투에서의 차단, 감소된 예비염증 유전자 발현, 유도된 산화 질소 신타제가 수반되는, 마우스에서의 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산-유도된 대장염의 발달에 대해 보호하는 것으로 나타났다. 유사하게, LXA4 유사체는 인간 대장 세포외4 9에서 케모킨 분비를 감쇠시키고, 병원성 유도된 위장염50에 반응하여 유도된 유전자, 특히 NFκB에 의해 조절되는 유전자의 50%를 감쇠시켰다. 생체 내에서, LXA4 유사체는 DSS-유도된 염증 대장염에서 장 염증을 감소시켜, 체중 손실, 혈변 및 시사율을 상당히 감소시켰다. 구조적으로, 레졸빈 및 프로텍틴( 및 n6 리폭신)은 다양한 리폭시게나제, 사이클로옥시게나제 및 p450 효소51 -55에 의해 촉매된, 모 VLCFAs의 일-, 디- 및 트리-히드록실화 생성물을 포함한다.
본 명세서에서 기술된 진단 방법의 유용성은 CRC 환자에서 hPULCFAs의 일치하게 관찰된 감소에 의해 지지된다. 또한, 여기에서 보고된 모든 케이스-대조군 데이터에 걸쳐 평균 AUC는 0.91±0.04이었고, 이는 거의 내지 전혀 없는 질병-단계 바이어스(bias)와 함께 90% 특이성에서 대략 75% 민감도로 번역된다. 대사물은 혈청에서 측정되기 때문에, 콤플라이언스(compliance)가 높아야 하고, 테스트가 표준 삼중-사중극자 질량 분석기 등 상에서 대사 시험28의 선천성 에러와 유사한 방법으로 비용-효과적으로 수행될 수 있다.
2. hPULCFAs 에 대한 생물학적 역활의 분석
재료 및 방법
세포주: SW620, MCF-7 및 RAW264.7을 ATTCC로부터 구입하고, 37℃, 5% CO2에서 고 글루코즈 DMEM, 10% FBS에서 배양했다.
정량적 리얼 타임 PCR: RAW264.7 세포를 처리 전날 6-웰 플레이트에 1 x 106/웰으로 씨딩했다(seeded). 다음날, 세포들을 hPUCLFA(D046)의 상이한 농도 또는 대조군 비히클로서 1% FA/DMSO(DMSO)으로 4시간 동안 처리했다; 각 처리는 이중으로 했으며; 이어서 1㎍/ml의 LPS(cat. No. L4391, Sigma)로 20시간 동안 자극했다. 총 RNA를 제조자의 지시대로 Trizol(Cat. No. 15596-018, Invitrogen)을 사용하여 세포 펠릿으로부터 분리했다. RNA 펠릿을 DEPC 처리된 물 50㎕에 재현탁시키고 -80℃에서 저장하였다. RNA 농도 및 순도는 분광광도법으로 260 및 280 nm에서 측정하였다. 역전사는 qScript cDNA super mix(Cat No. 95048-100, Quanta Biosciences)를 사용하여 수행하였고; PCR은 Applied Biosystem Syep one Plus Real-time PCR 시스템상에서 빠른 SYBR 그린 마스터 믹스(Cat No. 4385612, AB Applied Biosystem)를 사용하여 수행하였다. 리얼-타임 PCR 사용된 프라이머는 하기에 열거되어 있다. 각 전사 카피의 상대적인 수는 하우스-키핑 유전자 베타 액틴(house-keeping gene Beta Actin)으로 정규화했다.
아질산염: 아질산염 농도를 그리스 시약(Griess Reagent)(Cat no. G2930, Promega)으로 측정했다. RAW 세포 또는 SW620 세포를 리얼-타임 PCR에 기술된 대로 측정하였다. 조절된 배지를 아질산염 측정을 위해 수집했다. 측정은 96 웰 플레이트에서 제조자의 지시대로 수행했다.
마우스 TNF 알파용 ELISA: 가공하지 않은(raw) 세포를 리얼 타임 PCR로 처리하였다. 조절된 배지를 모았다. 세포를 간략하게 얼음 냉각 PBS로 세척하고, 용해 버퍼(Jerry's recipe)로 용해시켰다; 세포 용해물 내의 단백질을 Bio-Rad 단백질 분석(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 정량화했다. 웰당 50㎕의 조절된 배지 또는 100㎍의 세포 용해물을 제조자의 지시대로(Cat.No. KMC3011, Invitrogen) TNF 알파의 양을 측정하는데에 사용하였다.
마우스 IL -1 베타용 ELISA:
가공하지 않는 세포를 리얼 타임 PCR에 기술된 대로 처리하였다. 50㎕의 조절된 배지 또는 100㎍의 세포 용해물을 제조자의 지시(Cat. No. MLB00B, Quantikine)대로 IL-1 베타의 양을 측정하는데에 사용하였다.
웨스턴 분석: 세포들을 냉각된 PBS안의 러버 폴리스맨으로 100 mm 조직 배양 플레이트로부터 제거하고, 4℃에서 원심분리에 의해 수집하며, 얼음 냉각 용해 버퍼(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.1% NP-40, 0.5mM EDTA, 0.1mM EGTA 플러스 1X-시그마 포유동물 세포 항-프로테아제 칵테일) 중에 재현탁시켰다. 세포들을 다중 냉동-녹임 사이클을 사용하여 용해시키고, 이어서 펄스 초음파처리 및 4℃에서 고속 원심분리에 의해 세포 조각을 제거하였다. 웨스턴 분석을 위하여, 동등량의 단백질(Biorad Protein Reagent을 사용하여 Bradford 단백질 분석에 의해 평가됨)을 SDS-PAGE에 의해 리졸빙시켰다(resolved). 전기 영동에 이어, 단백질을 니트로셀룰로즈 막(Pall-VWR)에 트랜스-블로팅시켰다(trans-blotted). 막을 회전식 플레이트 상에서 4℃에서 0.1% Tween-20을 함유하는 포스페이트-버퍼된 염수(PBS) 중에서 5% 분자 등급 탈지 스킴 우유 분말(Biorad Laboratories, Mississauga ON Canada) 로 밤새 차단시켰다. Santa Cruz Biotechnology로부터의 1차 항체를 1:1000 희석에서 4℃에서 밤새 배양시켰고, 2차 HRP 항체를 1:10000 희석으로 30분간 적용했다. 이어지는 세척을 같은 버퍼에서 수행하였다. 향상된 화학발광(ECL) 검출 시스템(Dupont-NEN)을 항원/항체 복합체를 검출하기 위하여, 사용하였다. 블로트들을 BioMax 화학발광 X-선 필름(Kodak)에 노출시키고, 표적 시그날을 스캔하며, ImageJ 농도계 소프트웨어가 있는 HP 스캐너(Scanjet G4010)를 사용하여 정량화했다.
