CN102559912A - Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆及大肠杆菌的方法 - Google Patents
Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆及大肠杆菌的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，包括步骤：A)提取待检测样品中双歧杆菌及大肠杆菌的细菌基因组DNA；B)依据双歧杆菌和大肠杆菌的相关序列合成引物及Taqman探针；C)将步骤B所述引物和探针与其他PCR反应试剂组成反应体系，进行Taqman探针实时定量PCR反应。本发明中，采用双色标记Taqman探针，双重绝对定量PCR方法，可以一次同时准确定量一个样本中两种肠道细菌，可节省检测成本及检测时间，减少因多次检测而造成的误差。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种采用Taqman探针及多重引物实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法。
背景技术
目前对健康人的大便标本的研究中已知肠道内栖息着大约1014个细菌，是人体细胞总数的10～20倍，约400～500种。大量的研究结果表明，肠道内的细菌对人体的生长发育、免疫功能、营养、多种疾病的发病机制及健康等起着重要的作用。因此肠道内细菌定量对于研究肠道内菌群的功能以及与机体的相互关系非常重要。
在对细菌进行检测时，最传统的是采用传统培养计数，但是由于自然环境尤其是极端环境中存在大量不可培养的微生物，大量微生物的不可培养性是传统微生物生态学在提示自然界微生物群落结构组成、生态功能及其相互关系研究中的最大障碍。细菌纯培养检测方法耗时长、特异性差、敏感度低，精确性差等缺点。
采用分子生物学方法检测细菌或者病毒目前已经是较为普遍的一种检测手段，但是普通PCR方法只能做到定性或相对定量，不能对目标物进行准确定量。SYBR GREEN荧光定量PCR方法检测，SYBR Green在PCR反应过程中和双链DNA结合，随着PCR产物的增加，PCR产物与SYBR Green结合的量也增大，虽可以达到定量目的，但嵌入染料不能识别错误的扩增产物或反应过程中产生的引物二聚体，会影响定量结果。且容易在操作过程中由于污染而出现假阳性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用Taqman探针及多重引物实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，为更详尽的肠道菌群结构的测定，评估抗生素使用对肠道菌群的影响，评估益生菌对肠道菌群结构影响的准确性和敏感性的定量的分析研究提供了最新的手段。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，包括步骤：
A)提取待检测样品中双歧杆菌及大肠杆菌的细菌基因组DNA；
B)依据双歧杆菌和大肠杆菌的相关序列合成引物及Taqman探针：
所述的双歧杆菌的扩增引物核苷酸序列为F：5’-AGAGTGGCGAACGGGTGA-3’，R：5’-AGGACGCGACCCCATCCC-3’，Taqman探针的核苷酸序列为p-bif：5’-HEX-ATGCGTGACCGACCTGCCCC-TAMRA-3’；
所述的大肠杆菌的扩增引物核苷酸序列为F：5’-ACAATGGGCGCAAGCCT-3’，R：5’-TCTGCGGGTAACGTCAATGA-3’，Taqman探针的核苷酸序列为p-eco：5’-FAM-CAAAGGTATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGC-TAMRA-3’；
C)将步骤B所述因为和探针与其他PCR反应试剂组成反应体系，进行Taqman探针实时定量PCR反应。
目前基于16SrRNA基因分析的分子技术，被认为是细菌鉴定的是黄金标准，细菌16SrRNA分子量相对适中，其基因核苷酸序列具有高度保守性，但其保守性又是相对的，不同科、种、属间都具有一定的变异，通过对保守区与特异性区域的分析，设计出特异性引物与探针，可对不同科、种、属的16SrRNA的特异引物进行PCR扩增，可以实现对肠道菌群中某些细菌甚至整个微生态系统的动力学变化进行监测，揭示肠道微生物系统种群的多样性、数量和动力学。
Taqman探针荧光定量PCR方法对于传统的PCR技术有了其他的明显优势：①有效解决了传统的定量只能终点检测的局限，对PCR反应进行实时监控。②有效解决了PCR污染的问题，从配好反应液到结果分析完成，整个过程均在闭管条件下进行，有效避免了PCR产物的交叉污染和对实验室的污染。③特异性更强，因为荧光信号的产生不仅依赖于靶模板的扩增，还依赖于靶模板同探针的杂交，既保证了灵敏性又减少非特异扩增。④可以通过对不同探针标记不同荧光染料，实现多重检测。
本发明中，采用Taqman荧光探针及双重绝对定量PCR方法，双色标记Taqman探针，可以一次同时准确定量一个样本中两种肠道细菌，可节省检测成本及检测时间，减少因多次检测而造成的误差。细菌核酸提取方法较现有技术也有较大改变。另外的，细菌的引物及设计与现有技术完全不同，主要通过序列比对设计若干套引物探针，逐一评价、合成并且通过实验筛选确认最佳引物及探针组，确保两套引物和探针可以在相同的反应条件下达到相近的扩增效率，以实现双重检测。同时，扩增反应体系是通过多次实验重新建立，与所用试剂厂家推荐及相关文献报道有显著差异(引物、探针浓度)，以达到双重检测的要求。
