CN109680083A - 一种快速检测粪便具核梭杆菌的引物组、方法及其应用 - Google Patents

一种快速检测粪便具核梭杆菌的引物组、方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具核梭杆菌的引物组信息、定量PCR检测方法及其应用。根据NCBI数据库中细菌的16S rRNA核酸序列和BLAST功能，利用引物设计软件Primer Primer 5进行设计具核梭杆菌相关引物及V3‑V4引物，并对引物进行鉴定。从粪便样本中提取总菌的基因组信息，利用引物进行qPCR，计算获得具核梭杆菌的相对含量。以上述检测方法为原理，利用具核梭杆菌引物研制肠道微生态检测试剂盒。利用试剂盒进行实际检测，结果显示肠道微生态患者和肠癌患者粪便样本中具核梭杆菌含量显著异于正常人。本发明中具核梭杆菌的特异性引物、快速准确的检测方法和肠道微生态试剂盒的研发，为了解肠道微生态的分布，以及疾病的预测和初步筛选提供方法。

Description

一种快速检测粪便具核梭杆菌的引物组、方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，致力于发明一种快速鉴定粪便中具核梭杆菌的方法，涉及肠道具核梭杆菌引物组、分子检测方法及其应用。
背景技术
具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）属于革兰氏阴性专性厌氧菌，不仅与口腔疾病有关，还参与了败血症，盆腔炎，脑、肝、肺、脾等脏器部位的脓肿和结直肠癌的生物学过程。具核梭杆菌拥有多种凝集蛋白，可凝集红细胞，黏附于上皮细胞和羟磷灰石表面。既可以与早期定植菌如放线菌共聚，又可与晚期定植菌如牙龈卟啉单胞菌属、血链球菌、幽门螺杆菌和放线菌共聚。
随着生活水平的提高，人们饮食结构的改变，大肠癌的发病率和病死率逐年上升。近年来，具核梭杆菌与结直肠癌的研究越来越多。研究显示，人类大肠癌细胞表面有糖Gal-GalNA的富集，该糖能够与具核梭杆菌表面Fap2蛋白结合，使具核梭杆菌定植在原位结肠肿瘤部位，并在此增殖，此外，T细胞介导的适应性免疫反应在抑制肿瘤发展中具有重要作用，而具核梭杆菌可通过抑制T细胞增殖，导致肠癌中T细胞死亡，加速大肠癌的发展。具核梭杆菌还可以通过诱导癌细胞的自噬，导致化疗耐药，增加术后复发，降低患者生存率。因此具核梭杆菌的快速鉴定和检测，对于肠癌患者的早期发现，合理治疗提供新的途径。
目前对具核梭杆菌的检测有多种方法。由于具核梭杆菌为专性厌氧菌，分离培养条件要求高，耗时较长，不利于快速检测，并且临床标本量少，菌种较多，分离培养技术在临床应用中常受到限制。免疫检测和酶联免疫吸附法虽然具有较好的稳定性，但是研究过程中涉及抗体的制备，耗时较长，且特异性较差。DNA探针检测具有更高的检测效率，省时省力，还可以排除厌氧菌不易存活的假阴性结果。然而全基因探针在检测具核梭杆菌中易于其他同源细菌（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等）产生交叉反应，在以往的应用中容易产生假阴性或假阳性的结果。因此在具核梭杆菌的鉴定方面我们需要更快速，特异性更高的检测方法。
基于DNA分析的定量PCR（qPCR）技术，因其污染少、灵敏度高、特异性高，且操作简便快速等特点，已成为当前分子微生物学及微生物生态学中的关键技术，被广泛用于微生物群落的快速定量检测。
本研究采集受试者的粪便标本，利用具核梭杆菌的特异性引物，致力于研究出一种对粪便中具核梭杆菌的快速鉴定和相对定量检测方法，该方法可用于肠道微生态检测试剂盒的研发，用于对人体疾病的预测。
发明内容
本发明的目的主要在于为粪便中具核梭杆菌的鉴定和相对含量检测设计特异性引物，以及快速准确的鉴定方法，并研发相关微生态检测试剂盒。
研究所需菌株均来源于受试者的粪便样本，利用常安易TM粪便采集盒采集受试者的粪便样本，于本实验室2-8℃保存。
根据NCBI数据库中细菌的16S rRNA核酸序列，并利用引物设计软件PrimerPrimer 5设计具核梭杆菌和总菌V3-V4引物。
所述引物长度18-25bp左右，例如可以是18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp或25bp，优选为20bp。避免产生二级结构。