hPULCFA
-풍부한 추출물의 생성
hPULCFAs(180 ml 혈청, 500 mg 추출물)을 함유하는 정상 인간 혈청의 에틸 아세테이트 추출물을 단계 구배 용출; 아세토니트릴-물 25:75 내지 100% 아세토니트릴로 역상 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 거치게했다. 여기서, 다른 유사한 추출 방법이 또한 사용될 수 있으며, 정량화 및/또는 풍부하게 함은 다른 크로마토그래프 접근, 예를 들어 제한되는 것은 아니지만 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 또한 수행될 수 있다. 플래쉬 컬럼 분획을 모아 LC/MS 및 MS/MS에 의해 분석하였다. CRC 바이오마커를 함유하는 분획을 모았다(12.5 mg). 샘플을 음성 방식으로 APCI 공급원이 장착된 ABI QSTAR®XL 질량분석기를 사용하는 HPLC(HypersilTM ODS 5㎛, 125 x 4 mm 컬럼을 가진 HP 1100, Agilent Technologies)-연결된 비행시간 질량분석기를 거치게 하여 hPULCFAs에 대해 모니터링하였다. 어떤 동등한 질량 분석기도 또한 사용될 수 있다. 완전 스캔 모드의 스캔 타입은 1.0000초의 축적시간, 50 내지 1500Da의 질량 범위, 및 55분의 지속 시간의 비행시간(TOP)이었다. 공급원 파라미터는 다음과 같다: 이온 공급원 가스 1(GS1) 80; 이온 공급원 가스 2 (GS2) 10; 커튼 가스(CUR) 30; 분무기 전류(NC) -3.0; 온도 400℃; 디클루스터링 전위(DP) -60; 포커싱 전위(FP) -265; 디클루스터링 전위 2(DP2) -15. MS/MS 모드에서, 스캔 타입은 생성물 이온이고, 축적 시간은 1.0000 초이며, 스캔 범위는 50 내지 650 Da이고, 지속 시간은 55분이었다. 모든 공급원 파라미터는 상기와 같고, 충돌 에너지(CE)는 -35V 및 충돌 가스(CID, 질소)는 5 psi이다.
hPULCFAs의 플래쉬 컬럼 풍부하게 함의 결과가 도 16, 17 및 18에 나타나 있다. 음식(dietary) 및 짧은-쇄 지방산과 같은 혈청 성분들은 제거될 수 있어, 농축된 수준의 hPULCFAs를 함유하는 반-정제된 추출물을 얻었다.
hPULCFAs
의 생물학적 활성
hPULCFAs의 생물학적 활성은 A) 다양한 세포-기준 시스템을 이용하여 hPULCFAs가 결핍된 추출물에 대해 hPULCFA-풍부한 추출물의 활성의 평가, 및 특정 hPULCFA의 합성 및 활성의 측정
80㎍/ml hPULCFA-양성 추출물로 처리된 MFC 인간 흉부 악성종양(carcinoma) 세포는 hPULCFA-음성 추출물 또는 비히클(대조군)으로 처리된 세포에서는 관찰되지 않는 증가된 입상(granularity), 아포프토좀(apoptosomes) 및 불규칙한 핵(도 20)을 포함하는 세포자살 세포의 전형인 형태학적 변형을 가져왔다. 생존성 세포의 수가 또한 hPULCFA-처리된 세포에서 시각적으로 낮았다(도 20). 웨스턴 블로트 분석은 29 kDa 폴리-ADP 리보즈 폴리머라제(PARP) 절단 생성물의 나타남(도 21)을 통해 평가된 바와 같이 hPULCFA-처리된 MCF 세포에서 카스파제 활성의 존재를 확인했다.
유사한 방법으로, hPULCFAs가 풍부한 80㎍/ml 혈청 추출물로 처리된 SW620 결장암 세포는 12시간에서 세포증식에서 40%의 감소, 및 대조군 또는 비히클 추출물경우 관찰되지 않는 48시간 만에 의한 70% 감소를 보였다(도 22). MCFR7 세포와 유사하게, 세포의 현미경 관찰은 감소된 증식(나타나지 않음)과 연결된 가능한 프로-세포자멸(pro-apoptotic) 효과를 제시했다. 도 23에 나타난 바와 같이, PARP 활성은 hPULCFA-풍부하게 된 추출물로는 검출가능하나, 대조군 추출물 또는 비히클로는 검출할 수 없다. 집합적으로, 이 결과는 세포자멸을 유도하는데에 있어서 hPULCFAs의 기능적 역할을 제시한다.
일련의 염증 단백질에 대한 hPULCFA 추출물의 효과는 이어서 이뮤노불로트로 조사하였다. hPULCFA 풍부한 추출물로 SW620 세포를 처리하는 것은 NFκB의 음성 조절자인 IκBα의 동시적인 유도와 함께(도 25), 프로-염증 전사 인자 NFκB(도 24)의 감소를 가져왔다. 또한, hPULCFA-풍부한 추출물은 DNA 산화 및 단백질 니트로실화를 통해 돌연변이적 변화를 촉진할 수 있는 산화 질소의 많은 양을 발생하는 염증이 발생된 조직에서 보통 유도된 유도성 산화 질소 신타제(iNOS, 또는 NOS2, 도 26)에 억제 효과를 보였다. hPULCFA-처리된 세포에서 산화 질소의 발생은 추후 조절된 배지(도 27)에서 감소된 아질산염 수준을 측정하여 결정되었다(도 27). 아질산염은 산화 질소의 안정한 대사물이고, 이는 다양한 유기 화합물과 반응하여 돌연변이를 유발할 수 있는 니트로자민 및 다른 질산염 라디칼을 형성한다. 주목할 만하게, NO는 박테리아 감염과 같은 다양한 염증 반응 동안 유도되고, 결장암의 원인으로서 직접적으로 관련되어 있다(Erdman et al., PNAS, Jan 27, 2009, vol 106 No.4). hPULCFA-처리된 세포에서 iNOS(NOS2) 및 아질산염의 환원은 hPULCFAs가 이 프로-염증 반응을 억제할 수 있다는 제시한다.
