CN114107524A

CN114107524A - 用于核酸快速检测三种肺炎病原菌特征序列及引物和应用

Info

Publication number: CN114107524A
Application number: CN202010873789.7A
Authority: CN
Inventors: 马俭; 马伟; 肖继华; 薛松; 褚海青; 徐凌云; 赵兰; 傅翔
Original assignee: Shanghai Huaxin Intelligent Technology Co ltd; Shanghai Jiaotong University; Shanghai Pulmonary Hospital
Current assignee: Shanghai Huaxin Intelligent Technology Co ltd; Shanghai Jiaotong University; Shanghai Pulmonary Hospital
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2022-03-01

Abstract

本发明涉及一种用于核酸快速检测三种肺炎病原菌特征序列及引物和应用；通过对人体常见病原菌、正常细菌全基因组序列的大数据分析分别获得了肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等常见病原菌的特征序列，针对上述特征序列设计PCR引物，可在2‑3小时内完成确定临床样本中是否存在目标病原菌，其包括特征基因序列、PCR检测的引物序列、扩增反应条件。本发明可用于在临床样本中快速检测肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等常见病原菌；还可用于开发无需从临床样本中分离病原菌、无需进行16sDNA序列测定与分析的肺炎克雷伯菌等病原细菌快速检测试剂盒，为临床病原菌快速检测提供客观、准确的判定依据，实现细菌污染物的快速、一体化鉴定。

Description

用于核酸快速检测三种肺炎病原菌特征序列及引物和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，主要包括但不限于临床病原菌检测领域；涉及一种用于核酸快速检测三种肺炎病原菌特征序列及引物和应用，尤其涉及一种操作简便、能够在2-3小时内确定病原菌种类，显著降低假阳性、假阴性率的核酸快速检测三种肺炎病原菌特征序列及引物和应用。

背景技术

根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计数据显示，耐药细菌感染位列全球十大死因第一，仅2016年就导致近700万人死亡(WHO.WHO,Top 10causes ofdeath.(2017).)。

病原菌的种类、耐药等信息对于治疗方案制定至关重要，但是，目前临床病原菌鉴定采用分离培养加生化鉴定的方法，一般需要5-6天才能确定细菌种类、株型及耐药性。在此期间，使得临床医生不得不依据经验对病人进行治疗，使得治疗效果大受影响。如，感染性休克伴低血压的患者，有效治疗措施每延迟1小时，患者存活率平均下降7.6％(Kumar,A.et al.Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobialtherapy is the critical determinant of survival in human septicshock.Critical care medicine 34,1589-1596,doi:10.1097/01.ccm.0000217961.75225.e9(2006).)。

同时，缺乏患者感染病原菌种类、药敏等信息的情况下，临床医生只能首选使用广谱抗生素进行治疗。广谱抗生素的大量使用，导致病原菌对NCCLS推荐的庆大霉素、头孢噻甲羧肟、哌拉西林等多种一线抗生素耐药性快速发展。使得临床的抗感染治疗越来越困难。如果听任病原菌抗生素耐药按目前趋势发展，20-30年后，人类将重回无抗生素可用的可怕境地。

以鲍曼不动杆菌为例，该菌常见的院内感染病原菌，严重危害老年人、免疫力低下人群生命与健康(Dijkshoorn,L.,Nemec,A.&Seifert,H.An increasing threat inhospitals:multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.Naturereviews.Microbiology 5,939-951,doi:10.1038/nrmicro1789(2007).)。鲍曼不动杆菌可感染呼吸道、皮肤、中枢神经系统等多个部位，由于多耐药、泛耐药等特性，临床治疗非常困难(Qin,H.et al.Comparative transcriptomics of multidrug-resistantAcinetobacter baumannii in response to antibiotic treatments.Scientificreports 8,3515,doi:10.1038/s41598-018-21841-9(2018).)，研究报道，鲍曼不动杆菌临床分离株对氨曲南、左氧氟沙星耐药率均超过了44％(王文欣,周茄,张宇&尚跃丰.EICU重症肺炎患者病原学与耐药性分析.中华医院感染学杂志27,3845-3847+3859(2017).)。