所述引物组合物的GC含量为50-60%，例如可以是50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。
所述引物Tm值58-63℃，例如可以是58℃、59℃、60℃、61℃、62℃或63℃，优选为60℃。
共获得6对具核梭杆菌引物，分别为：F-P1F:TCAGTGTCTTCGGGGAAACC，F-P1R:CCCCACCTTCCTCCTACTCA；F-P2F:CAGTGTCTTCGGGGAAACCT，F-P2R:ACCCATTGTAGCACGTGTGT；F-P3F:TCCACGCCGTAAACGATGAT，F-P3R:GGTTTCCCCGAAGACACTGA； F-P4F:CTGGGGAGTACGTACGCAAG，F-P4R:AGGTTTCCCCGAAGACACTG； F-P5F:TCGGGGAAACCTAAAGACAGG，F-P5R:TCCACTTCACAGCTTTGCGA；F-P6F:CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTCA，F-P6R:GTTGACTTTACAGAAGGAGATTATGTAAAAATC。
总菌引物如下：T-P1F：TCCGTGSTGCAYGGYTGTCGTCAG，T-P1R：AGGTACGTCRTCCMCACCTTCCTC；T-P2F：CCTTGTGSTGCAYGGYTGTCGTCA，T-P2R：ATCCACGTCRTCCMCACCTTCCTC。
通过NCBI网站上的BLAST功能对引物进行鉴定。最终确定具核梭杆菌引物序列为P6 Forward：5’-CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTC-3’和Reverse：5’-GTTGACTTTACAGAAGGAGATTATGTAAAAATC-3’；总菌引物为
对PCR反应体系及条件的优化。通过Qubit测定样本DNA浓度，设置DNA起始量梯度进行实验，Ct值≤ 35对应的DNA起始量为可接受范围。通过标准曲线测试反应性能，若标准曲线的扩增效率达到90-105%，线性相关系数R2>0.98，且每个梯度重复样本之间Ct值接近，则说明反应体系性能良好。
通过梯度qPCR实验，根据溶解曲线以及电泳图确定最适退火温度为60℃。利用粪便基因组DNA提取试剂盒提取待测粪便样本中基因组。以粪便菌群基因组DNA为模板，利用引物，进行qPCR。PCR实验条件：95℃预变性3min；95℃变性15S，最适退火温度退火1min，共45个循环。60℃进行荧光采集。获得具核梭杆菌的Ct值和总菌Ct值，计算样本中具核梭杆菌的相对含量。
以上述方法为原理，利用具核梭杆菌特异性引物，研制肠道微生态检测试剂盒，试剂盒中配备了总菌16S rRNA为内参，设置无菌水作为阳性对照，具核梭杆菌上下游引物0.5ul作为阴性对照。
预混液包括PCR反应液和对应的引物，引物终浓度为0.25-1.25ng/μL，每个孔中反应液浓度如下：
具核梭杆菌PCR反应液：Tris-HCl：60mmol/L，pH8.5；硫酸铵：40mmol/L；MgCl2：5.5mmol/L；dNTPs：400μmol/L；
总菌PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；
阴性对照PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；
阳性对照PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；
试剂盒检测结果有效性判定如下：
（1）阴性对照：无典型S型扩增曲线。
（2）阳性对照：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤30。
（3）检测样本的Ct值应＜40。
（4）在同时满足1、2、3的条件下，实验有效，否则无效。
本发明中，同时满足（1）-（3）的条件下证明实验有效，若阴性对照出现典型S性扩增曲线表明实验环境污染或操作不当；若所有孔均无典型S型扩增曲线表明试剂可能失效或仪器问题或操作过程不当；若检测样本的Ct值≥40，表明样本过少，检测特异性降低。
