CN110592246A - 一种人肠道菌群定量检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人肠道菌群定量检测方法及应用，人肠道菌群定量检测方法包括以下几个步骤S01、粪便样本采集、存放与标记；S02、粪便样本处理与检测：取粪便样本上清液，加入标定量的内参菌株Sa，采用磁珠法粪便DNA提取试剂盒提取核酸，设置阴性对照组、内参菌株组和若干标准组测定每组浓度后进行荧光PCR检测；S03、检测结果分析：统计检测菌的含量，确定检测粪便样本与健康人群的菌群范围差异，从而评估目标人群的肠道健康情况；上述检测方法应用于检测人体粪便中菌群的含量并与健康人群各菌群参考范围进行比对，以评估人体肠道微生态的健康状况。本发明具有可有效检测肠道菌群的数量进而评估人体肠道健康状况，有助于肠道健康管理等优点。
Description
【技术领域】
本发明涉及微生物检测的技术领域，特别是一种人肠道菌群定量检测方法及应用的技术领域。
【背景技术】
人体肠道内存在大量共生微生物，并通过多种途径影响人体健康，尤其是各种代谢物在人体的健康促进和疾病发生、发展中起着重要作用。肠道微生态研究发现，糖尿病、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、肥胖、抑郁症等疾病均与肠道微生态相关，最新研究发现阿尔兹海默症或与肠道微生物有关，肠道微生态平衡正成为人体健康的重要标志。维持肠道微生态的动态平衡，有助于人体抵御各种疾病的干扰，保持健康状态，维持肠道微生态的平衡主要是维持肠道菌群的数量保持在稳定健康数值范围内。
肠道菌群种类繁多，主要有普拉梭菌、肠球菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、奇异菌属、柔嫩梭菌、真杆菌、肠杆菌、酪酸梭菌、毛螺菌、阿克曼菌、弧菌等。肠杆菌(Enterobacteriaceae)，该菌科为人体肠道内正常菌群，参与人体的代谢及免疫，但该菌属，尤其是大肠杆菌，很大一部分菌为致病菌或条件致病菌，当人体免疫力低下或细菌侵入肠道以外部位时，也可引起疾病多脂饮食，会造成该菌科条件致病茵茵群增加。肠球菌(Enterococcus)，是人及动物肠道中正常菌群的一部分，它不像乳酸菌一样被认为是安全可靠的，当抗生素大量使用或宿主免疫力低下时，宿主与肠球菌之间的共生状态失衡，肠球菌离开正常寄居部位进入其他组织器官，分泌细胞溶解素、明胶酶等毒力因子侵袭破坏宿主组织细胞，引起宿主的非特异性免疫应答。拟杆菌(Bacteroides)，参与人体多种代谢过程，部分菌株被报道具有条件致病性，易引起机体的机会性感染。该菌可调节营养吸收，粘膜免疫，外源物质代谢，及肠粘膜血管的形成及发育等。双歧杆菌(Bifidobacteria)、乳酸菌(Lactic Acid Bacterial，LAB)，均为益生菌，参与机体多种代谢过程，并产乳酸，以双歧杆菌为有益菌的代表，促进肠道蠕动，改善便秘，减少吲哚、亚硝酸胺等致癌物质产生，促进矿物质及维生素D的吸收和利用等，及增强机体免疫功能。同时可将人体无法吸收的胆固醇转变成粪甾醇，从粪便中排出，具有降血脂的功能等等，为人体健康的晴雨表。奇异菌属(Atopobium cluster)从葡萄糖主要的发酵产物是乳酸，其他尚有乙酸和甲酸。产丁酸菌(Butyric Acid Bacterial，BAB)，代表菌：酪酸梭菌(Clostridial clusters CGl)，柔嫩梭菌(Clostridium leptum)，直肠真杆菌(Eubacterium rectale)，普拉氏梭杆菌(F.prausnitzii)。丁酸在肠道健康方面起着十分重要的作用，一方面，为肠粘膜细胞的主要能量来源，一方面抑制肠道中的致病菌，保持肠道菌群平衡，从而预防和治疗肠道疾病方面起至决定性作用。普拉梭菌，作为肠道一种抗炎的细菌，有报道称其可以抵消克罗恩病(Crohn’s Disease)患者体内的异常免疫反应对消化道的损伤。同时，它与8种人体的代谢物质有统计相关性，参与宿主多种代谢过程。毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)能发酵葡萄糖和多种碳水化合物并产生乳酸、乙酸等，还能用来预防结肠炎等疾病。弧菌属(Vibrio)细菌种类多，分布广泛，尤以水中最为常见。引起人类疾病的主要有霍乱弧菌的古典生物型和埃尔托生物型、副溶血性弧菌，不凝集弧菌可引起霍乱样疾病或轻度腹泻。
肠道菌群容易受到饮食习惯、药物、环境等因素干扰，轻微的肠道微生态失衡会导致人体的亚健康状态，也可能会进一步恶化肠道生态系统，导致疾病发生。肠道菌群用于疾病预测和健康管理仍处于初步发展阶段。中华消化杂志提供了关于肠道菌群失调的诊断治疗建议，作为临床医师参考。目前监测方法主要以直接涂片的定性分析和细菌培养的定量检查为主，耗时且难以准确判断。部分研究机构选择以16S、指纹图谱、NGS、甲烷和氢呼气法等进行正常菌群和菌群失调的早期诊断，以期发现可靠的生物标记物，操作较为繁琐，不能有效评估人体肠道健康状况及做好肠道健康管理。
