CN108690864A - 一种粪便样本中菌群稳态评价方法及在结直肠癌筛查中的应用 - Google Patents

一种粪便样本中菌群稳态评价方法及在结直肠癌筛查中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种个体粪便样本中菌群平衡关系指标的计算方法，及其在结直肠癌(CRC)中的筛查、诊断或辅助诊断中的应用。通过提取粪便中细菌的DNA测序获得细菌种类和数量的特征，并以多种细菌的数量比值特征为基础进行CRC的诊断。与目前已用于临床或申请专利的无创性筛选CRC的方法相比，本发明完全无创，而且能更准确的诊断CRC。分析结果显示，具核梭杆菌Fn与双歧杆菌Bb数量的比值(Fn/Bb)对于筛查出CRC具有较高的敏感度和特异性，分别达到84.6％和92.3％(AUC＝0.911)。进一步联合具核梭杆菌Fn与柔嫩梭菌Fp数量的比值(Fn/Fp)提高了对CRC的诊断价值，其受试者工作特征曲线的曲线下面积(Area Under Curve，AUC)达到了0.943。此外，Fn/Bb和Fn/Fp数量比值的联合筛查I期CRC具有60％的特异性和90％的敏感性。

Description

一种粪便样本中菌群稳态评价方法及在结直肠癌筛查中的 应用
技术领域
本发明涉及结肠直肠癌(Colorectal cancer，CRC)体外诊断领域，本发明提供了一种指示个体粪便样本中菌群平衡关系的指标菌组合及其计算方法，用于无创性诊断和筛查结直肠癌
背景技术
结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，根据WHO报道，结直肠癌是男性第三位和女性第二位常见的恶性肿瘤。近年来在我国的发病率和死亡率不断攀升，每年新增病例已超过17万人，死亡近10万人，发病率位居我国恶性肿瘤第三。
早期结直肠癌不易发现，绝大多数患者在出现便血、腹痛等症状三个月到半年后才到医院就诊。届时癌细胞已扩散甚至向远处转移，失去了最佳的手术治疗时机。近年尽管诊疗技术不断发展，但由于缺乏有效的早期筛查方法，患者术后5年生存率并无明显改善。目前，粪便隐血试验(FOBT)是结直肠癌无创普查的主要途径，进而筛选出高危人群进行肠镜检查。然而FOBT缺乏特异性，初筛顺应性及高危人群的肠镜受检率仅30％-40％，疾病检出率约19％左右，有待进一步提高。利用无创的标志物对人群进行筛查，可缩小肠镜检查人数且进一步提高肠镜的特异性及灵敏度，对于早期诊断结直肠癌具有重要的临床意义。
具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，Fn)是重要的结直肠癌致病的相关细菌，与结直肠癌的两种癌前病变：炎性肠病(IBD)及结肠腺瘤密切相关，该菌在肠道中数量的变迁可以预测肿瘤由良性向恶性转化的发展趋势；粪便或肠道组织中Fn菌的数量增多可以作为肿瘤微生物标志物对结直肠癌患者进行诊断。
益生菌对肠道稳态起重要作用。健康个体肠道的益生菌和条件致病菌保持数量平衡。但当机体内环境变化时，菌群平衡失控。柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii，Fp)菌和双歧杆菌(Bifidobactcrium，Bb)为人类肠道中最重要的益生菌。结直肠癌患者与健康人群相比，表现出明显的以益生菌数量减少为特征的肠道菌群稳态失衡现象。
我们的研究证实了致癌细菌Fn对Fp，Bb等益生菌具有较强的拮抗作用，且结直肠癌患者体内Fn与Fp菌数量呈负相关。基于以上发现，我们选用这三个种属的细菌(Fn、Fp、Bb菌)作为指标菌组合，计算肿瘤致病细菌与益生菌的数量比值并进行综合分析，结果显示Fn/Bb和Fn/Fp比值联合具有良好的诊断结直肠癌(AUC＝0.943)和良性腺瘤(AUC＝0.916)的能力，尤其对区分早期结肠癌(I-II期)与良性腺瘤，诊断能力达AUC＝0.849。表明Fn/Bb+Fn/Fp联合诊断可作为结直肠癌早期诊断的一种非侵入性指标。
