CN110699468A - 检测人肠道细菌的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，具体的，涉及人肠道细菌检测领域。本发明提供了一种组合物，其检测双歧杆菌属(BIF)、链球菌属(STR)、拟杆菌属(BAC)、乳酸菌属(LAC)、柔嫩梭菌(CLEP)、普拉梭菌(FAE)、直肠真杆菌(ER)共7种肠道细菌；与此同时，还提供了所述组合物用于检测人肠道细菌的用途、包含所述组合物的试剂盒以及用于检测人肠道细菌的方法。

Description

检测人肠道细菌的组合物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体的，属于人肠道细菌的检测领域；更具体的，所述肠道细菌包括双歧杆菌属(BIF)、链球菌属(STR)、拟杆菌属(BAC)、乳酸菌属(LAC)、柔嫩梭菌(CLEP)、普拉梭菌(FAE)和直肠真杆菌(ER)共7种肠道细菌。
背景技术
肠道微生物指动物肠道中存在的数量庞大的微生物，这群微生物依靠动物的肠道生活，同时帮助寄主完成多种生理生化功能。在正常情况下，人体内的肠道微生物形成了一个相对平衡的状态，一旦平衡受到破坏，如服用抗生素、放疗、化疗、情绪压抑、身体衰弱、缺乏免疫力等，就会导致肠道菌群失去平衡，从而进一步影响机体的健康。
通过建立肠道菌群与特定的健康状况之间的关系，将有助于通过分析肠道菌群分布获得对个体是否患有特定疾病进行评估。
因此，在肠道细菌检测领域，存在对特定肠道细菌组合进行检测，以便评估机体的某一或某些具体健康状况的需求。
发明内容
为了寻找肠道菌群组合与特定健康状况之间的联系，发明人研究了肠道微生物的作用，发现通常认为：乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇；双歧杆菌作为一种生理性有益菌，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能；拟杆菌正常寄居于人和动物的肠道、口腔、上呼吸道和生殖道，因长期应用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，而使机体免疫功能紊乱或菌群失调时，能导致内源性感染；柔嫩梭菌产生短链脂肪酸，对肠道功能的调节有很重要的作用；普拉梭菌能够产生抗炎因子，保护肠道健康；直肠真杆菌产生短链脂肪酸，对肠道功能的调节有很重要的作用；链球菌属是肠道常见定植细菌，当机体免疫力降低时会引起炎症疾病，如脑膜炎、肺炎等。
而对于健康状况与肠道微生物的对应关系，通常认为与健康者相比，结直肠癌患者粪便中的拟杆菌属菌群增加，而有益菌菌群(如双歧杆菌)有所减少；与健康者相比，糖尿病患者粪便中的双歧杆菌会有所减少；冠心病患者肠道菌群中的链球菌含量增加，双歧杆菌、乳酸杆菌含量减少；腹泻人群中拟杆菌属、链球菌属的变化幅度比无明显症状人群高30％，同时泻药的使用会导致真杆菌的显著降低；抑郁症患者粪便中拟杆菌属、乳酸菌和双歧杆菌的数量明显不足。因此，对肠道微生物的丰度进行检测，有便于肠道健康状况的评估，进而有便于整个机体的健康状况的评估。因此，发明人发现这7种细菌的组合能够评估整个机体的健康状况。
此外，发明人经过大量研究，进一步发现：2型糖尿病患者与正常人的肠道内的产丁酸菌以及拟杆菌的丰度存在明显差异(Ametagenome-wide association study of gutmicrobiota in type 2diabetes[J].Nature,2012,490(7418):55-60.)，产丁酸菌代表菌为柔嫩梭菌、直肠真杆菌、普拉梭菌；同时还有文献指出糖尿病患者肠道中的双歧杆菌也会有所减少。吴晓康等，在2型糖尿病患者肠道的链球菌属的研究中也发现，2型糖尿病患者的链球菌菌群显著下降。而乳酸菌是能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，其也与糖尿病有着密切关系。也就是说，特别地，发明人发现了以上7种细菌的组合能够用于评估糖尿病的风险。
因此，本发明提供了一种检测肠道细菌的组合物，所述肠道细菌由双歧杆菌属(BIF)、链球菌属(STR)、拟杆菌属(BAC)、乳酸菌属(LAC)、柔嫩梭菌(CLEP)、普拉梭菌(FAE)和直肠真杆菌(ER)组成，所述组合物包括：
BIF的检测试剂：如SEQ ID NO:1所示的BIF上游引物、如SEQ ID NO:2所示的BIF下游引物和如SEQ ID NO:3所示的BIF探针；
STR的检测试剂：如SEQ ID NO:4所示的STR上游引物、如SEQ ID NO:5所示的STR下游引物和如SEQ ID NO:6所示的STR探针；
LAC的检测试剂：如SEQ ID NO:7所示的LAC上游引物、如SEQ ID NO:8所示的LAC下游引物和如SEQ ID NO:9所示的LAC探针；
BAC的检测试剂：如SEQ ID NO:10所示的BAC上游引物、如SEQ ID NO:11所示的BAC下游引物和如SEQ ID NO:12所示的BAC探针；
FAE的检测试剂：如SEQ ID NO:13所示的FAE上游引物、如SEQ ID NO:14所示的FAE下游引物和如SEQ ID NO:15所示的FAE探针；