附图说明
图1为大肠杆菌标准曲线示意图；
图2为双歧杆菌标准曲线示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
标本采集 新鲜人类粪便样本，采集后迅速置于4℃，24小时内送于实验室存于-80℃。
粪便细菌核酸提取 称取0.2g添加0.1mm的300mg玻璃珠(Sigma-Alorich，USA)，1.4ml ASL buffer(QIAamp DNA stool minikit(Qiagen，Hilden，Germany)，高速剧烈涡旋振荡2min，95℃热孵育5min，重复高速剧烈涡旋振荡2min，匀浆物中加入180μl蛋白酶(20mg/ml)，37℃for 30min，5000g离心3min去除细胞碎片及杂质，之后步骤参照QIAamp DNA stool minikit方法进行。
引物及探针设计
在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/查找双歧杆菌和大肠杆菌及相关细菌(金黄色葡萄菌、肺炎链球菌、阴沟杆菌、肺炎克雷伯菌，布拉氏酵母菌、酪酸梭菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、乳酸菌)16rRNA序列，通过在线序列比对软件MultAlin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)多重比对，分析出序列的保守区及特异性区域，确定出多对引物及探针，同时保证两种目的物探针荧光尽量没有相互干扰，然后采用Primer Premier5进行引物及探针的评价，进行初步筛选，再次根据所得信息调整选取的引物对序列，合成这些引物及探针组后，分别用单PCR验证所有引物及探针是否可以扩增目的片断，及扩增反应的特异性。进一步筛选出实验可行的引物及探针。
表1引物及探针序列
提高反应效率
以标准菌株制作标准曲线：图1为大肠杆菌标准曲线示意图，图中：
Error：0.0200
Efficiency：1.945
Slope：-3.461
YIntercept：38.34
Link：0.000
图2为双歧杆菌标准曲线示意图，图中：
Error：0.0206
Efficiency：1.959
Slope：-3.424
YIntercept：39.78
Link：0.000
确定扩增效率。通过调整反应体系，增加引物浓度、探针浓度、及降低退火温度等反应条件，提高扩增效率。引物及探针浓度增加一倍后扩增效率均有提高。
表2PCR反应试剂盒推荐反应体系
| 成分 | 体积 | 终浓度 |
| Premix Ex Taq(2×) | 10μL | 1× |
| 引物(上/下游)(10μM) | 0.4μL | 0.2μM |
| Taqman探针(5μM) | 0.4μL | 0.1μM |
| ddH2O | 8.2μL | |
| 模板 | 1μL | |
| 总体积 | 20μL |
注：TaKaRa的Premix Ex Taq(Perfect Real Time)；扩增效率83.9％，达不到定量要求。
表3引物探针浓度增加一倍后反应体系
| 成分 | 体积 | 终浓度 |
| Premix Ex Taq(2×) | 10μL | 1× |
| 引物(上游)(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| 引物(下游)(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| Taqman探针(5μM) | 0.8μL | 0.2μM |
| ddH2O | 6.6μL | |
| 模板 | 1μL | |
| 总体积 | 20μL |
注：PCR反应体系：TaKaRa的Premix Ex Taq(Perfect Real Time)
增加引物和探针浓度：将引物和探针浓度分别增大一倍(引物终浓度由0.2μM变为0.4μM，探针终浓度0.1μM变为0.2μM)。实验结果表明：按照SecondDerivative Maximum分析方法，建立的标准曲线Slope＝-3.461，扩增效率为94.50％。
反应体系
最后将两组引物和探针同时在一个反应体系中进行，比较双重反应和单独检测的结果。
表4单重PCR反应体系：TaKaRa的Premix Ex Taq(Perfect Real Time)
| 成分 | 体积 | 终浓度 |
| Premix Ex Taq(2×) | 10μL | 1× |
| 引物(上游)(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| 引物(下游)(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| Taqman探针(5μM) | 0.8μL | 0.2μM |
| ddH2O | 6.8μL | |
| 模板 | 1μL | |
| 总体积 | 20μL |
表5多重PCR反应体系：TaKaRa的Premix Ex Taq(Perfect Real Time)
| 成分 | 体积 | 终浓度 |
| Premix Ex Taq(2×) | 10μL | 1× |
