CN112111587A - 一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物、载体及标准曲线的构建方法 - Google Patents

一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物、载体及标准曲线的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物、载体及标准曲线的构建方法，所述特异性引物的序列为SEQ NO.5、SEQ NO.6。本发明载体特异性好，与双歧杆菌鉴定探针不同，该发明载体的插入序列比双歧杆菌鉴定探针产物序列特异性更好，该双歧杆菌鉴定探针只做基因序列扩增使用，配合本发明载体可制做标准曲线，且定量结果更准确。

Description

一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物、载体及标准曲 线的构建方法
技术领域
本发明属于农业食品检测技术领域，尤其是一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物、载体及标准曲线的构建方法。
背景技术
双歧杆菌是一个细菌属名。双歧杆菌属(Bifidobacterium)是一种革兰氏阳性、不运动、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状、严格厌氧的细菌属，广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等生境中。双歧杆菌属的细菌是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一，是一种重要的肠道有益微生物。作为一种生理性有益菌，双歧杆菌对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。同时这种有益细菌能抑制人体有害细菌的生长，抵抗病原菌的感染，合成人体需要的维生素，促进人体对矿物质的吸收，其产生的醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有机酸可刺激肠道蠕动，促进排便，防止便秘、净化肠道环境、分解致癌物质，从而提高人体抗病能力。
随着肠道微生物组学研究的发展，人们越来越认识到双歧杆菌的重要性。双歧杆菌在医药、食品等方面也得到了广泛地应用。因其可为人们的健康带来种种好处，双歧杆菌作为食品添加益生菌尤其是在奶制品的应用上越来越广泛，这也使得双岐杆菌的经济价值显著上升，因此针对双歧杆菌在农业食品中的鉴定和定量的技术创新也成为必然的需求。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物、载体及标准曲线的构建方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物，所述特异性引物的序列为SEQNO.5、SEQNO.6。
而且，所述引物序列存在于动物双歧杆菌BB-12的16S rRNA保守序列上。
利用如上所述的特异性引物构建的双岐杆菌鉴定探针的载体。
而且，构建步骤如下：
⑴双歧杆菌的培养及DNA提取
将进行增菌培养，预先将超净工作台用紫外灯照射，取双岐杆菌菌液加入到莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基(该培养基是本领域内公知的。购自海博生物产品编号：HB0384-11)中，200rpm/min、37℃震荡过夜培养12～16h；
将增菌后的细菌以分区划线的方法接种于莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS固体平皿中，置于37℃中倒置培养12～16h；挑单个菌落，接种于装有莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基的试管中，于200rpm/min、37℃震荡过夜培养12～16h；
提取试验菌株DNA；
⑵普通PCR扩增
在20uL体系中加入动物双歧杆菌的载体构建特异性引物，进行PCR扩增反应程序，即得双岐杆菌鉴定探针的载体：
其中，PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002642133910000021
PCR扩增反应程序：
Figure BDA0002642133910000022
35个循环。
而且，所述方法还包括对载体引物有效性判定的手段。
而且，所述对载体引物有效性判定的手段包括过表达引物序列的质粒、PCR技术、琼脂糖凝胶电泳技术。