因此，快速、准确地鉴定病原菌种类与抗生素耐药性等对于提升包括鲍曼不动杆菌等感染疗效、控制耐药发展具有重要意义。

相较于高通量测序、质谱、微流控芯片等快速检测新技术，基于聚合酶链式反应(Polymerase Chains Reaction,PCR)、等温扩增等技术的核酸检测，无疑具有灵敏度高、仪器要求低、操作简便等优点(Guillamet,M.C.V.,Burnham,J.P.&Kollef,M.H.NovelApproaches to Hasten Detection of Pathogens and Antimicrobial Resistance inthe Intensive Care Unit.Seminars in respiratory and critical care medicine40,454-464,doi:10.1055/s-0039-1693160(2019).)。

本领域需要一种操作简便、能够在2-3小时内确定病原菌种类，信息检测的技术，对于危重感染患者救治具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于核酸快速检测三种肺炎病原菌特征序列及引物和应用。本发明针对包含多种细菌的临床样本，通过对各病原菌特征片段进行PCR扩增与检测，实现快速鉴定病原菌。基于本发明的特异引物开发的系统和试剂盒，可以提供对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌等目标细菌进行定性、定量检测，不仅可以大大缩短上述病原菌检测时间，还能够显著降低假阳性、假阴性率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种用于核酸快速检测肺炎、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的特征序列系统，包括：

肺炎克雷伯菌检测特征序列：序列如SEQ ID NO.1所示：

GTATCGGTATTTCTGGCTTAGCACAAAACCAGCTGCAGGCGCTGCAAATGTCCTCTTTTTACTTTATCCCTTCCATTATGCTGTCCGGCTTTATTAGCCCCTTTATTAGTATGCCTGACTGGGCGAAAGCCATTGGATCCTGTTTACCGCTGACCTACTTCATCCGC；

大肠杆菌检测特征序列：序列如SEQ ID NO.2所示：

GGTAAAAGGAAACCAGGGGCGGCTAAATAAAGCCTTTGAGGAAAAATTTCCGCTGAAAGAATTAAATAATCCAGAGCATGACAGTTACGCAATGAGTGAAAAGAGTCACGGCAGAGAAGAAATCCGTCTTCATATTGTTTGCGATGTCCCTGATGAACTTA；

鲍曼不动杆菌检测特征序列：序列如SEQ ID NO.3所示：

ACGTCTCTATGCTCCTAATCCTTATTGGACGCGTTATATTCAAGAGAATCATTTAGAGTTAATTTCTATATTGGCTGAACAATTGTCAGAAGGGCGGGTGCGTCAGGTTGAAATCTTGGTAGATTCTCGTCCTGGTAGTATTTTGTCCTCTAGTGAACAGCCTGCAACAACTACAGCAGCTTTACAAACTGCCCCTATACCTCAACCTGCTAAGGTTAAAAGAGAACCGGAACCTGTTGCTAATACTGCAGTTAGTTCTAAGAGTTCAAAAAAGAAACTATTAAATCCACAATTTACTTTTTCACTATTTGTTGAAGGCCGTTCTAACCAAATGGCAGCAGAAACCTGTAGAAA。

本发明还涉及一种用于核酸快速检测肺炎克雷伯菌的特征序列，序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还涉及一种用于核酸快速检测大肠杆菌的特征序列，序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还涉及一种用于核酸快速检测鲍曼不动杆菌检测特的特征序列，序列如SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本发明涉及一种用于核酸快速检测肺炎病原菌的检测特征引物系统，包括：

肺炎克雷伯菌检测特征引物：

正向引物：5’-GTATCGGTATTTCTGGCTTAGCACAAAACC-3’

反向引物：5’-GCGGATGAAGTAGGTCAGCGGTAAACAGGA-3’