发明内容
本发明的目的是提供人粪便样本中指示肠道菌群稳态的标志物性微生物组合及菌群稳态计算方法，并应用于结直肠癌的早期筛查和辅助诊断。
本发明采取的技术方案是：①确定Fn、Fp、Bb菌为肠道菌群稳态的微生物指标菌；②根据细菌的16S rDNA基因序列设计三个菌属的特异性引物或其互补rRNA序列特异杂交的核酸探针；③提取细菌基因组DNA，应用实时荧光定量PCR反应测定三个菌群的数量；④根据样本中上述三个菌群的绝对含量，计算Fn/Fp值和Fn/Bb比值；⑤联合Fn/Fp+Fn/Bb，根据ROC曲线，设定诊断的cutoff值，预测样本提供者肠道菌群是否失衡及患结直肠癌的可能性。
本发明的有益效果是：
1、提供简单的仅有三种菌的微生物指标组合，成本低廉，具有良好的肠道健康筛查和临床辅助诊断推广价值；
2、提供简单的比值计算方法，可以高灵敏度和高特异性诊断结直肠癌。
3、本方法还可以区分癌前病变与早期结直肠癌；用于早期结直肠癌诊断及筛查。
附图说明
图1为结直肠癌患者与对照组人群粪便微生物标志物丰度检测。
图2为微生物标志物对结直肠癌的诊断价值。
图3为微生物标志物对结直肠癌的早期诊断价值。
图4为微生物标志物区分早期结直肠癌(I+II期)和良性结直肠肿瘤(BCD)。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下述实验中所使用的微生物指标菌为：具核梭杆菌(F.nucleatum，Fn)、柔嫩梭菌(F.prausnitzii，Fp)菌、双歧杆菌(Bifidobacterium，Bb)。
下述实验中所使用的微生物标志物为细菌定量比值Fn/Bb，Fn/Fp，联合比值Fn/Bb+Fn/Fp。
下述实验中所使用对照人群为三组：非胃肠道肿瘤组(Non-gastrointestinalcancer，NGC)，良性结直肠疾病组(Benign colon disease，BCD)，健康人(Healthysubjects，HS)组。
数据分析：计数结果应用统计软件SPSS16.0进行分析，独立t检验或Wilcoxon t检验和Mann-Whitney U检验；通过受试者工作特征曲线(receiver operatorcharacteristic curve，ROC)判断微生物标志物在结直肠癌诊断中的灵敏度和特异度，通过多元logistic回归分析寻找最佳组合。P＜0.05为差异有统计学意义
实施案例1：粪便样本总DNA提取
1、样本收集：本研究所采集的粪便标本包含215例CRC，100例NGC，156例HS。178例BCD。215例CRC患者中早期患者97名：I期CRC 38例，II期CRC 59例。在收集每一例患者的标本及背景信息前均与患者签订知情同意书从而获得使用其信息作为研究许可。
215例CRC患者平均年龄为61.2岁，年龄范围22-93岁，其中男性118例，女性97例；178例BCD患者平均年龄54.2岁，年龄范围31-81岁，其中男性86例，女性92例；100名NGC患者平均年龄为58.4岁，年龄范围34-73岁，其中男性48例，女性52例；156例HS平均年龄为48.6岁，年龄范围20-78岁，其中男性70例，女性86例。
标本与病例筛选标准为：①所有癌症患者均经过组织病理学检测；②所有的粪便标本均采集自确诊后手术前时期；③患者在过去三个月内未使用过抗生素药物。样品用干净的标本收集杯收集后立即冻存于-80℃。
本研究中所使用CRC患者均通过活检组织学确诊其罹患CRC，按照美国癌症联合会AJCC第7版标准进行TNM分期。BCD患者的诊断是根据标准的内窥镜，组织学和X光射线检查确诊的。
2、粪便样本菌群总DNA的提取：按总基因组抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，DP328)常规操作提取粪便总基因组DNA，将提取的核酸用紫外分管光度计(NanoDrop 2000，Thermo Fisher Scientific)测定其浓度。