RAW 293 마우스 마크로파지 세포 모델 시스템이 화합물의 항-염증 활성을 평가하기 위하여 흔히 사용된다. 세포를 대량 염증 반응을 유도하는 리포폴리사카라이드로 처리하고, 이들 화합물은 그들의 보호 능력에 대해 시험을 받을 수 있다. RAW293 세포를 hPULCFA-풍부한 추출물로 예비처리하고, 이어서 LPS로 24시간 동안 처리하며, 그 후, 사이토킨 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 및 인터류킨-1 베타 (IL-1β), 상기 기술된 바와 같은 iNOS, 사이클로옥시게나제 2(COX2, 아라키돈산으로부터 프로-염증 에이코사노이드의 생성에 관여하는 효소)를 포함하는 프로-염증 마커의 mRNA 전사 및 단백질 수준을 평가하였다. LPS로 처리에 이어, TNFα mRNA 전사 수준은 대조군 추출물에 비해 hPULCFA-풍부 추출물에 노출된 세포에서 통계학적으로 유의적인 감소(p>0.05)를 나타냈다(도 28). 세포 용해물(도 29) 및 조절된 배지(도 30)에서 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 평가된바, TNFα 단백질의 수준은 또한 대조군에 비교해서 hPULCFA-처리된 세포에서 유의적으로(p<0.05) 감소되었다. hPULCFA 처리는 또한 대조군 처리에 비해 iNOS mRNA의 LPS-중재된 유도를 차단시키고(p<0.05; 도 31), 이는 이뮤노블로트에의해 평가된바 iNOS 단백질에서의 유의적인 감소, 및 아질산염 수준에 의해 결정된 바 산화질소의 투여량 의존 억제(도 33)와 상응한다. 도 34 에 나타난 바와 같이, COX2의 mRNA 전사 수준은 IL-1β의 mRNA 전사 수준(도 35; p<0.05) 및 세포 용해물 단백질 수준(도 36; p<0.05)과 마찬가지로 hPULCFA-처리된 세포 대 대조군(p<0.05)에서 또한 유의적으로 감소되었다. 집합적으로, 이들 결과는 프로-염증 상태에 대해 보호하는데 있어 hPULCFAs의 유용성을 예시한다.
하기 구조 분자식 C28H46O4를 갖는 hPULCFA(D046-124로 명명)를 실시예 3(하기)에 기술된 합성 도식에 따라 98.7% 순도(LCMS에 의해 평가됨)로 합성하였다:
LPS로 자극 전 RAW293 세포를 순수 hPULCFA로 처리하는 것은 도 37(p<0.05)에 나타난 바와 같이 500 μM(0.5 mM)에서 TNFα 전사 및 도 38에 나타난 바와 같이 0.5 mM에서 조절된 배지에서 단백질 수준의 유도를 방지했다. 유사한 억제 효과가 0.5 및 0.1 mM의 투여량(도 39)에서 iNOS(p<0.05)의 mRNA 전사 수준 및 같은 농도에서 아질산염 수준을 통해 결정된바 산화 질소(p<0.05, 도 40)에 대해 관찰되었다. 유사한 효과가 또한 조절된 배지에서 IL-1β의 수준에 대해 관찰되었고, 이 경우 LPS-중재된 자극은 0.5 mM의 순수 hPULCFA에 의해 완전히 차단되었다(도 41, p<0.05).
hPULCFAs의 항-염증 역할을 추가로 조사하기 위하여, 6개 hPULCFAs(450 Da, 446 Da, 468 Da, 466 Da, 448 Da 및 464 Da)의 수준을 CRC 및 NSAIDs를 취하는 건강한 대상의 두 개의 큰 집단에서 측정하였다. 도 42 및 도 43(이 경우 각각의 집단의 상세한 사항은 표 7 및 8에서 볼 수 있다)에 나타난 바와 같이, hPULCFA 수준에서 통계학적으로 유의하고 재현가능한 증가가 비-스테로이드성 항염증 약물을 취하는 CRC 대상에서 일어난다. 이 효과는 처리-받지않은 CRC 환자(표 7, 도 42) 및 처리에 이은 CRC 환자(표 8, 도 43) 모두에서 관찰되고, 결핍 대상에서 hPULCFA 수준의 증가에서의 NSAIDs 결과의 유용성을 나타낸다. 그러나, 이 효과는 이미 정상 hPULCFA 수준을 갖는 대상에서는 관찰되지 않는다. 따라서, hPULCFA 수준을 측정하는 것이 처리 계획에서 NSAIDs의 효과를 모니터링하는데에 사용될 수 있다.
표 7: 6 개의 hPULCFAs에 대한 NSAID 효과에 대해 테스트받은 처리-받지않은 집단의 대상들의 집단 분포
| 대조군 NSAIDS 없음 | 207 |
| 대조군 NASIDS 모두 | 82 |
| ASA | 46 |
| 이부프로펜 | 19 |
| ASA/이부프로펜 | 5 |
| 셀레콕시브 | 2 |
| 엑세드린/이부프로펜 | 2 |
| 이부프로펜/나프록센 나트륨 | 1 |
| 나프록센 나트륨 | 5 |
| 레페콕시브 | 2 |
| 대조군 NASIDS 없음 | 151 |
| 대조군 NASIDS 모두 | 37 |
| ASA | 24 |
| 이부프로펜 | 7 |
| ASA/이부프로펜 | 2 |
| 레페콕시브 | 1 |
| ASA/레페콕시브 | 1 |
| 셀레콕시브 | 1 |
| 엑세드린 | 1 |
표 8: 처리를 받고 6개의 hPULCFAs에 대한 NSAID 효과에 대해 테스트받은 CRC 환자에서의 대상들의 집단 분포
| 대조군 NSAIDS 없음 | 202 |
| 대조군 NASIDS 모두 | 48 |
| ASA/이부프로펜 | 2 |
| ASA | 27 |
| 셀레콕시브 | 1 |
| 엑세드린/이부프로펜 | 1 |
| 액새드린 | 2 |
| 이부프로펜/나프록센 나트륨 | 1 |
| 이부프로펜 | 13 |
| 레페콕시브 | 1 |
| 대조군 NSAIDS 없음 | 187 |
| 대조군 NASIDS 모두 | 80 |
| ASA | 36 |
| ASa/셀레콕시브 | 2 |
| ASA/이부프로펜 | 3 |
| ASA/레페콕시브 | 1 |
| 셀레콕시브 | 3 |
| 셀레콕시브/이부프로펜 | 2 |
| 엑세드린 | 3 |
| 이부프로펜 | 22 |
| 이부프로펜/레페콕시브 | 1 |
| 나프록센 나트륨 | 3 |
| 레페콕시브 | 4 |
두 개의 유도성 프로-염증 마커들을 hPULCFAs의 효과를 확인하기 위하여 또한 테스트하였다. 먼저, TNF-알파 수준을 RAW 세포에서 LPS에 의해 유도에 이어 측정하고, 도 44의 바 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이 hPULCFA-양성 추출물로 처리된 샘플에서 감소 된 것으로 나타나나, hPULCFA-음성 추출물로 처리된 샘플에서는 발견되지 않았다. 이 결과는 hPULCFA-함유 추출물이 TNF-알파를 통해 평가된바 염증에 대해 보호하는 능력을 갖는다는 것을 제시한다. 제 2 프로-염증성 마커인 유도성 산화 질소 신타제(NOS2)의 수준을 LPS 및 hPULCFA 양성 및 음성 분획으로 조합된 처리에 이어 웨스턴 블로트 분석으로 측정하였다. 도 45의 상부 페인(pane)에서 볼 수 있는 바와 같이, hPULCFA-풍부 추출물은 RAW 세포에서 LPS-유도된 NOS2를 감소시킨다. 도의 하부 페인은 대응하는 폰세아우(Ponceau) S 염색된 겔을 보여준다. 이 결과는 또한 hPULCFAs 경우의 항-염증 역할과 일치한다.