CLEP的检测试剂：如SEQ ID NO:16所示的CLEP上游引物、如SEQ ID NO:17所示的CLEP下游引物和如SEQ ID NO:18所示的CLEP探针；以及
ER的检测试剂：如SEQ ID NO:19所示的ER上游引物、如SEQ ID NO:20所示的ER下游引物和如SEQ ID NO:21所示的ER探针。
使用上述组合物，能够准确地鉴定出以上所述的7种肠道细菌，且特异性高，对遗传背景相近的酪酸梭菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌肠道细菌等不会出现非特异性扩增，能够评估整个机体的健康状况，特别地，能够用于评估糖尿病的风险。
在一个优选的实施方式中，本发明的组合物以3个试剂组合的形式存在：
试剂组合1：FAE的检测试剂、CLEP的检测试剂和ER的检测试剂；
试剂组合2：BIF的检测试剂、STR的检测试剂、LAC的检测试剂和BAC的检测试剂中两种；以及
试剂组合3：其余两种检测试剂。
使用这种组合方式，能够准确地鉴定出以上所述的7种肠道细菌，并且同时使引物与引物之间和探针与探针之间的相互影响降低，以提高扩增检测体系的效能，使得曲线挺拔。
在进一步优选的实施方式中，本发明的组合物以3个试剂组合的形式存在：
试剂组合1：FAE的检测试剂、CLEP的检测试剂和ER的检测试剂；
试剂组合2：LAC的检测试剂和BAC的检测试剂；以及
试剂组合3：BIF的检测试剂和STR的检测试剂。
使用这种组合方式，可以进一步提高扩增检测体系的效能，其曲线更为挺拔，且试剂组合1、2、3中的菌株扩增体系与单一菌株分别扩增的检测体系效能一致，说明引物与引物和探针与探针之间没有影响，同时，灵敏度均能达到400拷贝/mL。
进一步地，上述组合物，试剂组合1中的各探针的荧光基团彼此不同；试剂组合2中的各探针的荧光基团彼此不同；试剂组合3中的探针的荧光基团彼此不同。
在本发明中，探针的荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
在具体的实施方式中，如SEQ ID NO:3、9、15所示的探针的荧光基团为FAM，如SEQID NO:6、12、18所示的探针的荧光基团为HEX；SEQ ID NO:21所示的探针的荧光基团为ROX。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测人肠道细菌的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测人肠道细菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。
其中，各组分的终浓度的范围如下所示：Mg2+2～6mM、dNTP 0.1～0.4mM、DNA聚合酶2～30U、引物100～500nM、探针50～250nM。
第四方面，提供了一种用于检测人肠道细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光PCR扩增；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是粪便等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
Figure BDA0002251842900000051
使用本发明的组合物，能够准确并且高效地鉴定出以上所述的7种肠道细菌，其灵敏度为400拷贝/mL，且特异性高，不会出现酪酸梭菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌肠道细菌的非特异性扩增，能够评估整个机体的健康状况，特别地，能够用于评估糖尿病的风险。
附图说明
图1为本发明组合物的双歧杆菌BIF扩增体系筛选结果；
图2为本发明组合物的链球菌属STR扩增体系筛选结果；
图3A-D为BIF分别与BAC和STR组成的试剂组合以及BIF的单一菌种扩增检测体系的效能的结果；
图4A-D为LAC分别与BAC和BIF组成的试剂组合以及LAC的单一菌种扩增检测体系的效能的结果；
图5A-C为FAE、CLEP、ER组成的试剂组合以及FAE、CLEP、ER的单一菌种扩增检测体系的效能的结果；
图6为本发明组合物的灵敏度验证结果；
图7为本发明组合物的特异性验证结果；
图8为本发明组合物的双歧杆菌(BIF)检测结果；
图9为本发明组合物的链球菌属(STR)检测结果；
图10为本发明组合物的拟杆菌属(BAC)检测结果；
图11为本发明组合物的乳酸菌属(LAC)检测结果；
图12为本发明组合物的普拉梭菌(CLEP)检测结果；
图13为本发明组合物的柔嫩梭菌(FAE)检测结果；
图14为本发明组合物的直肠真杆菌(ER)检测结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、检测人肠道细菌的方法
本发明检测样本为粪便，采用基于磁珠法的核酸提取/纯化试剂(货号S1006，湖南圣湘生物科技有限公司，湘长械备20150021号)提取DNA，在样本处理室进行如下操作：
2.1取黄豆粒大小的粪便于1.5mL灭菌离心管，加入1mL的生理盐水进行震荡混匀，然后12,000rpm离心2分钟，取上层溶液200μL进行提取，离心管中加入300μLDNA提取溶液1；