大肠杆菌检测特征引物：

正向引物：5’-GGTAAAAGGAAACCAGGGGCGGCTAAATAA-3’

反向引物：5’-TAAGTTCATCAGGGACATCGCAAACAATAT-3’

鲍曼不动杆菌检测特征引物：

正向引物：5’-ACGTCTCTATGCTCCTAATCCTTATTGGAC-3’

反向引物：5’-TTTCTACAGGTTTCTGCTGCCATTTGGTTA-3’。

本发明还涉及一种用于核酸快速检测肺炎克雷伯菌的检测特征引物，其序列如SEQ ID NO.4、5所示。

本发明还涉及一种用于核酸快速检测大肠杆菌的检测特征引物，其序列如SEQ IDNO.6、7所示。

本发明还涉及一种用于核酸快速检测鲍曼不动杆菌的检测特征引物，其序列如SEQ ID NO.8、9所示。

第三方面，本发明还涉及一种由上述的特征序列/系统或检测特征引物/系统制备的用于核酸快速检测肺炎病原菌的产品。

作为本发明的一个实施方案，所述产品为试剂盒。

作为本发明的一个实施方案，所述试剂盒包括检测试剂。

第四方面，本发明还涉及一种检测肺炎病原菌的方法，所述方法使用上述的特征序列/系统或检测特征引物/系统或上述的产品进行检测。

作为本发明的一个实施方案，基于核酸扩增方法进行检测。

作为本发明的一个实施方案，所述方法包括以下步骤：

(a)(采用商业化样本处理试剂盒，对痰液、血液、尿液等临床样本按试剂盒使用说明书方法进行处理、提取)提取样本基因组DNA；

(b)利用所述检测特征引物、采用核酸扩增方法，对步骤(a)提取的样本基因组DNA为模板进行检测；

(c)当样本中出现特定病原菌特征序列特异性扩增产物时，即可判定样本中存在相应的病原菌。

作为本发明的一个实施方案，所述核酸扩增方法包括普通PCR、实时定量PCR(Sybrgreen、Taqman等)、基于重组酶的等温扩增(RPA或RAA)以及基于环介导核酸扩增(LAMP)。

作为本发明的一个实施方案，所述样本包括痰液、血液、尿液。

本发明提供了肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌等病源菌相应的特征序列，可快速、简便鉴别样本中的目标病原菌，其包括以下步骤：

(1)采用Magen公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取待分析细菌的基因组DNA；

(2)将步骤(a)提取的基因组DNA加入含有针对靶细菌特征核酸序列的特异性上游和下游引物的反应体系中，PCR程序如下：

(a)使用(南京)诺唯赞公司的2×Taq Master Mix(Dye Plus)进行扩增目标特征序列；

PCR反应体系为：

混匀后分装入200ul PCR管；

(b)将PCR管放入PCR仪，设置PCR反应程序如下：

步骤1：95℃预变性3分钟；

步骤2：95℃ 15秒，59℃ 15秒，72℃ 15-20秒，运行30个循环

步骤3：72℃ 10min充分延伸

步骤4：4℃ 3min

步骤5：程序结束；

(注：步骤2延伸时长根据具体扩增的特征片段长度而定，检测大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌时延伸时间为15秒，鲍曼不动杆菌为20秒)

(c)扩增产物电泳分析：采用1XTAE缓冲液配制浓度为1.8％琼脂糖凝胶，制胶、上样后，电压130V、电泳20分钟；

(d)电泳结束后，采用凝胶成像仪观察、记录电泳结果，若出现目标扩增条带，则可判定样品中存在对应的细菌。

本发明采用特征引物PCR扩增技术，检测包含多种病原菌、正常细菌、人体细胞的临床样本中是否存在肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌等病原菌。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)在临床病原菌检测应用实践中，患者往往会被多种病原菌感染，同时，肺等器官中还存在数十种正常细菌，本发明通过大数据分析获得的菌种特异特征引物可高效、快速、简便地鉴别不同病原菌以及病原菌与正常细菌，大大提高了检测结果的准确性与效率，有效解决了目前临床病原菌种存在的问题；

