CN113981115A - 用于快速鉴定副干酪乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于快速鉴定副干酪乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用，属于快速检测领域。该特异性引物对包括：其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用该引物能快速精准的进行副干酪乳杆菌的鉴定。同时，应用该引物对进行了口腔护理产品中副干酪乳杆菌的鉴定，并探索出了该方法在牙膏中的最低检出限为0.0005％(5×104CFU/g)，灵敏度高，检测效率高。
Description
技术领域
本发明涉及快速检测技术领域，特别是用于快速鉴定副干酪乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用。
背景技术
口腔保健的优势益生菌副干酪乳杆菌也被越来越多的添加到口腔护理产品中，以改善口腔微生态,可以有效预防龋齿,口臭,牙周炎等口腔问题。
副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)属于乳杆菌属中的干酪乳杆菌群，是干酪乳杆菌的亚种，广泛存在于奶酪、泡菜等发酵食品，以及人体的口腔及肠道中。副干酪乳杆菌应用于口腔产品主要是抑制口腔致病菌的生长、降低口腔致病菌的占位黏附及改善口腔微生态平衡的目的。益生菌的检测对于新食品及日化原料、新食品研制和生产、以及后续产品的质量安全控制来说意义重大。现有的传统检测方法仅限于乳酸菌总数和少数几种益生菌，如GB 4789.35-2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》，GB 4789.34-2016《食品微生物学检验双歧杆菌检验》中公开的检测方法。副干酪乳杆菌与干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的亲缘关系非常接近，很难利用传统的发酵特性来区分它们。同时，口腔护理产品中副干酪乳杆菌的添加需基于法规对于菌落数的限量要求，添加的副干酪乳杆菌是灭活菌株，也无法通过传统的生化鉴定进行鉴别，因此，对于副干酪乳杆菌的分子鉴定显得尤为必要。目前分子学方法主要采用扩增16S保守序列片段，再根据测序结果与NCBI数据库中基因序列进行比对，通过构建系统发育树来确定其亲缘关系与种属，16S核糖体DNA扩增同源性分析可进行种水平或亚种水平的乳杆菌鉴定，能够区分种间相似度低于93％的近缘菌种，但对于亲缘关系极近的乳杆菌(16S rDNA序列相似度达99％以上)，如鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌，则无法采用该方法鉴别。故亟待开发一种快速鉴定副干酪乳杆菌的种特异性引物鉴别方法。对于副干酪乳杆菌种特异性引物鉴别，目前有专利CN 111286550 A公布了扩增副干酪乳杆菌的引物对及其在土壤及食品中的检测应用方法。但该专利中的引物设计思路特异性验证并没有针对鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌等近缘且公认难鉴别的乳酸杆菌做为实验中引物的特异性验证菌株，其引物特异性还需进一步验证。此外，专利CN 111286550 A并没有探索发明的引物在口腔护理产品中的检测使用，而本发明中则对牙膏及漱口水中的副干酪乳杆菌的检测过程进行开发，例如，前处理时如何解决牙膏中磨料对实验检测的干扰问题，并且还探索出了运用该方法检测牙膏和漱口水产品中副干酪乳杆菌能够被检测出的最低菌粉的添加量。
发明内容
本发明目的在于解决上述技术问题，本发明提供了用于快速鉴定副干酪乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用，利用该引物能快速精准的进行副干酪乳杆菌的鉴定。同时，应用该引物对探究了口腔护理产品(牙膏)中副干酪乳杆菌鉴定的DNA提取方法，灵敏度高。
为了达到上述目的，本发明的技术方案有：
本发明提供了用于快速鉴定副干酪乳杆菌的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，即：5’-CACAGACCCGTGAGCATA-3’；其下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，即：5’-GGCTTGTCTGTTTCACGAACA-3’。
本发明还提供了用于快速鉴定副干酪乳杆菌的试剂盒，包括上述的引物对。
优选地，还包括：PCR mix、DNA模板、ddH2O。
本发明还提供了一种使用上述的引物对检测副干酪乳杆菌的方法，具体包括：提取待测物的DNA模板，以权利要求1所述的引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若出现289bp的DNA条带，则待测物为唾液乳杆菌。、
优选地，所述PCR扩增反应条件如下：95℃预变性5min，变性94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃补平10min，4℃保温。
优选地，所述提取待测物的DNA模板的步骤如下：取待测物置于离心管中；12000rpm离心1min，弃上清；向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮。加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min；加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠；将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中；12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul漂洗也PE，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体；将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE；室温放置2min；12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA模板，-20℃保存。
本发明还公开了一种上述的方法在口腔护理产品检测中的应用。
优选地，所述口腔护理产品为牙膏，所述牙膏中DNA模板提取步骤包括：称取牙膏1g，进行10倍稀释，将稀释后样品3000rpm离心1min，吸取上清液2ml置于另一无菌离心管中，12000rpm离心2min；其余提取步骤同上。
针对口腔护理产品中副干酪乳杆菌检测DNA提取方法优化，先用低速离心去除牙膏中存在的磨料，防止其对在提取过程中堵塞柱子,提高检测的灵敏度。
本发明的有益效果：