도 46은 hPULCFA 양성 추출물이 투여량 의존 방법으로 세포의 조절된 배지에서 아질산염 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 아질산염은 산화 질소의 안정한 대사물이고, 이는 다양한 유기 화합물과 반응하여 돌연변이를 유발할 수 있는 니트로자민 및 다른 질산염 라디칼을 형성할 수 있다. 산화 질소(NO)는 또한 상기 언급된 바와 같이 hPULCFA 양성 추출물에 의해 단백질 수준(도 45)에서 억제되는 산화 질소 신타제에 의해 생성된다. 주목할 만하게, NO는 박테리아 감염과 같은 다양한 염증 반응 동안 유도되고, 결장암(colon cancer)의 원인으로서 직접적으로 관련된다(Erdman, et al., PNAS, Jan 27, 2009, vol 1067 No.4).
3. hPULCFA D046 -124의 합성
구조:
분자식: C28H46O4
LCMS 순도: 98.7%
단편 A에 대한 합성 도식:
단편 B에 대한 합성 도식:
단편 C에 대한 합성 도식:
D046 -124(또한 본 명세서에서 GVK-FFS-09-06-PHM이라 언금됨)에 대한 합성 도식:
단계 1:
LNB 참조 No.:B 064-015A2
과정: 벤젠(400 ml)중의 화합물 1(250 g, 2.906 몰)의 용액에 0℃에서 피리딘(262 ml, 3.196 몰)을 첨가하고, 이어서 SOCl2(225 ml, 3.196 몰)을 첨가하며, 출발물질이 TLC(용매 시스템 페트 에테르 중의 20% EtOAc, 생성물 Rf=0.5) 상에서 사라질 때까지 실온에서 밤새 교반하였다.
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 얼음 냉수로 처리하여 반응을 멈추게 하고, EtOAc(200ml x 3)로 추출하여, 혼합된 유기층을 NaHCO3 용액, 물(300ml x 2) 및 염수(200 ml)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키며, 감압하에서 농축하여 연갈색 오일로서 30% 수율로 화합물 2(100g)를 수득하였다(B 064-015A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 4.18 (s, 2H), 4.34 (s, 2H) (도 47 및 48).
단계 2:
LNB 참조 No. B 064-017A2
과정: 아세톤 (50 ml)중의 화합물 2(5 g, 48.07 밀리몰)에 NaBr(7.3 g, 72.11 밀리몰)을 첨가하고, 출발 물질이 TLC(용매 시스템 페트(pet) 에테르 중의 20% EtOAc, 생성물 Rf=0.3) 상에서 사라질 때까지 밤새 환류시켰다.
마무리 작업: 반응 완결시, 용매를 감압하에서 농축시키고, DCM(50 ml)으로 희석시키며, 물(50 ml x 2) 및 염수(50 ml)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키며, 감압하에서 농축하여 무색 오일로서 70% 수율로 화합물 3(4g)을 수득하였다(B 064-017A2).
특성화: 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 4.3 (s, 2H), 4.45 (s, 2H) (도 49).
단계 3:
LNB 참조 No.: B 064-025A1
과정: DCM(1.5 리터(lit)) 중의 화합물 3(150 g, 100 몰)에 0℃에서 pTSA(1.9 g, 10.06 밀리몰)를 첨가하고, DHP(91 ml, 1006 몰)을 적가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 밤새 교반하였다.(용매 시스템 페트 에테르 중의 20% EtOAc, 생성물 Rf=0.8).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 DCM(500 ml)으로 희석하고, 물(500 ml x 2) 및 염수(500 ml)로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켜, 감압하에서 농축시켜 조 화합물을 수득하고, 이를 추가로 실리카 겔(100-200 메시) 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 무색 오일로서 85% 수율로 화합물 4(234.5g)를 수득하였다(B 064-025A1).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 1.5 - 1.79 (m, 4H), 1.8 - 1.9 (m. 4H), 4.0 (m, 2H), 4.2 (m, 2H), 4.8 (m, 1H) (도 50).
단계 4:
LNB 참조 No. B 064-034A2
과정: THF(500 ml)중의 아연 (139 g, 2.145 몰)의 현탁액에 HgCl2(30 mg)를 첨가하고 10분 동안 교반하고, 이어서 화합물 4(200 g, 0.858 몰)을 첨가하며, 이어서 환류 조건하에서 THF( 1리터) 중의 부티르알데하이드(92 ml, 1.030 몰)를 첨가하며, 이어서 교반을 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 밤새 계속하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 20% EtOAc, 생성물 Rf=0.8).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 AcOH로 반응이 멈추게 하고, 화합물을 EtOAc(500 ml x 2)로 추출하고, 물(500 ml x 2) 및 염수(500 ml)로 세척하며, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 감압하에서 농축시켜 조 화합물을 수득하고, 이를 추가로 실리카 겔(100-200 사이즈) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 연황색 오일로서 25% 수율로 화합물 5(35 g)를 수득하였다(B 064-034A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 0.9 (s, 3H) ,1.2-1.8 (m, 11H), 3.5 (m, 1H), 3.7 - 3.9 (m, 2H), 4.0-4.3 (m, 4H) (도 51).
단계 5:
LNB 참조 No: B064-042A1
과정: DCM(350 ml)중의 화합물 5(35 g, 15.486 밀리몰)의 현탁액에 이미다졸(26 g, 38.71 밀리몰), 이어서 3급-부틸 디페닐클로로실란(TBDPSCI)(43 ml, 17.035 밀리몰)을 0℃에서 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 밤새 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 20% EtOAc, 생성물 Rf=0.8).
마무리 작업: 반응의 완결시 반응 혼합물을 DCM(100 ml x 2)로 희석하고, 물(200 ml x 2) 및 염수(100 ml)로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에서 농축하여 연황색 액체로서 화합물 6(75g, 85%)을 수득하였다(B 064-042A1)
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 0.9 (t, 3H), 1.1 (m, 17H), 1.3 (m, 1H) , 1.5 (m, 2H), 1.8 (m, 1H), 2.3 (m, 1H), 3.8 (m, 2H), 4.2 (m, 2H), 4.4 (s, 1H) , 7.4 (m, 6H), 7.7 (m, 4H) (도 52).