2)本发明可用于开发无需从临床样本中分离病原菌、无需进行16sDNA序列测定与分析的肺炎克雷伯菌等病原细菌快速检测试剂盒，为临床病原菌快速检测提供客观、准确的判定依据，实现细菌污染物的快速、一体化鉴定；

3)基于本发明的特异引物开发的系统和试剂盒，可以提供对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌等目标细菌进行定性、定量检测，不仅可以大大缩短上述病原菌检测时间，还能够显著降低假阳性、假阴性率。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为肺炎克雷伯氏菌特征引物检测肺炎克雷伯菌PCR产物电泳结果；其中，M：100bp分子标准，1：Klebsiella pneumoniae RJF999，2：Klebsiella pneumoniae HS11286，3：Escherichia coli M15，4：Escherichia coli DH5α，5：Pseudomonas aeruginosa PAO1，6:Salmonella enterica ATCC 9150，7:Salmonella enterica H9812，8:Acinetobacterbaumanni lac4，9:Acinetobacter baumanni A19-29，10:Klebsiella oxytoca 333，11:Klebsiella aerogenes 316；

图2为肺炎克雷伯菌特征引物检测肺炎克雷伯菌临床株PCR产物电泳结果；其中，M：100bp分子标准，1：K.pneumoniae A2，2:K.pneumoniae A83，3:K.pneumoniae A200，4:K.pneumoniae A220，5:K.pneumoniae A230，6:K.pneumoniae A307，7:K.pneumoniaeA335，8:K.pneumoniae A436，9:K.pneumoniae A438，10:K.pneumoniae A615；

图3为大肠杆菌菌特征引物检测特异性检测PCR产物电泳结果；其中，M：100bp DNA分子标准，1:K.pneumoniae RJF999，2:K.pneumoniae HS11286，3:E.coli M15，4:E.coliDH5α，5:P.aeruginosa PAO1，6:S.enterica ATCC 9150，7:S.enterica H9812，8:A.baumanni lac4，9:A.baumanni A19-29，10:K.oxytoca 333，11:K.aerogenes 316；

图4为鲍曼不动杆菌特征引物检测K.pneumoniae RJF999 PCR产物电泳结果；其中，M：100bp DNA分子标准，1：K.pneumoniae RJF999，2:K.pneumoniae HS11286，3:E.coliM15，4:E.coli DH5α，5:P.aeruginosa PAO1，6:S.enterica ATCC 9150，7:S.entericaH9812，8:A.baumanni lac4。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

术语"特征序列"：指仅存在于目标细菌绝大多数菌株，同时，在人体其他种类细菌中均不存在的序列。

本发明采用特殊分析策略，通过对人体常见病原菌、正常细菌全基因组序列的大数据分析，大大提升了特征序列的特异性、覆盖度等性能指标。具体是基于人体常见病原菌与正常细菌基因组序列的大数据分析，针对挖掘到的特征序列(如SEQ ID NO.1-3)设计引物，实验证明，所得肺炎克雷伯菌、大肠杆菌以及鲍曼不动杆菌特征序列可以灵敏、快速、高特异地检测痰液、血液、尿液等常见临床样本中的肺炎克雷伯菌、大肠杆菌以及鲍曼不动杆菌等临床常见病原菌，为抗生素精准用药提供关键依据。具体见以下各实施例：

肺炎克雷伯菌特征序列：

GTATCGGTATTTCTGGCTTAGCACAAAACCAGCTGCAGGCGCTGCAAATGTCCTCTTTTTACTTTATCCCTTCCATTATGCTGTCCGGCTTTATTAGCCCCTTTATTAGTATGCCTGACTGGGCGAAAGCCATTGGATCCTGTTTACCGCTGACCTACTTCATCCGC SEQ ID NO.1；