利用如上所述的双岐杆菌鉴定探针的载体构建双岐杆菌鉴定探针标准曲线的方法，步骤如下：
将双岐杆菌鉴定探针的载体导入DH5α感受态细胞，提取质粒进行标准曲线的构建，实现双岐杆菌鉴定探针标准曲线的构建。
而且，具体步骤如下：
⑴双歧杆菌标准品载体构建：
①配置载体连接体系，反应总体系为10μL，体系组分及用量如下所示：
Figure BDA0002642133910000031
②16℃反应，过夜连接；
③将连接液全部加至50μL DH5α感受态细胞中，立即冰浴放置30min；
④立即在42℃水浴锅中热激90s，立即冰浴放置1-2min；
⑤加入500μL 4℃融化的SOC培养基，37℃、160rpm/min震荡培养1h；
⑥室温下4000rpm/min离心1min，弃掉部分上清，吹打重悬管底沉淀，用涂布棒均匀地涂平板；
⑦将加入载体的DH5α感受态细胞在含有100mg/mL Amp+的LB固体琼脂平板上37℃过夜培养，不低于17h，待形成单菌落；
⑧挑选菌落，运用PCR方法鉴定插入片段的长度大小，检测目的基因是否构建完全；
⑵质粒提取
对待测样品菌液进行质粒DNA的提取；
⑶实时荧光定量标准曲线的建立
将提取的质粒进行10倍梯度稀释，选取100～104梯度的标准品进行荧光PCR扩增，绘制标准曲线。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明特异性引物特异性好，与双歧杆菌鉴定探针配对的引物不同，该发明引物产物序列比双歧杆菌鉴定探针产物序列特异性更好，制做标准曲线更准确。
2、本发明利用设计特异性载体引物，使双歧杆菌鉴定探针可以高效地构建荧光定量标准曲线，从而达到对酸奶制品中双歧杆菌定量的效果，利用实时荧光定量PCR技术(探针法)，可以为酸奶中对双歧杆菌的检测和定量提供快速、灵敏、高效的方法，对探索奶制品中细菌的检测和定量提供启示。
3、本发明引物序列存在于动物双歧杆菌BB-12的16S rRNA保守序列上，且能够与普通探针配对，所述普通探针只做基因序列扩增使用，配合所述特异性载体能够制做标准曲线，使该普通探针能够对双歧杆菌进行定量检测。
4、本发明载体特异性好，与双歧杆菌鉴定探针不同，该发明载体的插入序列比双歧杆菌鉴定探针产物序列特异性更好，该双歧杆菌鉴定探针只做基因序列扩增使用，配合本发明载体可制做标准曲线，且定量结果更准确。
5、本发明鉴于已知的一条探针只做双歧杆菌鉴定用途，本发明可使该探针对双歧杆菌菌数进行定量，这使得他人发明资源可多方面利用。
附图说明
图1为本发明中载体图谱；
图2为本发明中构建载体进行菌液PCR的琼脂糖凝胶电泳图，其中，1-2代表2个生物学重复；
图3为本发明中构建的载体提取质粒10倍梯度稀释作为标准品扩增曲线图，其中，选取100-104五个梯度；
图4为本发明中构建的标准曲线图；
图5为本发明中待测样品DNA荧光定量PCR扩增曲线图；
图6为已知他人设计双歧杆菌探针特异性扩增曲线图；数字1表示动物双歧杆菌BB-12标准菌株提取DNA扩增曲线；数字2表示婴儿双歧杆菌标准菌株提取DNA扩增曲线；数字3表示酸奶产品中提取DNA扩增曲线；数字4表示不含有双歧杆菌但含有其他酸奶添加菌产品提取DNA扩增曲线以及阴性对照(ddH2O)。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物，所述特异性引物的序列为SEQNO.5、SEQ NO.6。
较优地，所述引物序列存在于动物双歧杆菌BB-12的16S rRNA保守序列上。
利用如上所述的特异性引物构建的双岐杆菌鉴定探针的载体。
较优地，构建步骤如下：
⑴双歧杆菌的培养及DNA提取
将进行增菌培养，预先将超净工作台用紫外灯照射，取双岐杆菌菌液加入到莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基(该培养基是本领域内公知的。购自海博生物产品编号：HB0384-11)中，200rpm/min、37℃震荡过夜培养12～16h；
将增菌后的细菌以分区划线的方法接种于莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS固体平皿中，置于37℃中倒置培养12～16h；挑单个菌落，接种于装有莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基的试管中，于200rpm/min、37℃震荡过夜培养12～16h；
提取试验菌株DNA；
⑵普通PCR扩增
在20uL体系中加入动物双歧杆菌的载体构建特异性引物，进行PCR扩增反应程序，即得双岐杆菌鉴定探针的载体：
其中，PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002642133910000051