| Eco引物(上游)(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| Bif引物(上游)(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| Eco引物(下游)(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| Bif引物(下游)(10μM) | 0.8μL | 0.4μM |
| EcoTaqman探针(5μM) | 0.8μL | 0.2μM(FAM标记) |
| BifTaqman探针(5μM) | 0.8μL | 0.2μM(HEX标记) |
| ddH2O | 4.2μL | |
| 模板 | 1μL | |
| 总体积 | 20μL |
反应条件及程序
反应程序：
95℃ 30s；
试剂盒推荐退火延伸温度为60℃，为了达到同时检测两种目的物，且在保证特异性的前提下降低了退火延伸温度为55℃。
表6单独检测与双重反应检测结果比较
注：Bif：双歧杆菌；Eco：大肠杆菌
A1：反应体系中有单一(双歧)引物探针，模板只有双歧杆菌标准品
E1：反应体系中有单一(大肠)引物探针，模板只有大肠杆菌标准品
A2：反应体系中有双套引物探针，模板只有双歧杆菌标准品
B2：反应体系中有双套引物探针，模板只有大肠杆菌标准品
C2：反应体系中有双重引物探针，模板有双歧杆菌、大肠杆菌标准品两种模板
这种设计是为了检测双重体系中两套引物和探针是否会相互干扰。
H1、D1、F2为阴性对照
分别采用FAM标记Taqman探针进行大肠杆菌(Eco)单重PCR和Hex标记Taqman探针进行双歧杆菌(Bif)单重扩增以及上述两种菌的多重PCR检测。实验结果表明：双歧杆菌标准品单重扩增和二重扩增(单模板和双模板)单点定标均落在标准曲线之上。大肠杆菌标准品单重扩增和二重扩增(单模板和双模板)单点定标也均落在标准曲线之上，表明二重扩增方法建立成功。
反应实例1、2
对24号和26号两例临床样本粪便细菌核酸进行Eco和Bif单重检测和多重检测，并将两种检测方法进行对比，两种方法检测方法检测的双歧和大肠杆菌数量极为相似。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，包括步骤：
A)提取待检测样品中双歧杆菌及大肠杆菌的细菌基因组DNA；
B)依据双歧杆菌和大肠杆菌的相关序列合成引物及Taqman探针：
所述的双歧杆菌的扩增引物核苷酸序列为F：5’-AGAGTGGCGAACGGGTGA-3’，R：5’-AGGACGCGACCCCATCCC-3’，Taqman探针的核苷酸序列为p-bif：5’-HEX-ATGCGTGACCGACCTGCCCC-TAMRA-3’；
所述的大肠杆菌的扩增引物核苷酸序列为F：5’-ACAATGGGCGCAAGCCT-3’，R：5’-TCTGCGGGTAACGTCAATGA-3’，Taqman探针的核苷酸序列为p-eco：5’-FAM-CAAAGGTATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGC-TAMRA-3’；
C)将步骤B所述引物和探针与其他PCR反应试剂组成反应体系，进行Taqman探针实时定量PCR反应。
2.如权利要求1所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：
所述的A)步骤中双歧杆菌及大肠杆菌的基因组DNA是在同一粪便样品中进行，采用QIAamp DNA stool minikit进行提取，除去细胞碎片及杂质的工艺为：取0.2g样品添加0.1mm的300mg玻璃珠(Sigma-Alorich，USA)，1.4ml ASLbuffer(QIAamp DNA stool minikit(Qiagen，Hilden，Germany)，高速剧烈涡旋振荡2min，95℃热孵育5min，重复高速剧烈涡旋振荡2min，匀浆物中加入180μl蛋白酶(20mg/ml)，37℃for 30min，5000g离心3min。
3.如权利要求2所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：所述的同一样品为新鲜人类粪便样本；采集样品后迅速置于4℃，24小时内送于实验室存于-80℃。
4.如权利要求1所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：所述的B)步骤中合成双歧杆菌和大肠杆菌的扩增引物及Taqman探针时，首先查找双歧杆菌和大肠杆菌及相关细菌16rRNA序列，进行多重比对，分析出序列的保守区及特异性区域，确定出多对引物及探针，同时保证两种目的物探针荧光尽量没有相互干扰，然后对设计的引物及探针进行初步筛选，再次根据所得信息调整选取的引物对序列，合成这些引物及探针组后，分别用单PCR验证所有引物及探针是否可以扩增目的片断，及扩增反应的特异性，进一步筛选出实验可行的引物及探针。
5.如权利要求4所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：所述的双歧杆菌和大肠杆菌及相关细菌为金黄色葡萄菌、肺炎链球菌、阴沟杆菌、肺炎克雷伯菌，布拉氏酵母菌、酪酸梭菌、枯草杆菌、绿脓杆菌和乳酸菌。
6.如权利要求1所述的Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆菌及大肠杆菌的方法，其特征是：所述C)步骤的反应体系包括反应体系为：
所述的反应条件及程序为：反应程序：
95℃ 30s；
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