大肠杆菌：

GGTAAAAGGAAACCAGGGGCGGCTAAATAAAGCCTTTGAGGAAAAATTTCCGCTGAAAGAATTAAATAATCCAGAGCATGACAGTTACGCAATGAGTGAAAAGAGTCACGGCAGAGAAGAAATCCGTCTTCATATTGTTTGCGATGTCCCTGATGAACTTA SEQ ID NO.2；

鲍曼不动杆菌：

ACGTCTCTATGCTCCTAATCCTTATTGGACGCGTTATATTCAAGAGAATCATTTAGAGTTAATTTCTATATTGGCTGAACAATTGTCAGAAGGGCGGGTGCGTCAGGTTGAAATCTTGGTAGATTCTCGTCCTGGTAGTATTTTGTCCTCTAGTGAACAGCCTGCAACAACTACAGCAGCTTTACAAACTGCCCCTATACCTCAACCTGCTAAGGTTAAAAGAGAACCGGAACCTGTTGCTAATACTGCAGTTAGTTCTAAGAGTTCAAAAAAGAAACTATTAAATCCACAATTTACTTTTTCACTATTTGTTGAAGGCCGTTCTAACCAAATGGCAGCAGAAACCTGTAGAAA SEQ ID NO.3。

实施例1、肺炎克雷伯菌特征引物特异性检测

本实施例用于对临床样本中的肺炎克雷伯菌进行快速核酸检测检测，对每种靶细菌分别采用特异性的引物进行扩增。有效解决了临床样本中同时存在数十种正常细菌、多种病原菌而影响病原菌检测的鉴定的难题。对样本中的目标细菌特征序列进行PCR扩增，实现高灵敏、高特异的检测。

实验具体操作步骤如下：

(1)采用Magen公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA。

(a)使用(南京)诺唯赞公司的Taq Master Mix(Dye Plus)进行扩增目标特征序列。

PCR反应体系为：

混匀后分装入200ul PCR管。

肺炎克雷伯菌检测特征引物：

正向引物：5’-GTATCGGTATTTCTGGCTTAGCACAAAACC-3’SEQ ID NO.4

反向引物：5’-GCGGATGAAGTAGGTCAGCGGTAAACAGGA-3’SEQ ID NO.5。

(b)将PCR管放入PCR仪，设置PCR反应程序如下：

步骤1：95℃预变性3分钟；

步骤2：95℃ 15秒，59℃ 15秒，72℃ 15秒，运行30个循环；

步骤3：72℃ 10min充分延伸；

步骤4：4℃ 3min；

步骤5：程序结束

(3)扩增产物电泳分析：采用1XTAE缓冲液配制浓度为1.8％琼脂糖凝胶，制胶、上样后，电压130V、电泳20分钟。

(4)电泳结束后，采用凝胶成像仪观察、记录电泳结果，若出现168bp的目标扩增条带，则可判定检测菌为肺炎克雷伯菌。

实验结果如图1，1可以看到，肺炎克雷伯氏菌特征引物仅在以K.pneumoniaeRJF999、K.pneumoniae HS11286基因组DNA为模板时才能扩增出168bp的特异产物；而大肠杆菌(E.coli M15,E.coli DH5α,)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa PAO1)、沙门氏菌(S.enterica ATCC 9150,S.enterica H9812)、鲍曼不动杆菌(A.baumanni lac4,A.baumanni A19-29)等7株典型代表模式菌株均未见扩增产物。而且，以肺炎克雷伯菌的同属近缘种产气肺炎克雷伯菌(K.oxytoca 333以及产酸肺炎克雷伯菌(K.aerogenes 316)基因组DNA为模板，亦未见扩增产物，表明本发明的肺炎克雷伯氏菌特征引物能够灵敏区分这两种近缘种。

实施例2、肺炎克雷伯菌特征引物检测临床分离株

为检测本发明的肺炎克雷伯菌特征引物对各肺炎克雷伯菌临床分离株的检测性能，随机选取了10株已经过16SrDNA测序鉴定的肺炎克雷伯菌临床分离株，对本发明的肺炎克雷伯菌特征引物进行了检测。