肠道微生物在离体后，若不能进行及时的核酸提取，会导致菌群的数量、种类及丰度发生变化，粪便是提取肠道微生物核酸的来源，因此，可通过及时分析离体粪便中菌群数量即可衡量肠道微生态健康与否。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种人肠道菌群定量检测方法及应用，能够有效检测肠道菌群的数量进而评估人体肠道健康状况，有助于肠道健康管理。
为实现上述目的，本发明提出了一种人肠道菌群定量检测方法，包括以下几个步骤：
S01、粪便样本采集、存放与标记，收集目标人群的待测粪便，取适量的粪便末端作为粪便样本，并将粪便样本放入采集管中加入适量的粪便保存液摇匀，标记粪便样本用户信息；
S02、粪便样本处理与检测：取粪便样本上清液，加入标定量的内参菌株Sa，采用磁珠法粪便DNA提取试剂盒提取核酸，设置阴性对照组、内参菌株组和若干标准组测定每组浓度后进行荧光PCR检测；
S03、检测结果分析：统计检测菌的含量，确定检测粪便样本与健康人群的菌群范围差异，从而评估目标人群的肠道健康情况。
作为优选，所述粪便样本和粪便保存液按W/V为(3～5):1的比例进行混匀。
作为优选，所述PCR检测中使用的荧光物为SYBR荧光染料、Taqman探针染料或分子信标中的一种，PCR检测使用的PCR反应液由2X SYBR PCR预混液反应液、引物1、引物2和去离子水组成。
作为优选，所述引物1和引物2的浓度均为0.1uM。
作为优选，所述标准品组的数量为4且四个标准品组中分别加入阳性质标准品S1、S2、S3和S4。
作为优选，所述阳性质标准品S1、S2、S3和S4的浓度分别为1E7、1E6、1E5、1E4拷贝/微升。
作为优选，所述检测结果分析时应考虑提取过程中提取效率的影响，提取效率根据以下公式进行计算：
其中，Sa计数值为标定量的内参菌株Sa所含菌数，Sa实验定量值为Y值，所述Y值由公式Y＝aX+b计算得到，其中，a为斜率，b为常数，X为PCR扩增Ct值，a、b均可通过扩增软件得到。
作为优选，所述检测菌的含量由公式检测菌含量＝(10^Y)/提取效率计算得到。
本发明还公开上述人肠道菌群定量检测方法的应用，所述人肠道菌群定量检测方法通过检测人体粪便中的普拉梭菌、肠球菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、奇异菌属、柔嫩梭菌、真杆菌、肠杆菌、酪酸梭菌、毛螺菌、阿克曼菌、弧菌的含量并与健康人群各菌群参考范围进行比对，以评估人体肠道微生态的健康状况。
本发明的有益效果：本发明具有可有效检测肠道菌群的数量进而评估人体肠道健康状况，有助于肠道健康管理的优点。
本发明的特征及优点将通过实施例进行详细说明。
【具体实施方式】
本发明一种人肠道菌群定量检测方法，包括以下几个步骤：
S01、粪便样本采集、存放与标记，收集腹泻人群的待测粪便，取1g粪便末端作为粪便样本，并将粪便样本放入采集管中并加入按粪便样本和粪便保存液按W/V为3:1比例的粪便保存液摇匀，标记粪便样本用户信息后待检；
S02、粪便样本处理与检测：取200ul粪便样本上清液，加入10000拷贝数的内参菌株Sa，采用磁珠法粪便DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司DP172)提取核酸，设置阴性对照组、内参菌株组和若干标准组测定每组浓度后进行荧光PCR检测，采用Nanodrop核酸测定仪测定提取总DNA浓度；
S03、检测结果分析：统计检测菌的含量，确定检测粪便样本与健康人群的菌群范围差异，从而评估目标人群的肠道健康情况。
S02中PCR检测使用的荧光物为SYBR荧光染料、Taqman探针染料或分子信标中的一种，PCR检测使用的PCR反应液由2X SYBR PCR预混液反应液、引物1、引物2和去离子水组成，引物1和引物2的浓度均为0.1uM，配置的每反应管中PCR反应液的体积为20ul，其中，20ul的PCR反应液具体为2X SYBR PCR预混液反应液10ul、1ul的引物1、1ul的引物2和6ul的去离子水。
引物1和引物2的序列分别如下表所示：
S02中设置的阴性对照组、内参菌株组和若干标准组采用控制变量法设置，具体设置方法为在每个反应管中分别加入相同的采用磁珠法粪便DNA提取试剂盒提取的核酸2ul，其中，阴性对照组的反应管中加入水，四个标准组的反应管中分别加入等量的阳性质标准品S1、S2、S3和S4，阳性质标准品S1、S2、S3和S4的浓度分别为1E7、1E6、1E5、1E4拷贝/微升。