(1)本发明基于唾液乳杆菌的tuf基因进行特异性引物设计，设计一对唾液乳杆菌种特异性引物，仅运用普通梯度PCR即能很好区分包括副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、噬酸乳杆菌、植物乳杆菌等的近缘菌株，且假阳性低，特异性好。
(2)对口腔护理产品中DNA提取过程进行开发和优化，DNA提取得率高，适用于口腔产品中唾液乳杆菌的检测能快速鉴别口腔产品中的唾液乳杆菌，该方法的样品检测限低，灵敏度高。
(3)本发明提供的检测副干酪乳杆菌的方法操作简单，对设备要求不高，仅需普通梯度PCR仪，无需荧光定量PCR仪，适合普通实验室开展检测。
附图说明
图1为副干酪乳杆菌特异性检测结果图；
其中，marker为2000bp，条带从下至上依次为100、250、500、1000、1500、2000bp六个条带编号。1-6分别为：副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。
图2副干酪乳杆菌引物特异性验证琼脂糖凝胶电泳结果图；
其中，marker为2000bp，条带从下至上依次为100、250、500、1000、1500、2000bp六个条带编号。1-13分别为副干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、伴放线放线杆菌、粘性放线菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阴性对照(ddH2O)。
图3为不同浓度副干酪乳杆菌添加量的牙膏的检测琼脂糖凝胶电泳结果图；
其中：Marker为2000bp，条带从下至上依次为100、250、500、1000、1500、2000bp六个条带编号。图中编号：1、0.005％；2、0.0005％；3、0.0001％；4、0.01％；5、阴性对照(ddH2O)。
图4为不同浓度副干酪乳杆菌添加量漱口水的检测琼脂糖凝胶电泳结果图；
其中，Marker为2000bp，条带从下至上依次为100、250、500、1000、1500、2000bp六个条带编号。图中编号：1、0.01％；2、0.005％；3、0.0005％；4、0.0001％；5、0.00001％、6、阴性对照(ddH2O)。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表达的范围。
实例1：筛选用于唾液乳杆菌的特异性引物
本发明通过副干酪乳杆菌已公布的tuf基因为目标，在NCBI(National Centerfor Biotechnology Information)数据库上下载多条已知副干酪乳杆菌tuf基因序列(>AY372040.1、>AJ459399.1、>AJ459398.1、>AJ459397.1、>AY871788.2、>JN694771.1)，同时下载多条与之相关的近缘菌株tuf基因序列如鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、噬酸乳杆菌等，及非近缘菌株但有tuf基因的细菌，如金黄色葡萄球菌等。然后利用DNAMAN软件进行目标菌株与非目标菌株tuf基因序列比对，筛选出目标序列保守而针对非目标菌株特异的碱基进行筛选标记，遵循引物3’端延伸过程因非目标序列碱基不匹配原则而终止扩增的原则进行引物设计，同时充分考虑引物的二聚体和发夹结构等影响因素，过程利用Premier primer5.0软件进行引物辅助设计，最终设计引物的扩增片段长度起始位置为34～322bp之间，共计289bp的长度。设计好的引物在NCBI数据库primer Blast上进行引物比对验证特异性，最后将筛选出引物进行华大基因合成，筛选出的引物序列如下：
正向引物：5’-CACAGACCCGTGAGCATA-3’
反向引物：5’-GGCTTGTCTGTTTCACGAACA-3’
本发明的引物从保守序列的设计开始就针对数条副干酪乳杆菌的tuf基因先进行序列比对，找出其真正保守的序列后再与近缘菌株去进行特异性序列的查找，同时在引物验证阶段采用了多株(包括亲缘性最大的鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌等)不同的乳杆菌进行引物特异性验证，设计出的引物特异性更加有保障。
实施例2：利用上述特异性引物检测副干酪乳杆菌的方法
(1)副干酪乳杆菌DNA提取
采用的试剂盒为广州东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)，取0.5-2ml处于对数生长期菌液，置于1.5ml离心管中。12000rpm离心1min，弃上清。向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮。加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min。加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠。将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗也PE，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE。室温放置2min。12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA，-20℃保存。
(2)PCR(聚合酶链式反应)及琼脂糖凝胶电泳实验
PCR扩增体系为：12.5ul PCR mix，上游引物各1ul，DNA模板2ul，ddH2O8.5ul，反应总体积25ul。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，变性94℃30s，56℃30s，72℃1min，共计35个循环，72℃10min，4℃保温。
2％琼脂糖凝胶电泳，电压95V，电泳时长35min。
(3)副干酪乳杆菌特异性检测
分别以纯的菌粉或者菌株进行特异性检测，图1中，1-6分别为：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)(北京北纳生物BNCC337289)、唾液乳杆菌(salivaLactobacillus)(北京北纳生物BNCC138618)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌粉(微康益生菌)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌粉(微康益生菌)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(北京北纳生物BNCC185342)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌粉(微康益生菌)；图2中，1-13分别为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)(北京北纳生物BNCC337289)、副干酪乳杆菌菌粉(一然生物)、副干酪乳杆菌菌粉(景岳生物)、副干酪乳杆菌菌粉(微康益生菌)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)(微康益生菌)、伴放线放线杆菌(ActinobacillusActinomycetes)(广微所GIM1.507)、粘性放线菌(Actinomycetes