实验具体操作如下：

(1)对临床采集的痰液、血液、尿液等临床样本，按文献报道方法(《临床微生物学检验技术》作者:刘运德，楼永良主编出版社:人民卫生出版社，出版时间:2015年)进行处理后，涂布于MH琼脂(Mueller Hinton agar)培养基上，37℃培养1-2天。

(2)取菌落颜色、形态类似肺炎克雷伯菌单菌落，进行增菌培养，然后提取基因组DNA，进行16S rDNA序列测定，共确定10株临床分离株(K.pneumoniae A2等)为肺炎克雷伯菌，用于后续实验。

(3)使用Magen公司细菌基因组DNA抽提Kit提取临床菌株基因组。

(4)以步骤(1)提取的基因组DNA为PCR模版，使用(南京)诺唯赞公司的Taq MasterMix(Dye Plus)进行扩增目标特征序列。

(a)PCR反应体系为：

混匀后分装入200ul PCR管。

肺炎克雷伯菌检测特征引物：

正向引物：5’-GTATCGGTATTTCTGGCTTAGCACAAAACC-3’SEQ ID NO.4

反向引物：5’-GCGGATGAAGTAGGTCAGCGGTAAACAGGA-3’SEQ ID NO.5。

(b)将PCR管放入PCR仪，设置PCR反应程序如下：

步骤1：95℃预变性3分钟；

步骤2：95℃ 15秒，59℃ 15秒，72℃ 15秒，运行30个循环

步骤3：72℃ 10min充分延伸

步骤4：4℃ 3min

步骤5：程序结束

(5)扩增产物电泳分析：采用1XTAE缓冲液配制浓度为1.8％琼脂糖凝胶，制胶、上样后，电压130V、电泳20分钟。

(6)电泳结束后，采用凝胶成像仪观察、记录电泳结果，如图2。

从图2可以看到，以随机抽取的K.pneumoniae A2等10株鉴定为肺炎克雷伯菌的临床分离株的基因组DNA为模板，本发明的肺炎克雷伯菌特征引物均扩增出了特征条带，说明该特征引物具有良好的检测各种肺炎克雷伯氏菌临床分离株的特性。

实施例3、大肠杆菌特征引物特异性检测

为检验本发明采用大数据分析获得的大肠杆菌特征引物性能，开展了以K.pneumoniae等7种10株模式菌株进行了检测。

具体操作步骤如下：

(1)使用Magen公司细菌基因组DNA抽提Kit提取K.pneumoniae等7种10株菌的基因组。

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA模版，使用(南京)诺唯赞公司的Taq Master Mix(Dye Plus)进行扩增目标特征序列。

(a)PCR反应体系为：

混匀后分装入200ul PCR管。

大肠杆菌检测特征引物：

正向引物：5’-GGTAAAAGGAAACCAGGGGCGGCTAAATAA-3’SEQ ID NO.6，

反向引物：5’-TAAGTTCATCAGGGACATCGCAAACAATAT-3’SEQ ID NO.7。

(b)将PCR管放入PCR仪，设置PCR反应程序如下：

步骤1：95℃预变性3分钟；

步骤2：95℃ 15秒，59℃ 15秒，72℃ 15秒，运行30个循环

步骤3：72℃ 10min充分延伸

步骤4：4℃ 3min

步骤5：程序结束

(4)电泳结束后，采用凝胶成像仪观察、记录电泳结果，若出现165bp目标扩增条带，则可判定病原菌为大肠杆菌。

结果如图3，从图3可以看到，大肠杆菌特征引物仅在以E.coli M15、E.coli DH5α基因组DNA为模板时才能扩增出165bp的特异产物；而肺炎克雷伯菌(K.pneumoniaeRJF999,K.pneumoniae HS11286)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa PAO1)、沙门氏菌(S.enterica ATCC 9150,S.enterica H9812)、鲍曼不动杆菌(A.baumanni lac4,A.baumanni A19-29)、产气肺炎克雷伯菌(K.oxytoca 333以及产酸肺炎克雷伯菌(K.aerogenes 316)等典型代表模式菌均未见扩增产物。