2.2每管加入200μL待测样本；盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；
2.3每管加入100μLDNA提取溶液2-mix(充分混匀后吸取)，震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟；
2.4瞬时离心后将离心管置于分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物)；
2.5每管加入600μLDNA提取溶液3和200μLDNA提取溶液4，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
2.6约3分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃。
2.7每管加入50μLPCR-mix，用吸头吸取PCR-mix洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将其完全洗脱，然后将洗脱后的全部棕色混合液转移至0.2mL PCR反应管中，盖上管盖，转移到扩增检测区。
PCR-mix组份如下表2所示配置，DNA聚合酶选用Taq酶。
表2 PCR-mix组份
组份 每一个反应中的体积/浓度
Mg<sup>2+</sup> 4mM
dNTPs(100mM) 0.25mM
Taq酶(5U/μl) 10U
引物 200nM
探针 100nM
模板 5μL
PCR缓冲液(S04) 补至50μL
按照如下所示的PCR进行扩增：
Figure BDA0002251842900000071
结果分析：
1)目的检测信号为FAM，HEX(或VIC)及ROX；
2)基线的设置：基线一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。阈值的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
3)根据每一种试剂组合对应的探针的荧光基团选择荧光通道，若该通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤39，表示其检测结果为阳性；若该通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct>39，表示其检测结果为阴性。
实施例2、本发明使用的引物及探针的筛选
每一种细菌均设计了多套检测体系，筛选最优体系进行联检的组合测试，在筛选过程中从经济性上考虑，所有探针使用FAM-BHQ-1的FRET体系，使用的引物以及探针如下表1所示，以双歧杆菌及链球菌的筛选结果为例进行结果呈现。
表1设计的引物和探针
Figure BDA0002251842900000081
Figure BDA0002251842900000091
Figure BDA0002251842900000101
其中，S、R、Y均为简并碱基，S＝C/G，R＝A/G，Y＝C/T。
其中，将检测双歧杆菌BIF的扩增体系按照如实施例1所述的方法进行筛选：如图1所示，最终选择曲线挺拔，无非特异性扩增的BIF-F、BIF-R以及BIR-P作为双歧杆菌检测的最终体系。
将检测链球菌STR的扩增体系按照如实施例1所述的方法进行筛选：如图2所示，最终选择曲线挺拔，无非特异性扩增的STR-F、STR-R以及STR-P作为链球菌检测的最终体系。
其余引物以及探针均按照相同的方法进行筛选，最终筛选得到如SEQ ID NO:1-21所示的组合物。
实施例3、各试剂组合的扩增体系效能检测
将BIF分别与BAC和STR组成一种试剂组合，并按照如实施例1所述的方法进行检测与BIF单一菌种扩增体系比较扩增检测体系效能；将LAC与BAC和BIF组成一个试剂组合，并按照如实施例1所述的方法进行检测与LAC单一菌种扩增体系比较扩增检测体系效能；以及将FAE、CLEP、ER组成一个试剂组合，并按照如实施例1所述的方法进行检测与FAE、CLEP、ER单一菌种扩增体系比较扩增检测体系效能，结果如图3-5所示。从图中可以看出双歧杆菌属BIF可以与拟杆菌属BAC及链球菌属STR任意组合，两联检检测体系与单一菌种扩增检测体系效能一致；乳酸菌属LAC可以与拟杆菌属BAC及链球菌属BIF任意组合，与拟杆菌属组合效果较链球菌属略好，与拟杆菌属组合两联检检测体系与单一菌种扩增检测体系效能一致；普拉梭菌、柔嫩梭菌、直肠真杆菌三个特异性较高的菌种进行三联检组合，三联检检测体系与单一菌种扩增检测体系效能一致。
实施例4、灵敏度和特异性验证
将阳性模板质粒从4×106开始进行10倍梯度稀释，按照实施例2所述的方法，对组合物进行灵敏度验证。结果如图6所示，BIF和STR的检测下限低至400拷贝/mL。其余菌按照相同的检测方法进行检测，也均取得了相同的结果。
同时采用酪酸梭菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌肠道细菌菌株进行特异性验证，如图7所示，均未出现特异性扩增曲线，证明本组合物特异性良好。
实施例5、临床样本的验证
将33例临床样本，按照如实施例2所述的方法进行检测，结果如图8-14所示。并对阳性样本各取5例进行一代测序，测序结果与扩增结果完全一致，说明本试剂盒有着很高的准确性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测人肠道细菌的组合物、试剂盒及方法