viscosus)(广微所GIM1.381)、具核梭杆菌(Clostridium nucleatum)(广微所GIM1.826)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)(北京北纳生物BNCC236547)、大肠杆菌(Escherichia coli)(北京北纳生物BNCC269342)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(广微所ATCC6538)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(广微所ATCC15442)、阴性对照(ddH2O)共计13种不同菌株及菌粉进行特异性检测，如图1-2所示，仅副干酪乳杆菌在289bp处出现清晰的条带，表明此引物对检测副干酪乳杆菌的特异性非常好。
该方法能通过普通PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳即可快速特异性鉴别唾液乳杆菌，扩增效率高，无需测序及测序后碱基序列比对分析，也避免灭活菌无法进行生化鉴定确认的问题。
实施例3：检测牙膏中副干酪乳杆菌
牙膏中副干酪乳杆菌DNA提取及检测
(1)制作一系列不同浓度副干酪乳杆菌(含量为1010CFU/g)添加量的牙膏0.01％、0.005％、0.0005％、0.0001％，每个浓度梯度牙膏均称取1g，进行10倍稀释，将稀释后样品3000rpm离心1min，吸取上清液2ml置于另一无菌离心管中，12000rpm离心2min。
口腔护理产品牙膏配方中有摩擦剂，呈现颗粒状，在DNA提取过程第一步高速离心时与菌体一起沉底会影响提取效果，且过程中会堵塞柱子，从而影响检测效率。但高速离心会导致菌体与摩擦剂一起沉底，低速离心又会无法沉淀摩擦剂，本申请中的转速，既能让摩擦剂沉底又不至于让菌体沉底，从而取上清液快速去掉摩擦剂。
(2)DNA提取
采用的试剂盒为广州东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)，将收集到的上清液进行12000rpm离心1min，弃上清。向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮。加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min。加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠。将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗也PE，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE。室温放置2min。12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA，-20℃保存。
(3)PCR扩增
PCR扩增体系为：12.5ul PCR mix，上游引物各1ul，DNA模板2ul，ddH2O8.5ul，反应总体积25ul。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，变性94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃补平10min，4℃保温。
(4)2％琼脂糖凝胶电泳，电压95V，电泳时长35min。
2％琼脂糖凝胶电泳成像如图3所示，泳道3(0.0001％)未检出副干酪乳杆菌，可见利用实施例1的引物对和实施例2的测试方法测得牙膏中副干酪乳杆菌的最低检测限为0.0005％(5×104CFU/g)。
实施例4：检测漱口水中副干酪乳杆菌
(1)制作一系列不同浓度副干酪乳杆菌菌粉(含量为1010CFU/g)添加的漱口水，0.001％；0.0005％；0.00025％；0.0001％；0.00001％。
(2)DNA提取
采用的试剂盒为广州东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)，将收集到的上清液进行12000rpm离心1min，弃上清。向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮。加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min。加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠。将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗也PE，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE。室温放置2min。12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA，-20℃保存。
(3)PCR扩增
PCR扩增体系为：12.5ul PCR mix，上游引物各1ul，DNA模板2ul，ddH2O8.5ul，反应总体积25ul。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，变性94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃补平10min，4℃保温。
(4)2％琼脂糖凝胶电泳，电压95V，电泳时长35min。
(5)凝胶成像如图4所示，泳道1-3均能检测出条带，泳道4未检测出肩带，说明用此方法进行漱口水检测能被检测出的最低添加量为0.00025％(2.5×104CFU/g)。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州舒客实业有限公司
<120> 用于快速鉴定副干酪乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用
<130> 2021.11.19
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacagacccg tgagcata 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcttgtctg tttcacgaac a 21
Claims (8)