在证明实验有效的前提下，根据八联管5个细菌孔各自的Ct值（Ct细菌）和V3-V4孔的总菌Ct值（Ct总菌），通过公式：2-ϫCt（ϫCt=Ct细菌-Ct总菌）得到样本中具核梭杆菌的相对含量。
收集临床肠道微生态失衡患者和正常人的粪便样本，利用研发的肠道微生态检测试剂盒对两组人群进行粪便样本检测，肠道微生态失衡患者粪便中具核梭杆菌含量显著高于正常人。
利用肠道微生态检测试剂盒检测肠癌组、腺瘤组和正常组的粪便标本中具核梭杆菌的相对含量，检测结果显示，肠癌组患者粪便中具核梭杆菌含量显著高于正常组（P<0.05），而腺瘤组与正常组之间差异不显著（P>0.05）。将本研究结果与文献报导中的研究结果一致。
有益效果
本发明中所设计的具核梭杆菌特异性引物及检测方法能快速鉴定粪便中具核梭杆菌并检测其相对含量，该方法操作简便快捷，特异性好，灵敏度高。利用特异性引物及方法所研发的肠道微生态检测试剂盒，可用于疾病预测。
具体实施方式
实施例1供试菌株来源
研究所需要的具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）来源于受试者的粪便样本，采集粪便样本前三个月内受试者未服用抗生素及类似药物，参考常安易TM粪便采集盒说明书，采集受试者的粪便样本，于本实验室2-8℃保存，不超过24小时。
实施例2引物序列选择及鉴定
根据细菌名称在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）上下载细菌的16S rRNA序列，而后利用引物设计软件Primer Primer 5设计细菌特异性引物。
表1.引物信息
引物 序列编号 序列5’-3’
F-P1F SEQ ID NO.1 TCAGTGTCTTCGGGGAAACC
F-P1R SEQ ID NO.2 CCCCACCTTCCTCCTACTCA
F-P2F SEQ ID NO.3 CAGTGTCTTCGGGGAAACCT
F-P2R SEQ ID NO.4 ACCCATTGTAGCACGTGTGT
F-P3F SEQ ID NO.5 TCCACGCCGTAAACGATGAT
F-P3R SEQ ID NO.6 GGTTTCCCCGAAGACACTGA
P-P4F SEQ ID NO.7 CTGGGGAGTACGTACGCAAG
P-P4R SEQ ID NO.8 AGGTTTCCCCGAAGACACTG
P-P5F SEQ ID NO.9 TCGGGGAAACCTAAAGACAGG
P-P5R SEQ ID NO.10 TCCACTTCACAGCTTTGCGA
P-P6F SEQ ID NO.11 CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTCA
P-P6R SEQ ID NO.12 GTTGACTTTACAGAAGGAGATTATGTAAAAATC
T-P1F SEQ ID NO.13 TCCGTGSTGCAYGGYTGTCGTCAG
T-P1R SEQ ID NO.14 AGGTACGTCRTCCMCACCTTCCTC
T-P2F SEQ ID NO.15 CCTTGTGSACCAYTGYTGTCGTCA
T-P2R SEQ ID NO.16 ATCCACGTCRTACMCACCTTCCTC
引物设计完成后通过NCBI网站Primer-Blast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ ）功能鉴定引物的特异性，比对出的序列均为这些细菌16S rRNA序列或全基因组序列。用引物通过PCR扩增出目的片段，然后进行电泳，产物条带与预期一致，且无任何杂带，对引物扩增出的片段进行一代测序，将测序所得序列在NCBI网站上Nucleotide BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能进行序列比对，与预期产物序列相似度高于90%。其中仅一对引物序列对比结果相似度高于90%。