PCR扩增反应程序：
Figure BDA0002642133910000052
35个循环。
较优地，所述方法还包括对载体引物有效性判定的手段。
较优地，所述对载体引物有效性判定的手段包括过表达引物序列的质粒、PCR技术、琼脂糖凝胶电泳技术。
利用如上所述的双岐杆菌鉴定探针的载体构建双岐杆菌鉴定探针标准曲线的方法，步骤如下：
将双岐杆菌鉴定探针的载体导入DH5α感受态细胞，提取质粒进行标准曲线的构建，实现双岐杆菌鉴定探针标准曲线的构建。
较优地，具体步骤如下：
⑴双歧杆菌标准品载体构建：
①配置载体连接体系，反应总体系为10μL，体系组分及用量如下所示：
Figure BDA0002642133910000061
②16℃反应，过夜连接；
③将连接液全部加至50μL DH5α感受态细胞中，立即冰浴放置30min；
④立即在42℃水浴锅中热激90s，立即冰浴放置1-2min；
⑤加入500μL 4℃融化的SOC培养基，37℃、160rpm/min震荡培养1h；
⑥室温下4000rpm/min离心1min，弃掉部分上清，吹打重悬管底沉淀，用涂布棒均匀地涂平板；
⑦将加入载体的DH5α感受态细胞在含有100mg/mL Amp+的LB固体琼脂平板上37℃过夜培养，不低于17h，待形成单菌落；
⑧挑选菌落，运用PCR方法鉴定插入片段的长度大小，检测目的基因是否构建完全；
⑵质粒提取
对待测样品菌液进行质粒DNA的提取；
⑶实时荧光定量标准曲线的建立
将提取的质粒进行10倍梯度稀释，选取100～104梯度的标准品进行荧光PCR扩增，绘制标准曲线。
本发明的一种设计思路是：
设计双歧杆菌的载体特异性引物，该引物片段包含双岐杆菌鉴定探针的序列，构建目标序列的过表达载体，再将构建成功的载体导入DH5α感受态细胞，提取质粒进行标准曲线的构建，将待测样品与标准品质粒一同进行实时荧光定量PCR，得到标准曲线公式，计算得出样本拷贝数做验证。实现双岐杆菌鉴定探针的使用及快速、高灵敏性检测和定量酸奶中双歧杆菌。
具体的，相关制备及检测如下：
一种双岐杆菌鉴定探针的载体构建的方法，包括以下步骤：
第一步、双歧杆菌鉴定探针载体引物设计：
本发明使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库比对及设计双歧杆菌构建标准品质粒的特异性引物。具体步骤是：
(1)双歧杆菌标准品质粒特异性引物的设计。
动物双歧杆菌BB-12的16SrRNA碱基序列(1459bp)：
Figure BDA0002642133910000071
Figure BDA0002642133910000081
已知他人设计的探针及引物(命名为：BP、FBP/RBP)以及本人发明设计构建标准品所需的引物(命名为：Bif-zt-F/R)如表1所示：
表1特异性引物及目的片段大小
Figure BDA0002642133910000091
第二步、载体构建、标准曲线的建立
(1)双歧杆菌的培养及DNA提取。
将进行增菌培养，预先将超净工作台用紫外灯照射(30min左右)，从EP管中取10μL菌液加入到10mL莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养试管中，置于摇床(设置200rpm/min、37℃)中震荡过夜培养12～16h。
将增菌后的细菌以分区划线(四区划线)的方法接种于莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS固体平皿中，置于温箱(设置37℃)中倒置培养12～16h。挑单个菌落，接种于装有莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基(约10mL)的试管中，于摇床(设置200rpm/min、37℃)中震荡过夜培养12～16h。
采用Omega E.Z.N.ABacteril DNAKit(D3350-00)试剂盒提取试验菌株DNA，具体步骤见说明书。
(2)普通PCR扩增
按表1在20uL体系中加入动物双歧杆菌BB-12的载体构建特异性引物，按照表2的体系及表3的PCR扩增反应程序(35个循环)。结果如图1所示。
表2 PCR扩增反应体系
Figure BDA0002642133910000092
Figure BDA0002642133910000101
表3 PCR扩增反应程序(35cycle)
Figure BDA0002642133910000102
(3)琼脂糖凝胶电泳实验