단계 6
LNB 참조 No:B 064-049A2
과정: 2-프로판올(2.5 리터(lit)) 및 디에틸 에테르(1.25 리터) 중의 화합물 6(75 g, 161.63 밀리몰)의 현탁액에 pTSA(3g, 16.163 밀리몰)를 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 72 시간 동안 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 10% EtOAc, 생성물 Rf=0.4).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 NaHCO3 용액으로 반응이 멈추게 하고 농축하였다. 잔류물을 DCM(300 ml x 2)로 추출하고, 물(200 ml x 2) 및 염수(100 ml)로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에서 농축하며, 실리카 겔(100-200 메시) 크로마토그래피 상에서 정제하여 연황색 액체로서 화합물 7(27 g, 43%)을 수득하였다(B 064-049A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 0.8 (t, 3H), 1.1 (s, 9H), 1.3 (m, 2H), 1.6 (m, 2H), 2.3 (m, 2H), 3.9 (m, 1H), 4.2 (m, 2H), 7.4 (m, 6H), 7.7 (m, 4H). LCMS : 79% 순도, m/z = 251 (m+1). (도 53-55).
단계 7:
LNB 참조 No: B064-051A2
과정: DCM(100 ml)중의 화합물 7(12 g, 31.578 밀리몰)의 현탁액에 DMP(16 g, 34.736 밀리몰)를 0℃에서 첨가하고, 출발물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 30분간 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 10% EtOAc, 생성물 Rf=0.5).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 DCM(100 ml)으로 희석하고 NaHCO3 용액, 물(200 ml x 2 및 염수(100 ml)로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에서 농축하며, 이어서 실리카 겔(100-200 메시) 크로마토그래피에 의해 정제하여 연황색 액체로서 단편 A(8 g, 75%)를 수득하였다(B 064-051A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 0.8 (t, 3H), 1.1 (s, 9H), 1.3 (m, 2H), 1.6 (m, 2H) , 2.5 (m, 2H), 3.9 (m, 1H), 7.4 (m, 6H), 7.7 (m, 4H), 9.1 (s, 1H) LCMS : 75% 순도, m/z = 379 (m+1) (도 56-58).
단계 8:
LNB 참조 No: GK-PHM-030A1
과정: 클로로포름(100 ml) 중의 화합물 8(25 g, 12.26 밀리몰)의 교반된 용액에 브롬(30 ml, 631 밀리몰)을 적가하고, RT에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 이를 감압하에서 농축하고, 잔류물을 에탄올(200 ml)에 용해시키고, KOH(90 g)를 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 80℃에서 3 시간 동안 교반하였다(페트 에테르 중의 20% EtOAc), Rf=0.6).
마무리 작업: 반응 혼합물을 감압하에서 농축하고, 얻어진 조 혼합물을 6N HCl(30 ml)로 산성화시키고, 에틸 아세테이트(350 ml)로 추출하였다. 유기층을 물(100 ml) 및 염수(100 ml)로 세척하여, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에서 증발시켜 연갈색 오일로서 화합물 9(18 g, 78%)를 수득하였다(GK-PHM-030A1). 이는 어느 추가의 정제 없이 다음 단계에서 직접적으로 사용되었다.
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 1.3 (m, 9H), 1.5 (m, 2H), 1.6-1.7 (m, 2H), 2.0 (m, 1H), 2.2 (m, 1H), 2.4 (m, 2H). 질량: m/z = 183 (m+1) (도 59-61).
단계 9:
LNB 참조 No: GK-PHM-032A2
과정: 메탄올(200 ml) 중의 화합물 9(18 g, 98.9 밀리몰)의 교반된 용액에 SOCl2(23.5 g, 197.8 밀리몰)를 0℃에서 적가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 밤새 환류시켰다(페트 에테르 중의 20% EtOAc, Rf:0.7).
마무리 작업: 반응 혼합물을 농축하고, DCM(200 ml)으로 추출하고, 이어서 NaHCO3 용액, 물(200 ml x2) 및 염수(100 ml)로 세척하고, 이어서 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에서 농축하여 조 화합물을 수득하고, 이어서 이를 실리카 겔(100-200 메시)을 이용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여, 연황색 오일로서 단편 B(14 g, 72%)를 수득하였다(GK-PHM-032A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 1.3 (m, 7H), 1.4 (m, 2H), 1.5 - 1.6 (m, 2H), 1.7 (m, 2H), 2.1 (m, 1H), 2.2 (m, 1H), 2.3 (m, 2H). IR ( cm -1 ): 634, 704, 741, 724, 1016, 1172, 1196, 1240, 1362, 1436, 1621, 1739, 2117, 2856, 2930, 3305, 3457. 질량: m/z = 197 (m+1) (도 62-64).
단계 10:
LNB 참조 No: B 064-015A2
과정: 벤젠(400 ml) 중의 화합물 10(250 mg, 2.906 몰)의 용액에 피리딘(262 ml, 3.196 몰), 이어서 SOCl2(225 ml, 3.196 몰)를 0℃에서 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 밤새 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 20% EtOAc, 생성물 Rf=0.5).
마무리 작업: 반응 완결시, 반응 혼합물을 얼음 냉각 물로 반응을 멈추게 하고, EtOAc(200 ml x 3)로 추출하며, 조합된 유기층을 NaHCO3 용액, 물(300 ml x 2) 및 염수(200 ml)로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에서 농축하여 30% 수율로 화합물 11(100 g)을 수득하였다.
특성화: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.2 (S, 2H), 4.3 (s, 2H) (도 65-66).
단계 11:
LNB 참조 No: B 064-064A2
과정: 무수 DMF(70 ml) 중의 분획 B(7.54 g, 38.461 밀리몰)의 용액에 NaI(7.49 g, 49.99 밀리몰), Cs2CO3(16.28 밀리몰) 및 CUI(9.52 g, 49.99 밀리몰)를 0℃에서 첨가하고, 20분 동안 교반하였다. 이어서 화합물 11(4 g, 38.461 밀리몰)을 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 밤새 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 30% EtOAc, 생성물 Rf=0.3).
마무리 작업: 반응이 완결시, 반응 혼합물을 NH4Cl 용액(100 ml)으로 처리하여 반응이 멈추게 하고, 디에틸 에테르(200 ml x 3)로 추출하며, 조합된 유기 층을 물(100 ml x 20) 및 염수(100 ml)로 세척하고, 이어서 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에서 농축시켜 조 화합물을 수득하고, 이를 실리카 겔(100 - 200 메시) 크로마토그래피로 추가로 정제하여, 무색 오일로서 화합물 12(4.5 g, 43%)를 수득하였다(B 064-064A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , DMSO ) δ: 1.2 (m, 8H), 1.4 (m, 2H), 1.5 (m, 2H), 2.1 (m, 2H), 2.3 (m, 2H), 3.2 (m, 2H), 3.6 (s, 3H), 4.1 (m, 2H), 5.1 (bs, 1H). LCMS : 42% 순도, m/z = 265 (m+1) (도 67-69).