因此最终确定具核梭杆菌的引物序列为：P-P6F：5’-CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTCA-3’和P-P6R：5’-GTTGACTTTACAGAAGGAGATTATGTAAAAATC-3’。总菌引物为T-P1F: 5’-TCCGTGSTGCAYGGYTGTCGTCAG-3’，T-P1R：5’-AGGTACGTCRTCCMCACCTTCCTC-3’。
实施例3 V3-V4引物设计及特异性验证
微生物16S rRNA序列包含9个可变区和10个高度保守区，为保证引物特异性，故选择在保守区内设计引物，另相对于其他可变区，V3-V4区能够覆盖98%以上的细菌，且V3-V4区扩增产物长度符合qPCR对引物预期产物的长度要求；以此为条件，参考大量文献，获得一对符合要求的引物，而后对此引物进行特异性验证。
实施例4引物序列最适退火温度确定实验
根据正反向引物的Tm值±5℃ 设置温度梯度进行qPCR实验，根据融解曲线及产物电泳图确定最适退火温度。（选择融解峰单一集中且电泳条带单一明亮的温度。）最终确定具核梭杆菌的引物最适退火温度为60℃。
实施例5粪便菌群基因组DNA提取
利用粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328，天根生化科技（北京）有限公司）提取待测粪便样本中的基因组DNA。
实施例6 qPCR反应体系及条件的优化
以体系中Vazyme ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂推荐的反应体系为基础，测试体系中模板DNA的添加量。通过Qubit测定样本DNA浓度，设置DNA起始量梯度进行实验，Ct值≤35对应的DNA起始量为可接受范围。
体系优化完成后，通过标准曲线测试反应性能：以已知浓度的质粒为模板，10倍梯度稀释制作标准曲线，若曲线的扩增效率达到90-105%，线性相关系数R2>0.98，且每个梯度重复样本之间Ct值接近，则说明反应体系性能良好。
实施例7依据最适退火温度进行qPCR
以粪便菌群基因组DNA为模板，以粪便中总菌数为内参，计算6种细菌占总菌的相对含量。利用引物，在具有SYBRGreen检测通道的荧光定量PCR仪（西安天隆）上，对基因组进行扩增和荧光检测。荧光采集在60℃ 进行。
qPCR反应体系和条件如下：
（1）qPCR实验体系：20uL体系，qPCR SYBRGreen Mix (2*) 10 uL，正反向引物各0.5uL，DNA 1uL，ddH2O 8uL；
（2）qPCR实验条件：95℃预变性3min；95℃变性15S，最适退火温度退火1min，共45个循环。
获得具核梭杆菌的Ct值和总菌Ct值，通过2-ϫCt（ϫCt=Ct细菌-Ct总菌）得到样本中具核梭杆菌在总菌中的相对含量。
实施例8试剂盒的生成
利用具核梭杆菌和总菌引物和PCR反应原理，研制肠道微生态检测试剂盒，以适用于多种荧光PCR仪的八联管为单位，每个八联管可检测一个样本。预混液包括PCR反应液和对应的引物，引物终浓度为0.25-1.25ng/μL，每个孔中反应液浓度如下：
具核梭杆菌PCR反应液：Tris-HCl：60mmol/L，pH8.5；硫酸铵：40mmol/L；MgCl2：5.5mmol/L；dNTPs：400μmol/L；
总菌PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；
阴性对照PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；
阳性对照PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L。
试剂盒使用时直接按照推荐起始量向具核梭杆菌对应的孔以及V3V4孔（总菌反应孔）加入模板DNA，再用 ddH2O将体系补足至20uL即可；阴性对照孔仅加入ddH2O 9uL；内标反应孔无需任何添加。实验操作人员仅需要在预先设计好的检测反应孔中加入待样本即可。减少由于人员操作或者实验环境引起的误差。其结构如下表：
表2,具核梭杆菌引物研制肠道微生态试剂盒结构
孔 具体组分
具核梭杆菌 PCR反应液10ul，具核梭杆菌上下游引物各0.5uL
总菌 PCR反应液10ul，细菌16S V3V4区上下游引物各0.5uL