称取琼脂糖粉末0.4g，量取1×TAE溶液20mL，混合并加热至完全融化(澄清且无浑浊)。用移液枪吸取核酸染料2μL，摇匀后沿板壁缓慢倒入插好梳子的电泳板槽中，待琼脂糖凝胶凝固。轻轻拔出梳子，取出琼脂糖凝胶放进含有1×TAE电泳液(现配现用)的电泳槽中，在胶孔中用移液枪加样10μL，调节电压(设定100V)和电流(设定200mA)进行电泳实验。电泳时间约20～30min，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中进行成像，观察并记录结果。
(4)双歧杆菌标准品载体构建。
应用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Gel Extraction Kit型号：CW2302S)对琼脂糖凝胶进行目的基因片段的回收提纯。具体操作见琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Gel ExtractionKit型号：CW2302S)试剂盒说明书。结果如图2所示，从图2中可以看出载体插入片段是303bp，与设计的载体构建引物序列产物长度相一致。
载体构建具体方法如下：
1、在200μL离心管中配置载体连接体系，反应总体系为10μL，体系组分及用量如表4所示。
表4载体连接体系
Figure BDA0002642133910000103
Figure BDA0002642133910000111
2、16℃反应，过夜连接。
3、将连接液全部加至50μL DH5α感受态细胞中，立即冰浴放置30min。注：若DH5α感受态细胞需分装，用预冷过的1.5mL离心管。
4、立即在42℃水浴锅中热激90s，立即冰浴放置1-2min。
5、加入500μL SOC培养基(4℃融化)，放于摇床(设置37℃、160rpm/min)震荡培养1h。
6、室温下用离心机(设置4000rpm/min)离心1min，弃掉部分上清(离心管中约留100μL液体)，轻轻吹打重悬管底沉淀，用涂布棒轻轻均匀的涂平板。
7、将加入载体的DH5α感受态细胞在含有Amp+(100mg/mL)的LB固体琼脂平板上37℃过夜培养(不低于17h)，待形成单菌落。
8、挑选适合的菌落，运用PCR方法鉴定插入片段的长度大小，检测目的基因是否构建完全。
(5)质粒提取。
应用质粒DNA小量提取试剂盒(CW2105S，康为世纪)对待测样品菌液进行质粒DNA的提取，具体操作见说明书。
(6)实时荧光定量标准曲线的建立。
将提取的质粒进行10倍梯度稀释，选取100～104梯度的标准品进行荧光PCR扩增，绘制标准曲线。结果如图3、图4所示，从图3、图4可以看出该标准曲线构建成功，R2可达0.99，可信度高。
第三步、酸奶样品DNA的提取
(1)酸奶中细菌DNA的提取，具体操作如下：
1、取45mL样品，依次使用4000rpm/min、6000rpm/min、8000rpm/min离心5min，取上清液全部加入同一个离心管中。
2、12000rpm/min离心10min，弃上清液。
3、加2mL CTAB裂解液和40uL溶菌酶(50mg/mL)，35℃，孵育30min。
4、加40uL蛋白酶K(20mg/mL)，65℃，孵育1h，13000rpm/min离心1min，取初沉淀。
5、加10uLNacL(1.2moL/mL)溶解初沉淀。
6、加入10uL氯仿震荡20s，1000xg离心1min，取上清。
7、加入0.8倍异丙醇沉淀30min，12000rpm/min离心10min。
8、加70％乙醇，使DNA沉淀飘起，除乙醇，自然风干。
9、加适量TE缓冲液溶解DNA。
(2)实时荧光定量PCR检测双歧杆菌。
将标准品和待测酸奶提取DNA样品共同进行荧光定量PCR扩增，在20μL体系中按表5加入各种成分后进行荧光定量PCR检测。扩增程序如表6(45个循环)所示。
表5荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002642133910000121
表6 PCR扩增反应程序
Figure BDA0002642133910000122
结果得到标准曲线公式：y＝-3.4919x+14.7 R2＝0.99
第四步、数据统计分析。
将荧光定量PCR得到的结果进行统计学计算，得到结果如图5、图6和表7所示。本实验所测定的样品中双歧杆菌的数量与报道的酸奶中的数量基本一致。
表7同一产品不同瓶中双歧杆菌的数量(copies/mL)
Figure BDA0002642133910000123
Figure BDA0002642133910000131
注：以上酸奶均为目前在售品牌的酸奶，将其简称为1、2、3、4。
由上表可知，不同瓶中的酸奶中，双歧杆菌的数量存在一定差异，分析原因是由于酸奶样品提取DNA的方法及样品中含有大量蛋白质、脂肪等其他物质干扰造成DNA提取有损耗。但本实验所测定的样品中双歧杆菌的数量与报道的酸奶中的数量基本一致(益生菌添加量≥106CFU)。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津农学院