实施案例2：微生物指标菌细菌定量分析
1、标准品的制作：以Fn标准菌株ATCC25586，Fp标准菌株ATCC27766，Bb标准菌株BB-12的细菌DNA为标准品，进行常规PCR反应。PCR反应体系25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 1μL，5μmol/L上下游引物各2μL，DNA模板2μL，DNA Taq酶(5U/μL)0.2·L，H2O15.3μL。扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次。
将以上3种细菌的PCR扩增产物纯化回收后分别作为目的DNA片段，常规克隆法连接至pGEM-T载体上，重组质粒转化至感受态菌DH5a中，经蓝白斑筛选，得到阳性克隆后，制备质粒，质粒经PCR鉴定及测序正确后，即可作为标准品。
2、标准曲线的建立：测定质粒标准品浓度，利用Avogadros常数(1摩尔＝6.022×1023拷贝数)计算出溶液中质粒拷贝数，为制作标准品原液。系列1/2浓度梯度稀释的标准品原液为模版，常规法进行荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。
3、qPCR定量：利用480II(Roche)检测系统对样本进行指标菌和内参照的扩增和定量检测。常规20μL反应体系包括：10μL 2×SYBRGreen PCR MasterMix(GenStar)，1μL上下游引物(5μmL/L)，2μL DNA和6μL H2O。反应程序为：预变性95℃5Min；变性95℃5S；退火是56℃10S；延伸72℃15S，40个循环，然后进行熔解曲线分析：熔解曲线65℃→95℃，上升0.5℃，5S。
4、定量分析：以测定的指标菌的Ct值和内参照的Ct值均一化qPCR定量结果，通过标准曲线，换算成指标菌绝对数量。
实施案例3：粪便微生物标志物的评估
1、CRC组粪便中Fn数量显著高于三个对照组：HS，NGC，BCD组(p＜0.0001；p＜0.0001；p＝0.043)；Fn数量在HS和BCD患者体存在明显的差异(p＜0.01)，见图1a。
2、CRC组粪便中Bb和Fp的数量与HS组和NGC组相比均显著减少(HS组；p＜0.0001；BCD组：Fp，p＜0.0001；Bb，p＜0.01)；CRC组粪便中Bb的数量与BCD组相比无统计学差异(图1b，1c)。
3、CRC和BCD组粪便中细菌数量比值Fn/Fp与HS，NGC组相比均显著升高(p＜0.0001；p＜0.0001)，见图1d。
4、CRC组粪便中细菌数量比值Fn/Bb与HS、BCD，NGC组相比，均显著升高(p＜0.0001)。见图1e。
5、I期CRC与HS组相比粪便中Fn/Fp和Fn/Bb显著升高(均p＜0.0001)。见图1d，1e。
6、这些结果表明粪便中Fn/Bb比值具有评估CRC；Fn/Fp比值具有评估CRC与BCD的能力
实施案例4：Fn/Bb和Fn/Fp比值作为结直肠癌诊断标志物的价值
1、绘制ROC曲线，单独Fn，Fp和Bb菌的数量对于区分CRC和HS，其AUC分别是0.875，0.741和0.870。图2a，2c。
2、使用细菌比值Fn/Fp和Fn/Bb区分CRC与HS时，提高了诊断价值，AUC分别达到0.914和0.911。结果见图2a。
3、Fn/Bb和Fn/Fp联合诊断区分CRC与HS，提高了诊断价值，其AUC达到0.943，结果见图2a，2c。
4、Fn/Bb具有良好的区分CRC和BCD(AUC＝0.916)的能力，诊断能力高于Fn，Bb和Fp的联合诊断(AUC＝0.845)，结果见图2b，2d。
5、Fn/Bb比值区分CRC与HS的敏感性(Sen)和特异性(Spe)分别为84.6％和92.3％，并且显示出较高的阳性预测值(PPV)以及阴性预测值(NPV)，为85.4％与91.8％。