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgtgtctca gttccaatgt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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accttcctct cagaacccct atccatcg 28
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<213> 人工序列
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gtaaacgatg agtgctaggt gttg 24
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<213> 人工序列
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ctacgtatta ccgcggctgc 20
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ctaccagggt atctaatcct gtttgctacc 30

Claims (10)

1.一种检测肠道细菌的组合物，所述肠道细菌由双歧杆菌属(BIF)、链球菌属(STR)、拟杆菌属(BAC)、乳酸菌属(LAC)、柔嫩梭菌(CLEP)、普拉梭菌(FAE)和直肠真杆菌(ER)组成，所述组合物包括：
BIF的检测试剂：如SEQ ID NO:1所示的BIF上游引物、如SEQ ID NO:2所示的BIF下游引物和如SEQ ID NO:3所示的BIF探针；
STR的检测试剂：如SEQ ID NO:4所示的STR上游引物、如SEQ ID NO:5所示的STR下游引物和如SEQ ID NO:6所示的STR探针；
LAC的检测试剂：如SEQ ID NO:7所示的LAC上游引物、如SEQ ID NO:8所示的LAC下游引物和如SEQ ID NO:9所示的LAC探针；
BAC的检测试剂：如SEQ ID NO:10所示的BAC上游引物、如SEQ ID NO:11所示的BAC下游引物和如SEQ ID NO:12所示的BAC探针；
FAE的检测试剂：如SEQ ID NO:13所示的FAE上游引物、如SEQ ID NO:14所示的FAE下游引物和如SEQ ID NO:15所示的FAE探针；
CLEP的检测试剂：如SEQ ID NO:16所示的CLEP上游引物、如SEQ ID NO:17所示的CLEP下游引物和如SEQ ID NO:18所示的CLEP探针；以及
ER的检测试剂：如SEQ ID NO:19所示的ER上游引物、如SEQ ID NO:20所示的ER下游引物和如SEQ ID NO:21所示的ER探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物以3个试剂组合的形式存在：
试剂组合1：FAE的检测试剂、CLEP的检测试剂和ER的检测试剂；
试剂组合2：BIF的检测试剂、STR的检测试剂、LAC的检测试剂和BAC的检测试剂中的任意两种；以及
试剂组合3：其余两种检测试剂。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述组合物以3个试剂组合的形式存在：
试剂组合1：FAE的检测试剂、CLEP的检测试剂和ER的检测试剂；
试剂组合2：LAC的检测试剂和BAC的检测试剂；以及
试剂组合3：BIF的检测试剂和STR的检测试剂。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述试剂组合1中的各探针的荧光基团彼此不同；所述试剂组合2中的各探针的荧光基团彼此不同；所述试剂组合3中的各探针的荧光基团彼此不同。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述试剂组合中的探针的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，如SEQ ID NO:3、9、15所示的探针的荧光基团为FAM，如SEQ ID NO:6、12、18所示的探针的荧光基团为HEX；SEQ ID NO:21所示的探针的荧光基团为ROX。
7.权利要求1～6中任一项所述的组合物在制备检测人肠道细菌的试剂盒中的用途。
8.一种用于检测人肠道细菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述权利要求1～6中任一项所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，各组分的终浓度的范围如下所示：Mg2+2～6mM、dNTP 0.1～0.4mM、DNA聚合酶2～30U、引物100～500nM、探针50～250nM。
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