단계 12:
LNB 참조 No: B 064-114A2
과정: Pd/BaSO4(250 mg)을 무수 메탄올(50 ml) 중의 화합물 12(5 g)의 교반된 용액에 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 H2 압력하에서 6시간 동안 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 30% EtOAc, 생성물 Rf=0.4).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고, 메탄올(20 ml x 3)로 세척하며, 여액을 감압하에서 농축하여 조 화합물을 수득하고, 이를 추가로 실리카 겔(100-200 메시) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 68% 수율로 화합물 13(3.6 g)을 수득하였다(B 064-114A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 1.3 (m, 10H), 1.6 (m, 2H), 2.1 (m, 2H), 2.3 (m, 2H), 2.8 (m, 2H), 3.7 (s, 3H), 4.3 (m, 2H), 5.3 - 5.5 (m, 2H, J= 7.1), 5.5 - 5.7 (m, 2H, J=6.4), LCMS : 94.75% 순도, m/z = 268 (m+1) (도 70-72).
단계 13:
LNB 참조 No: B 064-123A2
과정: DCM(60 ml) 중의 화합물 13(4.1 g, 15.29 밀리몰)의 교반된 용액에 PPh3(5.21 g, 19.87 밀리몰), 이어서 트리클로로아세토니트릴(4.4 g, 30.59 밀리몰)을 0℃에서 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 6시간 동안 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 30% EtOAc, 생성물 Rf=0.8).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 DCM(50 ml)로 희석하고, 물(100 ml x 2) 및 염수 (100 ml)로 세척하며, 이어서 감압하에서 농축하여 조 화합물을 수득하고, 이를 실리카 겔(100-200 메시) 컬럼 크로마토그래피로 추가로 정제하여 무색 오일로서 70% 수율로 단편-C(3.1 g)를 수득하였다(B 064-123A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 1.2 (m, 10H), 1.6 (m, 2H), 2 (m, 2H), 2.3 (m, 2H), 2.9 (m, 2H), 3.7 (s, 3H), 4.1 (m, 2H), 5.3-5.5 (m, 2H J = 10.6), 5.7 (m, 2H J = 10.8). LCMS : 78% 순도, m/z = 286 (m+1) (도 73-76).
단계 14:
LNB 참조 No: B 064-055A1
과정: 무수 THF(35 ml) 중의 화합물 14(2.55 g, 18.382 밀리몰)의 교반된 용액에 0℃에서 EtMgBr(6.8 ml, 20.22 밀리몰)을 첨가하고, 20분간 교반하고, 이어서 무수 THF(35 ml)중의 단편 A(6.9 g, 18.382 밀리몰)를 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 밤새 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 20% EtOAc, 생성물 Rf=0.5).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 NH4Cl 용액으로 처리하여 반응을 멈추게 하고, EtOAc(100 ml)로 추출하여, 물(100 ml x 2) 및 염수(100 ml)로 세척하고, 감압하에서 용매를 제거하여 갈색 오일로서 화합물 15(9.3g, 98%)를 수득하였다(B 064-055A1).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 0.2 (s, 9H), 0.8 (t, 3H), 1.1 (s, 9H), 1.3 (m, 2H), 1.6 (m, 3H), 1.9 (m, 1H), 2.3 (m, 2H), 3.3 (m, 2H) ,3.9 (m, 1H), 5 (bs, 1H), 7.4 (m, 6H), 7.7 (m, 4H). LCMS : 52.6% 순도, m/z = 531 (m+1) (도 77-79).
단계 15:
LNB 참조 No:B 064-057A2
과정: 무수 THF(50 ml) 중의 화합물 15(4.6 g, 8.949 밀리몰)의 교반된 용액에 TBAF(22 ml, 22.37 밀리몰)를 0℃에서 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 밤새 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 50% EtOAc, 생성물 Rf=0.5).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 물로 처리하여 반응이 멈추게 하고, EtOAc(100 ml)로 추출하여, 유기 층을 물(100 ml x 2) 및 염수(100 ml)로 세척하여 감압하에서 증발시켜 갈색 오일로서 화합물 16(2.45 g, 64%)을 수득하였다(B 064-057A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , DMSO ) δ: 0.9 (t, 3H), 1.2-1.6 (m, 5H), 2.3 (m, 2H), 2.6 (m, 2H), 3.5 (bs, 1H), 4.4 (m, 1H), 4.6 (m, 1H), 5.6 (m, 1H) (도 80-82).
단계 16:
LNB 참조 No: B 064-125A2
과정: 무수 DMF(10 ml) 중의 화합물 16(0.911g, 4.465 밀리몰)의 교반된 용액에, NaI(0.87g, 5.804 밀리몰), Cs2CO3(1.85g, 5.804 밀리몰) 및 CuI(1.16 g, 5.804 밀리몰)를 0℃에서 첨가하고, 20분간 교반하며, 이어서 무수 DMF(10 ml) 중의 단편-C(1.27 g, 4.465 밀리몰)를 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 밤새 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 50% EtOAc, 생성물 Rf=0.5).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 NH4Cl 용액으로 처리하여 반응을 멈추게 하고, 디에틸 에테르(50 ml x 2)로 추출하며, 물(100 ml x 2) 및 염수(100 ml)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키며, 감압하에서 농축시켜 조 생성물을 수득하고, 이를 추가로 실리카 겔(100-200 메시) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 연갈색 오일로서 화합물 17(1.22 g, 60%)을 수득하였다(B 064-125A2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 0.9 (t, 3H), 1.3 (m, 10H), 1.6 (m, 10H), 2.1 (m, 2H), 2.3-2.4 (m, 3H), 2.7-2.8 (m, 3H), 3.1 (m, 2H), 3.7 (s, 3H), 3.8 (bs, 1H), 4.5 (bs, 1H), 5.3-5.6 (m, 4H, J = 6.4). LCMS : 90% 순도, m/z = 473 (m+1) (도 83-85).
단계 17:
LNB 참조 No: B 064-131A2-Fr-2
과정: 무수 메탄올(18 ml)중의 화합물 17(730 mg)의 교반된 용액에 CaCO3(140 mg)상의 Pd를 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 H2 압력하에서 실온에서 1 시간 동안 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 30% EtOAc, 생성물 Rf=0.5).
마무리 작업: 반응의 완결시, 반응 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고, 메탄올(20 ml x 2)로 세척하며, 감압하에서 30℃에서 농축하여 화합물 18(1.2 g)을 수득하고, 이를 준비된(preparative) HPLC로 추가 정제하여 무색 오일로서 10% 수율로 순수 화합물 18(120 mg)을 수득하였다(B 064-131A2-Fr-2).
특성화: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3 ) δ: 0.9 (t, 3H) 1.3 (m, 8H) 1.6 (m, 9H) 2.1 (m, 5H) 2.3 (m, 4H) 2.5 (m, 3H) 2.8-3.0 (m, 3H) 3.6 (s, 3H) 4.5 (m, 1H) 5.4 (m, 6H) 5.7-5.8 (m, 2H) 6.3-6.5 (m, 1H J = 11). LCMS : 99% 순도, m/z = 461 (m+1) (도 86-88).