6、Fn/Bb比值区分CRC和BCD的敏感性与特异性为76.8％和90.3％，而在敏感性均为90％的情况下，Fn/Bb特异性提升至71.8％。
7、Fn/Fp比值区分CRC和HS的敏感性为(95.0％)，但是其特异性相对较低(71.3％)。
8、这些结果表明细菌比值Fn/Bb和Fn/Fp比Fn菌单独具有对CRC更好的诊断潜能，并且Fn/Bb和Fn/Fp的联合可以进一步提升对CRC的诊断能力。
表1：微生物标志物区分结直肠癌(CRC)与健康人(HS)，良性结直肠肿瘤患者(BCD)的灵敏度和特异性。
实施案例5：Fn/Bb和Fn/Fp早期诊断结直肠癌
1、97名早期CRC患者(I期CRC 38例，II期CRC 59例)中利用粪便指标菌数量的比值筛查早期CRC测试。当单独利用Fn时，AUC仅为0.635；单独使用Bb，Fp或Fn、Fp、Bb的联合其AUC均没有超过0.8；然而利用Fn/Bb和Fn/Fp进行诊断时，其AUC分别为0.876和0.824，结果见图3a，3c。
2、Fn在区分HS和CRC(I+II)的敏感性仅为30.8％，Fp和Bb的敏感性均没有超过65％，Fn、Fp、Bb联合的敏感性为76.9％，特异性为66.7％。而Fn/Bb具有87.7％的敏感性和81.9％的特异性。当敏感性为90％时，Fn/Bb和Fn/Fp的特异性分别为67.6％和54.3％，显著高于Fn单独35.9％的特异性，Fn/Bb和Fn/Fp联合特异性为76.2％(AUC＝0.889)，见表2。
3、区分I期CRC患者和HS组，Fn/Bb和Fn/Fp的AUC为0.738和0.803，Fn/Bb和Fn/Fp联合(Fn/Bb+Fn/Fp)AUC为0.804，而单独使用三种标志物或三种标志物的联合的AUC均未超过0.8，结果见图3b，3d。Fn/Bb+Fn/Fp在约登指数最佳阈值下具有87.9％的敏感性和71.4％的特异性，当灵敏度为90.0％时，特异性为60％，结果表2。
4、Fn/Bb可以区分早期CRC和BCD，其中对于区分I-II期CRC和BCD的AUC为0.849，区分I期CRC和BCD的AUC为0.729，而Fn/Fp虽然在区分I-II期CRC和BCD的AUC仅为0.558，但对于区分I期CRC和BCD的AUC为0.723，结果见4a，4b。
5、这些结果提示Fn/Bb和Fn/Fp的比值可以作为提高CRC早期诊断能力的标志物，同时也表明Fn/Bb+Fn/Fp可作为CRC早期诊断的一种非侵入性指标。
表5：微生物标志物诊断早期直肠癌(I+II期)的灵敏度和特异性。

Claims (8)

1.一种粪便样本中肠道菌群稳态评价方法及在结直肠癌筛查中的应用。
2.根据权利要求1所述的肠道菌群稳态评价方法，其特征在于，所述检测指标菌为具核梭杆菌(F.nucleatum，Fn)；双歧杆菌属(Bifidobacterium，Bb)和柔嫩梭菌(F.prausnitzii，Fp)共三个种属的细菌组合。
3.根据权利要求1所述的肠道菌群稳态评价方法，其特征在于，计算具核梭杆菌与双歧杆菌属的细菌数量比值(Fn/Bb)作为诊断标志物。
4.根据权利要求1所述的肠道菌群稳态评价方法，其特征在于，计算具核梭杆菌与柔嫩梭菌的细菌数量比值(Fn/Fp)作为诊断标志物。
5.根据权利要求3和权利要求4所述，其特征在于，联合细菌数量比值Fn/Bb和Fn/Fp作为评价指标。
6.根据权利要求1所述，细菌数量比值Fn/Bb在结直肠癌的诊断、筛查，治疗疗效检测中的应用。
7.根据权利要求1所述，细菌数量比值Fn/Fp在结直肠癌及其癌前病变的诊断、筛查，治疗疗效检测中的应用。
8.根据权利要求6和所述权利要求7所述，，联合细菌数量比值Fn/Bb和Fn/Fp在结直肠癌诊断、筛查，治疗疗效检测中的应用。
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