上述的阴性对照组、内参菌株组和四个标准组的反应管，在反应板加入样本后，盖紧管盖并做好标记，放入离心机内以2000rpm转速离心30s，离心后放入荧光定量仪，并按下列反应条件进行PCR扩增：95℃温度下3分钟进行1个循环；在95℃温度下15秒，之后60℃温度下45秒并按此进行40个循环(每个循环结束后读取各反应管中的荧光值)，其中，四个加入阳性标准品的标准组。
检测结果分析时应考虑提取过程中提取效率的影响，提取效率根据以下公式进行计算：
其中，Sa计数值为S02中标定量的内参菌株Sa所含菌数，Sa实验定量值为Y值，所述Y值由公式Y＝aX+b计算得到，其中，a为斜率，b为常数，X为PCR扩增Ct值，a、b均可通过扩增软件得到，最终检测菌的含量由公式检测菌含量＝(10^Y)/提取效率计算得到。
检测结果中，阳性标准品应符合标准曲线线性要求，阴性对照无扩增或Ct值＜38，扩增荧光曲线应具有明显的S型曲线，否则视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
检测粪便样本中1E+02拷贝/ul≤待测细菌DNA≤9E+08拷贝/ul，测定结果有效，可直接用于报告结果。
如果样本中待测细菌DNA＞1E+09拷贝/ul DNA时，应做适当稀释，使检测结果落入有效范围内。
检测样本Ct≤30可用于结果分析，Ct>30的样本建议重复，重复结果Ct>30者为低于检测线。
结果分析如下：
结果显示，腹泻人群的普拉梭菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、柔嫩梭菌、毛螺菌等出现不同程度的失衡，以上多种细菌可通过分泌产物参与抗炎症反应，非正常的偏离结果可能会导致有害菌群的生长、定植，受检人群的肠道检测数据对个人的健康管理有一定的参考指导意义，可通过人为的调整饮食或补充相关益生菌产品来增加肠道菌群多样性和有益菌数量，促进身体的健康恢复。
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：包括以下几个步骤：
S01、粪便样本采集、存放与标记：收集目标人群的待测粪便，取适量的粪便末端作为粪便样本，并将粪便样本放入采集管中加入适量的粪便保存液摇匀，标记粪便样本用户信息；
S02、粪便样本处理与检测：取粪便样本上清液，加入标定量的内参菌株Sa，采用磁珠法粪便DNA提取试剂盒提取核酸，设置阴性对照组、内参菌株组和若干标准组测定每组浓度后进行荧光PCR检测；
S03、检测结果分析：统计检测菌的含量，确定检测粪便样本与健康人群的菌群范围差异，从而评估目标人群的肠道健康情况。
2.如权利要求1所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述粪便样本和粪便保存液按W/V为(3～5):1的比例进行混匀。
3.如权利要求1所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述PCR检测中使用的荧光物为SYBR荧光染料、Taqman探针染料或分子信标中的一种，PCR检测使用的PCR反应液由2X SYBR PCR预混液反应液、引物1、引物2和去离子水组成。
4.如权利要求3所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述引物1和引物2的浓度均为0.1uM。
5.如权利要求3所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述标准品组的数量为4且四个标准品组中分别加入阳性质标准品S1、S2、S3和S4。
6.如权利要求5所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述阳性质标准品S1、S2、S3和S4的浓度分别为1E7、1E6、1E5、1E4拷贝/微升。
7.如权利要求6所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述检测结果分析时应考虑提取过程中提取效率的影响，提取效率根据以下公式进行计算：
其中，Sa计数值为标定量的内参菌株Sa所含菌数，Sa实验定量值为Y值，所述Y值由公式Y＝aX+b计算得到，其中，a为斜率，b为常数，X为PCR扩增Ct值，a、b均可通过扩增软件得到。
8.如权利要求7所述的人肠道菌群定量检测方法，其特征在于：所述检测菌的含量由公式检测菌含量＝(10^Y)/提取效率计算得到。
9.如权利要求1-8任一项所述的人肠道菌群定量检测方法的应用，其特征在于：所述人肠道菌群定量检测方法通过检测人体粪便中的普拉梭菌、肠球菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、奇异菌属、柔嫩梭菌、真杆菌、肠杆菌、酪酸梭菌、毛螺菌、阿克曼菌、弧菌的含量并与健康人群各菌群参考范围进行比对，以评估人体肠道微生态的健康状况。
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