实施例4、鲍曼不动杆菌特征引物检验

为检验本发明采用大数据分析获得的鲍曼不动杆菌特征引物的检测性能，对K.pneumoniae等6种8株模式菌开展了检测。

具体操作步骤如下：

(1)使用Magen公司细菌基因组DNA抽提Kit提取鲍曼不动杆菌等6种8株细菌的基因组。

(a)PCR反应体系为：

混匀后分装入200ul PCR管。

鲍曼不动杆菌检测特征引物：

正向引物：5’-ACGTCTCTATGCTCCTAATCCTTATTGGAC-3’SEQ ID NO.8，

反向引物：5’-TTTCTACAGGTTTCTGCTGCCATTTGGTTA-3’SEQ ID NO.9。

(b)将PCR管放入PCR仪，设置PCR反应程序如下：

步骤1：95℃预变性3分钟；

步骤2：95℃ 15秒，59℃ 15秒，72℃ 20秒，运行30个循环

步骤3：72℃ 10min充分延伸

步骤4：4℃ 3min

步骤5：程序结束

(3)扩增产物电泳分析：采用1XTAE缓冲液配制浓度为1.5％琼脂糖凝胶，制胶、上样后，电压130V、电泳20分钟。

(4)电泳结束后，采用凝胶成像仪观察、记录电泳结果，若出现355bp目标扩增条带，则可判定检测菌为鲍曼不动杆菌。

结果如图4，从图4可以看到，鲍曼不动杆菌特征引物仅在以A.baumanni lac4基因组DNA为模板时才能扩增出355bp的特异产物；而大肠杆菌(E.coli M15、E.coli DH5α)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae RJF999,K.pneumoniae HS11286)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa PAO1)、沙门氏菌(S.enterica ATCC 9150,S.enterica H9812)等典型代表模式菌均未见扩增产物。表明该特征引物具有良好的特异性。

实施例5、核酸快速检测肺炎病原菌试剂盒

本发明研发了一款用于核酸快速检测肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等肺炎常见病原菌的成套试剂，试剂盒组成主要由本发明针对经大数据分析获得的肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌特征序列设计的三对引物与市售PCR等试剂构成，试剂盒使用说明书具体如下：

(1)委托上海捷瑞生物工程有限公司根据本发明提供的引物序列合成检测引物，具体序列见表1，编号为A、B、C的PCR管已分别加入了1.0×10^-5umol的3对引物。

表1肺炎病原菌检测引物序列

(2)使用天根等公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒，按说明书提取痰液、血液、尿液等临床样本中的细菌基因组DNA。

以步骤(1)提取的基因组DNA模版，使用(南京)诺唯赞公司的Taq Master Mix(DyePlus)进行扩增目标特征序列。

(a)PCR反应体系为：

2×Taq Master Mix 25.0μl

模版(>10ng/μl)： 1.0μl

ddH₂O：加至50.0μl

混匀后分装入200ul PCR管。

(b)将PCR管放入PCR仪，设置PCR反应程序如下：

步骤1：95℃预变性3分钟；

步骤2：95℃ 15秒，59℃ 15秒，72℃ 20秒，运行30个循环

步骤3：72℃ 10min充分延伸

步骤4：4℃ 3min

步骤5：程序结束

(4)电泳结束后，采用凝胶成像仪观察、记录电泳结果，若A管扩增出若出现168bp的目标扩增条带，则可判定临床样本中存在肺炎克雷伯菌。若B管扩增出165bp目标条带，则可判定临床样本中存在大肠杆菌；C管扩增出355bp目标条带，则可判定临床样本中存在鲍曼不动杆菌。