1.用于快速鉴定副干酪乳杆菌的特异性引物对，其特征在于，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.用于快速鉴定副干酪乳杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的用于快速鉴定副干酪乳杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR MIX、DNA模板、ddH2O。
4.一种使用如权利要求1所述的引物对检测副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，提取待测物的DNA模板，以权利要求1所述的引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若出现289bp的DNA条带，则待测物含有副干酪乳杆菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件如下：95℃预变性5min，变性94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃补平10min，4℃保温。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提取待测物的DNA模板的步骤如下：取待测物置于离心管中；12000rpm离心1min，弃上清；向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮；加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min；加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠；将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中；12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul漂洗也PE，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体；将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中；向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE；室温放置2min；12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA模板，-20℃保存。
7.一种如权利要求4-5任一项所述的方法在口腔护理产品检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述口腔护理产品包括牙膏或漱口水，所述牙膏中DNA模板提取步骤包括：称取牙膏1g，进行10倍稀释，将稀释后样品3000rpm离心1min，吸取上清液2ml置于另一无菌离心管中，12000rpm离心2min。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487943A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-02-02 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种基因片段在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111286550A (zh) * | 2019-07-18 | 2020-06-16 | 大连民族大学 | 一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用 |
| CN112029881A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-12-04 | 石家庄君乐宝乳业有限公司 | 用于检测副干酪乳杆菌n1115的引物对及应用 |
| CN113475621A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-10-08 | 浙江康星生物科技有限公司 | 一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法 |
-
2021
- 2021-11-30 CN CN202111438428.0A patent/CN113981115A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111286550A (zh) * | 2019-07-18 | 2020-06-16 | 大连民族大学 | 一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用 |
| CN112029881A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-12-04 | 石家庄君乐宝乳业有限公司 | 用于检测副干酪乳杆菌n1115的引物对及应用 |
| CN113475621A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-10-08 | 浙江康星生物科技有限公司 | 一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 余蓉等: "普通高等学校十四五规划医学检验技术专业特色教材 医学检验仪器学 新版", 武汉：华中科技大学出版社, pages: 227 * |
| 黄东儿: "副干酪乳杆菌抑制口腔致病菌的作用研究", 全科口腔医学电子杂志, vol. 5, no. 19, pages 112 - 113 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487943A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-02-02 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种基因片段在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用 |
| CN117487943B (zh) * | 2023-12-29 | 2024-03-19 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种基因片段在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用 |
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