<120> 一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物、载体及标准曲线的构建方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1459
<212> DNA/RNA
<213> 动物双歧杆菌BB-12的16SrRNA碱基序列(Unknown)
<400> 1
actanagaac gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg aacgggatcc ctggcagctt 60
gctgtcgggg tgagagtggc gaacgggtga gtaatgcgtg accaacctgc cctgtgcacc 120
ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatac cggatgctcc gctccatcgc atggtggggt 180
gggaaatgct tttgcggcat gggatggggt cgcgtcctat cagcttgttg gcggggtgat 240
ggcccaccaa ggcgttgacg ggtagccggc ctgagagggt gacccggcca cattgggact 300
gagatacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa 360
gcctgatgca gcgacgccgc gtgcgggatg gaggccttcg ggttgtaaac cgcttttgtt 420
caagggcaag gcacggtttc ggccgtgttg agtggattgt tcgaataagc accggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tatccggatt tattgggcgt 540
aaagggctcg taggcggttc gtcgcgtccg gtgtgaaagt ccatcgccta acggtggatc 600
tgcgccgggt acgggcgggc tggagtgcgg taggggagac tggaattccc ggtgtaacgg 660
tggaatgtgt agatatcggg aagaacacca atggcgaagg caggtctctg ggccgtcact 720
gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
gtaaacggtg gatgctggat gtggggccct ttccacgggt cccgtgtcgg agccaacgcg 840
ttaagcatcc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaagaaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg 960
cttgacatgt gccggatcgc cgtggagaca cggtttccct tcggggccgg ttcacaggtg 1020
gtgcatggtc gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
accctcgccg catgttgcca gcgggtgatg ccgggaactc atgtgggacc gccggggtca 1140
actcggagga aggtggggat gacgtcagat catcatgccc cttacgtcca gggcttcacg 1200
catgctacaa tggccggtac aacgcggtgc gacacggtga cgtggggcgg atcgctgaaa 1260
accggtctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaaggcgga gtcgctagta 1320
atcgcggatc agcaacgccg cggtgaatgc gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
agtcatgaaa gtgggtagca cccgaagccg gtggcccgac ccttgtgggg ggagccgtct 1440
aaggtgagac tcgtgattg 1459
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 引物FBP(Unknown)