단계 18:
LNB 참조 No: B 064-136A2
과정: LiOH.H2O(55 mg, 1.3 밀리몰)을 메탄올(10 ml) 및 물(5 ml) 중의 화합물 18(120 mg, 0.26 밀리몰)의 교반된 용액에 첨가하고, 출발 물질이 TLC 상에서 사라질 때까지 RT에서 밤새 교반하였다(용매 시스템 페트 에테르 중의 30% EtOAc, 생성물 Rf=0.1).
마무리 작업: 반응의 완결시, 용매를 감압하에서 30℃에서 증류하고, 이어서 에테르. HCl 용액으로 산성화하고, 농축하여 160 mg의 조 생성물을 수득하고, 이를 추가로 준비된 HPLC로 정제하여 무색 오일의 D046 -124(11 mg, 9%)를 수득하였다.
특성화: LCMS: 98.7% 순도, m/z=445(m-1)( 도 89-90).
하나 이상의 현재 바람직한 실시형태가 실시예를 통해 기술되었다. 본 분야에 숙련된 자에게는 다수의 변화 및 개질이 청구 범위에 정의된 본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 가능하다는 것이 명백할 것이다.
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<210> 1
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Claims (107)
- 하기 식(I)의 화합물:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 1 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 화합물:
- 제 1 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 화합물 D046-124인 것을 특징으로 하는 화합물:
- 대상에 하기 식(I)의 화합물을 결장직장암(colorectal cancer)(CRC)을 치료하거나 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상의 결장직장암(CRC)을 치료하거나 예방하는 방법:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 6 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 6 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 D046-124인 것을 특징으로 하는 방법:
- 대상에 하기 식(I)의 화합물을 종양의 성장을 억제하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상의 종양 성장 억제 방법:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 11 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 11 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 D046-124인 것을 특징으로 하는 방법:
- 대상에 하기 식(I)의 화합물을 대상의 위장(gastrointestinal)(GI) 질환을 치료, 예방 또는 경감시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상의 위장(GI) 질환을 치료, 또는 예방하는 방법:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 16 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 16 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 D046-124인 것을 특징으로 하는 방법:
- 대상에 하기 식(I)의 화합물을 염증 및/또는 염증-관련된 질환을 예방하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상에 염증 및/또는 염증-관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 21 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 21 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 D046-124인 것을 특징으로 하는 방법:
- 대상에 하기 식(I)의 화합물을 히드록실화 다중불포화 초 긴-쇄 지방산(hPULCFA) 결핍 질환(hPDD)을 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상의 히드록실화 다중불포화 초 긴-쇄 지방산(hPULCFA) 결핍 질환(hPDD)을 치료 또는 예방하는 방법:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 26 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 26 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 D046-124인 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 화합물의 상기 양이 hPULCFAs 수준을 상승시키거나 회복시키는데 유효한 것을 특징으로 하는 방법.
- 대상의 CRC 건강 상태 또는 건강 상태에서의 변화를 진단하거나, 대상에서 CRC를 진단하거나 또는 CRC의 위험을 진단하기 위한 방법으로서,
a) 대상으로부터의 샘플을 분석하여 상기 샘플 내의 하기 식(I)의 화합물의 양을 정량하는 단계;
b) 대상의 샘플에서의 상기 화합물의 정량된 양을 하나 이상의 참조 샘플 내의 상기 화합물의 대응하는 양에 비교하여 대상 샘플 내의 상기 화합물의 증감의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및
c) 대상의 CRC 건강 상태 또는 건강 상태에서의 변화를 진단하거나 대상에서의 CRC 또는 CRC의 위험을 진단하기 위해 상기 증감을 사용하는 단계를 포함하는,
대상의 CRC 건강 상태 또는 건강 상태에서의 변화를 진단하거나, 대상에서 CRC를 진단하거나 또는 CRC의 위험을 진단하기 위한 방법:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 32 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 33 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 32 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 대상으로부터의 혈액 샘플이고, 단계 a)에서 질량 분석법에 의하여 분석되어 상기 화합물에 대한 정밀한 질량 강도 데이터를 얻고, 상기 정밀한 질량 강도 데이터를 단계 b)에서 하나 이상의 참조 샘플로부터 얻어진 대응 하는 정밀한 질량 강도에 비교하여 정밀한 질량 강도에서의 증감을 확인하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 대상으로부터의 혈액 샘플이고, 단계 a)에서 탠덤(tandem) 질량 분석법, NMR 또는 ELISA에 의해 분석되는 방법.
- 대상에서 hPULCFA 결핍 질환(hPDD)을 진단하는 방법으로서,
a) 대상으로부터의 샘플을 분석하여 상기 샘플 내의 하기 식(I)의 화합물의 양을 정량하는 단계;
b) 대상 샘플 내의 상기 화합물의 정량된 양을 하나 이상의 참조 샘플 내의 상기 화합물의 대응하는 양에 비교하여 대상 샘플 내의 상기 화합물의 양에 있어서의 증감의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및
c) 대상 내의 hPDD를 진단하기 위해 상기 증감을 사용하는 단계를 포함하는, 대상에서 hPDD를 진단하는 방법:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 38 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 38 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 38 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 대상으로부터의 혈액 샘플이고, 단계 a)에서 질량 분석법에 의하여 분석되어 상기 화합물에 대한 정밀한 질량 강도 데이터를 얻고, 상기 정밀한 질량 강도 데이터를 단계 b)에서 하나 이상의 참조 샘플로부터 얻어진 대응 하는 정밀한 질량 강도에 비교하여 정밀한 질량 강도에서의 증감을 확인하는 방법.
- 제 38 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 대상으로부터의 혈액 샘플이고, 단계 a)에서 탠덤(tandem) 질량 분석법, NMR 또는 ELISA에 의해 분석되는 방법.
- 염증 또는 염증 질병을 진단하는 방법으로서,
a) 대상으로부터의 샘플을 분석하여 샘플 내의 하기 식(I)의 화합물의 양을 정량하는 단계;
b) 대상 샘플 내의 상기 화합물의 정량된 양을 하나 이상의 참조 샘플 내의 상기 화합물의 대응하는 양에 비교하여 대상 샘플 내의 상기 화합물의 양에 있어서의 증감의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및
c) 대상 내의 염증 또는 염증 질병을 진단하기 위해 상기 증감을 사용하는 단계를 포함하는,
염증 또는 염증 질병을 진단하는 방법:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 44 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 44 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 44 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 대상으로부터의 혈액 샘플이고, 단계 a)에서 질량 분석법에 의하여 분석되어 상기 화합물에 대한 정밀한 질량 강도 데이터를 얻고, 상기 정밀한 질량 강도 데이터를 단계 b)에서 하나 이상의 참조 샘플로부터 얻어진 대응하는 정밀한 질량 강도에 비교하여 정밀한 질량 강도에서 증감을 확인하는 방법.
- 제 44 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 대상으로부터의 혈액 샘플이고, 단계 a)에서 탠덤(tandem) 질량 분석법, NMR 또는 ELISA에 의해 분석되는 방법.