阴性对照 PCR反应液 10uL，具核梭杆菌上下游引物各0.5uL，无菌水9μL
阳性对照(亦作为内标) PCR反应液 10uL，具核梭杆菌DNA溶液2ul（5ng），具核梭杆菌上下游引物各0.5uL，无菌水7ul
实施例9在肠道菌群紊乱患者中的实际检测
从临床患者再次选取20例存在肠道菌群紊乱症状的患者，和相同例数的健康人，收集这些人的多组粪便标本，利用所研制的试剂盒，检测粪便中具核梭杆菌的相对含量。
检测结果显示，使用试剂盒检测的肠道菌群紊乱患者的粪便标本中，具核梭杆菌的相对含量均显著异于健康人，表明我们的qPCR检测方法具有较高的特异性和准确性。此外在健康人的粪便标本中，有1名参与者的检测结果显示具核梭杆菌的相对含量与其他健康人存在差异，表明该参与者未来发生肠道菌群紊乱的可能性较高。
实施例10 对比肠癌患者和正常人粪便中具核梭杆菌的含量
从临床收集肠癌患者（肠癌组）、腺瘤患者（腺瘤组）和正常人（正常组）的粪便标本，检测具核梭杆菌在粪便中的含量。检测结果显示，具核梭杆菌在正常组中含量较低，肠癌组患者粪便中具核梭杆菌含量增高。利用数据分析软件SPSS 20，采用Mann-Whitney U检验对数据结果进行显著性分析。分析结果如下：
表3,肠癌组、腺瘤组和正常组粪便中具核梭杆菌含量的组间比较
　组间比较 P值
正常组与腺瘤组 0.847
正常组与癌症组 0.019
分析结果显示，与正常组比较，肠癌组患者粪便中具核梭杆菌含量显著高于正常组（P<0.05），而腺瘤组与正常组之间差异不显著（P>0.05）。将本研究结果与文献报导中的研究结果进行对比，结果一致。

Claims (7)

1.肠道细菌具核梭杆菌实时荧光定量PCR引物的设计方法，其特征在于：
优选地，所述引物组合物的引物长度为18-25bp，优选为20bp；
优选地，所述引物组合物的GC含量为50-60%；
优选地，所述引物组合物的Tm值为58-63℃，优选为60℃。
2.按照权利要求1所述的方法设计具核梭杆菌和总菌的引物，其特征在于具核梭杆菌引物序列为：SEQ ID NO.1-12，总菌引物为：SEQ ID NO.13-16 。
3.如权利要求2所述设计的引物序列，在NCBI网站上Nucleotide BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能进行序列比对，其特征在于最终确定具核梭杆菌引物对为P-P6F：5’-CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTCA-3’，P-P6R：5’-GTTGACTTTACAGAAGGAGATTATGTAAAAATC-3’；总菌引物为T-P1F: 5’-TCCGTGSTGCAYGGYTGTCGTCAG-3’，T-P1R：5’-AGGTACGTCRTCCMCACCTTCCTC-3’。
4.利用权利要求3中引物进行实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于该方法对受试者粪便样本中具核梭杆菌进行定性和相对含量检测，具体步骤如下：
（1）qPCR实验体系：20uL体系，qPCR 反应液10 uL，正反向引物各0.5uL，DNA 1uL，ddH2O8uL；
（2）qPCR实验条件：95℃预变性3min；95℃变性15S，最适退火温度退火1min，共45个循环。
5.权利要求3中的所述具核梭杆菌和总菌引物和权利要求4中的检测方法，其特征在于制备肠道微生态检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括扩增八联管，所述八联管分别预先分装针对具核梭杆菌和总菌检测的PCR预混液；
优选地，所述预混液包括PCR反应液和对应的引物；
优选地，所述反应液包括Tris-HCl、硫酸铵、MgCl2和dNTPs；
优选地，所述八联管还包括阴性质控和阳性质控；
优选地，所述阴性质控为无菌水；
优选地，所述阳性质控为具核梭杆菌基因组DNA。
7.一种如权利要求1-5所述的试剂盒用于肠道微生态失衡和肠癌检测中的应用。
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