<400> 2
gttgggttaa gtcccgcaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 引物RBP(Unknown)
<400> 3
tgaagccctg gacgtaagg 19
<210> 4
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> 引物BP(Unknown)
<400> 4
amacgtaagg ggcatgatga tctgacgbh 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 引物Bif-zt-F(Unknown)
<400> 5
gtggagacac ggtttccctt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 引物Bif-zt-R(Unknown)
<400> 6
actgcgatcc gaactgagac 20

Claims (8)

1.一种双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的序列为SEQ NO.5、SEQ NO.6。
2.根据权利要求1所述的双岐杆菌鉴定探针的载体的特异性引物，其特征在于：所述引物序列存在于动物双歧杆菌BB-12的16S rRNA保守序列上。
3.利用如权利要求1或2所述的特异性引物构建的双岐杆菌鉴定探针的载体。
4.根据权利要求3所述的双岐杆菌鉴定探针的载体，其特征在于：构建步骤如下：
⑴双歧杆菌的培养及DNA提取
将进行增菌培养，预先将超净工作台用紫外灯照射，取双岐杆菌菌液加入到莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基中，200rpm/min、37℃震荡过夜培养12～16h；
将增菌后的细菌以分区划线的方法接种于莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS固体平皿中，置于37℃中倒置培养12～16h；挑单个菌落，接种于装有莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基的试管中，于200rpm/min、37℃震荡过夜培养12～16h；
提取试验菌株DNA；
⑵普通PCR扩增
在20uL体系中加入动物双歧杆菌的载体构建特异性引物，进行PCR扩增反应程序，即得双岐杆菌鉴定探针的载体：
其中，PCR扩增反应体系为：
Figure FDA0002642133900000011
PCR扩增反应程序：
Figure FDA0002642133900000012
Figure FDA0002642133900000021
35个循环。
5.根据权利要求4所述的双岐杆菌鉴定探针的载体，其特征在于：所述方法还包括对载体引物有效性判定的手段。
6.根据权利要求5所述的双岐杆菌鉴定探针的载体构建的方法，其特征在于：所述对载体引物有效性判定的手段包括过表达引物序列的质粒、PCR技术、琼脂糖凝胶电泳技术。
7.利用如权利要求3至6任一项所述的双岐杆菌鉴定探针的载体构建双岐杆菌鉴定探针标准曲线的方法，其特征在于：步骤如下：
将双岐杆菌鉴定探针的载体导入DH5α感受态细胞，提取质粒进行标准曲线的构建，实现双岐杆菌鉴定探针标准曲线的构建。
8.根据权利要求7所述的双岐杆菌鉴定探针的载体构建双岐杆菌鉴定探针标准曲线的方法，其特征在于：具体步骤如下：
⑴双歧杆菌标准品载体构建：
①配置载体连接体系，反应总体系为10μL，体系组分及用量如下所示：
Figure FDA0002642133900000022
②16℃反应，过夜连接；
③将连接液全部加至50μL DH5α感受态细胞中，立即冰浴放置30min；
④立即在42℃水浴锅中热激90s，立即冰浴放置1-2min；
⑤加入500μL 4℃融化的SOC培养基，37℃、160rpm/min震荡培养1h；
⑥室温下4000rpm/min离心1min，弃掉部分上清，吹打重悬管底沉淀，用涂布棒均匀地涂平板；
⑦将加入载体的DH5α感受态细胞在含有100mg/mL Amp+的LB固体琼脂平板上37℃过夜培养，不低于17h，待形成单菌落；
⑧挑选菌落，运用PCR方法鉴定插入片段的长度大小，检测目的基因是否构建完全；
⑵质粒提取
对待测样品菌液进行质粒DNA的提取；
⑶实时荧光定量标准曲线的建立
将提取的质粒进行10倍梯度稀释，选取100～104梯度的标准品进行荧光PCR扩增，绘制标准曲线。
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