本发明的引物也可适用于实时定量PCR检测。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海市肺科医院，上海交通大学，上海画心智能科技有限公司

<120> 用于核酸快速检测三种肺炎病原菌特征序列及引物和应用

<130> DD08011

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 167

<212> DNA

<213> pneumoniae) 肺炎克雷伯菌(Klebsiella

<400> 1

gtatcggtat ttctggctta gcacaaaacc agctgcaggc gctgcaaatg tcctcttttt 60

actttatccc ttccattatg ctgtccggct ttattagccc ctttattagt atgcctgact 120

gggcgaaagc cattggatcc tgtttaccgc tgacctactt catccgc 167

<210> 2

<211> 161

<212> DNA

<213> coli) 大肠杆菌(Escherichia

<400> 2

ggtaaaagga aaccaggggc ggctaaataa agcctttgag gaaaaatttc cgctgaaaga 60

attaaataat ccagagcatg acagttacgc aatgagtgaa aagagtcacg gcagagaaga 120

aatccgtctt catattgttt gcgatgtccc tgatgaactt a 161

<210> 3

<211> 354

<212> DNA

<213> 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)

<400> 3

acgtctctat gctcctaatc cttattggac gcgttatatt caagagaatc atttagagtt 60

aatttctata ttggctgaac aattgtcaga agggcgggtg cgtcaggttg aaatcttggt 120

agattctcgt cctggtagta ttttgtcctc tagtgaacag cctgcaacaa ctacagcagc 180

tttacaaact gcccctatac ctcaacctgc taaggttaaa agagaaccgg aacctgttgc 240

taatactgca gttagttcta agagttcaaa aaagaaacta ttaaatccac aatttacttt 300

ttcactattt gttgaaggcc gttctaacca aatggcagca gaaacctgta gaaa 354

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtatcggtat ttctggctta gcacaaaacc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggatgaag taggtcagcg gtaaacagga 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtaaaagga aaccaggggc ggctaaataa 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taagttcatc agggacatcg caaacaatat 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgtctctat gctcctaatc cttattggac 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttctacagg tttctgctgc catttggtta 30

Claims

1.一种用于核酸快速检测肺炎、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的特征序列系统，其特征在于，包括：

肺炎克雷伯菌检测特征序列：序列如SEQ ID NO.1所示；

大肠杆菌检测特征序列：序列如SEQ ID NO.2所示；

鲍曼不动杆菌检测特征序列：序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种用于核酸快速检测肺炎病原菌的检测特征引物系统，其特征在于，包括：

肺炎克雷伯菌检测特征引物：

正向引物：5’-GTATCGGTATTTCTGGCTTAGCACAAAACC-3’，

反向引物：5’-GCGGATGAAGTAGGTCAGCGGTAAACAGGA-3’；

大肠杆菌检测特征引物：

正向引物：5’-GGTAAAAGGAAACCAGGGGCGGCTAAATAA-3’，

反向引物：5’-TAAGTTCATCAGGGACATCGCAAACAATAT-3’；

鲍曼不动杆菌检测特征引物：

正向引物：5’-ACGTCTCTATGCTCCTAATCCTTATTGGAC-3’，

反向引物：5’-TTTCTACAGGTTTCTGCTGCCATTTGGTTA-3’。

3.一种由如权利要求1所述的特征序列或权利要求2所述的检测特征引物系统制备的用于核酸快速检测肺炎病原菌的产品。

4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。

5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括检测试剂。

6.一种检测肺炎病原菌的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1所述的特征序列系统、权利要求2所述的检测特征引物系统或权利要求3所述的产品进行检测。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，基于核酸扩增方法进行检测。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)提取样本基因组DNA；

(b)利用所述检测特征引物、采用核酸扩增方法，以步骤(a)提取的样本基因组DNA为模板进行检测；

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增方法包括普通PCR、实时定量PCR、基于重组酶的等温扩增以及基于环介导核酸扩增。

10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述样本包括痰液、血液、尿液。