- 제 44 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 염증이 IBD, 크론병, 및/또는 대장염으로부터 선택된 GI 질환에 의해 야기되거나, 염증 질병이 IBD, 크론병, 및/또는 대장염으로부터 선택된 GI 질환을 포함하는 방법.
- 항염증 약물의 효과를 모니터링하는 방법으로서,
a) 상기 항-염증 약물을 처리한 대상으로부터의 샘플을 분석하여 샘플 내의 하기 식(I)의 화합물의 양을 정량하는 단계; 및
b) 대상 샘플 내의 상기 화합물의 정량된 양을 하나 이상의 참조 샘플 내의 상기 화합물의 대응하는 양에 비교하여 대상 샘플 내의 상기 화합물의 양에 있어서의 증감의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 대상 샘플 내의 상기 화합물의 양의 증감이 상기 대상에서의 항-염증에 의해 야기된 효과를 나타내는 항염증 약물의 효과를 모니터링하는 방법:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 51 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 51 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
- 제 51 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 대상으로부터의 혈액 샘플이고, 단계 a)에서 질량 분석법에 의하여 분석되어 상기 화합물에 대한 정밀한 질량 강도 데이터를 얻고, 상기 정밀한 질량 강도 데이터를 단계 b)에서 하나 이상의 참조 샘플로부터 얻어진 대응하는 정밀한 질량 강도에 비교하여 정밀한 질량 강도에서의 증감을 확인하는 방법.
- 제 51 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 대상으로부터의 혈액 샘플이고, 단계 a)에서 탠덤(tandem) 질량 분석법, NMR 또는 ELISA에 의해 분석되는 방법.
- 제 51 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-염증 약물로 처리된 대상이 염증 및/또는 염증 증상 또는 질병을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약으로 표지된 화합물.
- 검출 시약으로 표지된 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 이들의 두 개 이상의 혼합물을 포함하는 표준물(standard).
- 제 59 항에 있어서, 상기 검출 시약이 안정한 동위 원소 또는 방사성 동위 원소, 시험관 내 또는 생체 내에서 검출 가능한 효소 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 표준물.
- 제 59 항 또는 제 60 항에 따른 표준물 및 분석물을 정량화하기 위한 또는 진단 테스트를 수행하기 위한 지시서를 포함하는 키트.
- 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제 및 하기 식(I)의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 62 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 63 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 62 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물:
- 제 62 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 화합물 D046-124인 것을 특징으로 하는 조성물:
- 하기 식(I)에 의해 정의된 두 개 이상의 화합물을 포함하는 조합물:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 67 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 조합물.
- 제 67 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 조합물.
- 제 67 항에 있어서, 상기 두 개 이상의 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조합물:
- 제 67 항에 있어서, 약제학적 조합물, 영양 보충제, 식품성 의약(neutraceutical) 또는 기능성 식품으로 제형화 되는 조합물.
- 하기 구조를 갖고, 대상에서 결장직장암(colorectal cancer)(CRC)을 치료 또는 예방하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 하기 구조를 갖고, 대상에서 결장직장암(colorectal cancer)(CRC)을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 72 항 또는 제 73 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 74 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 72 항 또는 제 73 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 용도:
- 제 72 항 또는 제 73 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 화합물 D046-124인 것을 특징으로 하는 용도:
- 하기 구조를 갖고, 대상에서 종양 성장을 억제하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 하기 구조를 갖고, 대상에서 종양 성장을 억제하기 위한 약제를 제조하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 78 항 또는 제 79 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 80 항에서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 78 항 또는 제 79 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 용도:
- 제 78 항 또는 제 79 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 D046-124인 것을 특징으로 하는 용도:
- 하기 구조를 갖고, 대상에서 위장(GI) 질환을 치료 또는 예방하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 하기 구조를 갖고, 대상에서 위장(GI) 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 84 항 또는 제 85 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 86 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 84 항 또는 제 85 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 용도:
- 제 84 항 또는 제 85 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 D046-124인 것을 특징으로 하는 용도:
- 하기 구조를 갖고, 필요로 하는 대상에서 염증 및/또는 염증-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 하기 구조를 갖고, 필요로 하는 대상에서 염증 및/또는 염증-관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 90 항 또는 제 91 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 92 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 90 항 또는 제 91 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 용도:
- 제 90 항 또는 제 91 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 D046-124인 것을 특징으로 하는 용도:
- 하기 구조를 갖고, 대상에서 히드록실화 다중불포화 초 긴-쇄 지방산(hPULCFA) 결핍 질환(hPDD)을 치료 또는 예방하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 하기 구조를 갖고, 대상에서 히드록실화 다중불포화 초 긴-쇄 지방산(hPULCFA) 결핍 질환(hPDD)을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 하기 식(I)의 화합물의 용도:
여기에서, R은 탄소 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하고; 상기 탄소 쇄 내의 적어도 하나의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된, 히드록시 치환된 C24-C40 직쇄 지방족 그룹을 나타낸다. - 제 96 항 또는 제 97 항에 있어서, R이 C28-C36 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 98 항에 있어서, 상기 쇄 내의 2, 3 또는 4개의 탄소가 히드록시 그룹으로 치환된 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 96 항 또는 제 97 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 그룹의 구조들로부터 선택된 것을 특징으로 하는 용도:
- 제 96 항 또는 제 97 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조의 D046-124인 것을 특징으로 하는 용도:
- 제 96 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 hPULCFA 수준을 향상시키거나 회복시키는데에 유효한 양으로 투여하기 위한 용도.
- 하기 구조로 구성되는 그룹으로부터 선택된 화합물:
- 화합물 D046-124의 합성에서의 중간체로서,
상기 중간체는 하기 구조로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 중간체:
- 다음 단계들을 포함하는 화합물 D046-124의 제조 방법:
(i) 식(II)의 화합물을 식(III)의 화합물과, 식(IV)의 화합물을 생성하는 조건하에서 반응시키는 단계,
(ii) TBDPS 그룹을 제거하여 식(V)의 화합물을 생성하는 단계,
(iii) 식(V)의 화합물을 식(VI)의 화합물과, 식(VII)의 화합물을 생성하는 조건하에서 반응시키는 단계,
(iv) 식(VII)의 화합물을 촉매와, 식(VIII)의 화합물을 생성하는 조건하에서 반응시키는 단계,
(v) 식(VIII)의 화합물의 말단 에스테르 작용기를 카복실 산 그룹으로 가수분해시켜 표제 화합물을 생성하는 단계:
- 제 105 항에 있어서, 표제 화합물을 분리하는 하나 이상의 정제 단계를 추가로 포함하는 방법
- 제 104 항에 있어서, 식(VII)의 화합물이 단계 iv)에서 Pd 촉매의 존재하에서 1 Atm 압력의 수소하에서 탄산 칼슘과 반응하여 선택적으로 삼중 결합을 이중 결합으로 전환시켜 식(VIII)의 화합물을 생성하는 방법.
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