CN113981117A - 用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物、试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物、试剂盒、检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物、试剂盒、检测方法及其应用，属于快速检测领域。该特异性引物对包括：其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用该引物能快速精准的进行嗜酸乳杆菌的鉴定。同时，应用该引物对进行了口腔护理产品中嗜酸乳杆菌的鉴定，并探索出了该方法的最低检出限为0.00001％，灵敏度高，检测效率高。

Description

用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物、试剂盒、检测方法及 其应用
技术领域
本发明涉及快速检测技术领域，特别是用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物、试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
口腔是一个复杂而完整的微生态系统。生活方式，外源性致病菌等外源因子可扰乱口腔微生物组与其宿主之间的共生关系引发龋齿,牙周炎,牙龈炎,口臭等口腔疾病。益生菌是一类活的并对人类机体局部或全身性健康都具有有益作用的微生物。近十年,各种研究表明益生菌可通过抑制致病菌生长,改善口腔微生物菌群,调节口腔免疫力等方式对各种口腔疾病产生积极的防治效果。乳酸菌(LAB)一直以来被公认为提供健康益处的益生菌,且乳酸菌(LAB)为常用食品补充剂,被认为是高利润的利基市场。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中，释放乳酸、乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，但是抑菌作用比较弱。属于有益菌种，作为一种益生菌，是人和动物肠道中的存活和定植的重要微生物，因该菌无毒无害，常常被制成生物活性食品及微生态制剂，可改善动物肠道微生态平衡、促生长及预防疾病；还可耐受酸和胆汁、消除乳糖不耐症、降低胆固醇、抑制并治疗腹泻及增强机体免疫等。
近年来，发达国家对益生菌的研究较多，我国对益生菌研究较少，尤其对单一嗜酸乳杆菌的研究更少。益生菌的检测对于新食品及日化原料、新食品研制和生产、以及后续产品的质量安全控制来说意义重大。现有的传统检测方法仅限于乳酸菌总数和少数几种益生菌，如GB 4789.35-2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》，GB 4789.34-2016《食品微生物学检验双歧杆菌检验》中公开的检测方法。嗜酸乳杆菌与瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、约氏乳杆菌等的亲缘关系非常接近，很难利用传统的发酵特性来区分它们。同时，口腔护理产品中嗜酸乳杆菌的添加需基于法规对于菌落数的限量要求，添加的嗜酸乳杆菌是灭活菌株，也无法通过传统的生化鉴定进行鉴别，因此，对于嗜酸乳杆菌的分子鉴定显得尤为必要。目前分子学方法主要采用扩增16S保守序列片段，再根据测序结果与NCBI数据库中基因序列进行比对，通过构建系统发育树来确定其亲缘关系与种属，同时也要结合传统生化鉴定才能最终确认。
专利CN 108588245A中运用荧光定量PCR检测嗜酸乳杆菌，其检出限是103CFU/ml，但需要使用荧光定量PCR设备，成本较高。专利CN109423524A中运用eric-pcr鉴定嗜酸乳杆菌，需要引物数量较多，需测序及测序后碱基序列比对分析，操作繁琐，且仅对7个菌种进行特异性鉴定。故亟待开发一种快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物鉴别方法。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明设计一对嗜酸乳杆菌特异性引物，并利用该引物对设计了PCR体系，运用该体系可建立仅运用普通梯度PCR即能很好区分包括嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌等的近缘菌株，且假阳性低，特异性好。能快速鉴别口腔护理产品中的嗜酸乳杆菌，灵敏度好。
为了达到上述目的，本发明的技术方案有：
本发明提供了用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，即：5’-ATCATGAAGTTGATGGACATT-3’；其下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，即：5’-CTTCTTCAAAACATAAACTTGTG-3’。
本发明还提供了用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的试剂盒，包括上述的引物对。
优选地，还包括：PCR mix、DNA模板、ddH2O。
本发明还提供了一种使用上述的引物对检测嗜酸乳杆菌的方法，具体包括：提取待测物的DNA模板，以权利要求1所述的引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若出现381bp的DNA条带，则待测物为唾液乳杆菌。、
优选地，所述PCR扩增反应条件如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃补平10min，4℃保温。
优选地，所述提取待测物的DNA模板的步骤如下：取待测物置于离心管中；12000rpm离心1min，弃上清；向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮。加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min；加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠；将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中；12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul漂洗液PE，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体；将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE；室温放置2min；12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA模板，-20℃保存。
本发明还公开了一种上述的方法在口腔护理产品检测中的应用。
优选地，所述口腔护理产品包括漱口水或牙膏。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明基于嗜酸乳杆菌的tuf基因进行特异性引物设计，设计出一对嗜酸乳杆菌种特异性引物，特异性好。仅运用普通梯度PCR及琼脂糖电泳即能很好区分包括唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌等的近缘菌株，假阳性低，无需测序及测序后碱基序列比对分析，也避免灭活菌无法进行生化鉴定确认的问题。
(2)对口腔护理产品中DNA提取过程进行开发和优化，DNA提取得率高，适用于口腔护理产品中嗜酸乳杆菌的检测。
(3)利用本发明提供的检测方法检测口腔护理产品中的嗜酸乳杆菌，检测限低，灵敏度高，最低检测限为0.00001％(103CFU/g)。
(4)该方法操作简单，对设备要求不高，仅需普通梯度PCR仪，无需荧光定量PCR仪，适合普通实验室开展检测。
附图说明
图1为嗜酸乳杆菌特异性检测琼脂糖凝胶电泳结果图；
其中，Marker为2000bp，条带从下至上依次为100、250、500、1000、1500、2000bp六个条带；图中编号1：嗜酸乳杆菌、2：嗜酸乳杆菌、3：唾液乳杆菌菌粉、4：植物乳杆菌菌粉、5：长双歧杆菌菌粉、6：罗伊氏乳杆菌菌粉、7：鼠李糖乳杆菌菌粉、8：瑞士乳杆菌、9：加氏乳杆菌、10：约氏乳杆菌、11：变异链球菌。
图2为不同浓度嗜酸乳杆菌添加量漱口水的检测琼脂糖凝胶电泳结果图；
其中，Marker为2000bp，条带从下至上依次为100、250、500、1000、1500、2000bp六个条带。图中编号1：嗜酸乳杆菌阳性对照、2：0.001％、3：0.0001％、4：0.00001％、5：0.000001％、6：阴性对照(ddH2O)。
图3为不同浓度嗜酸乳杆菌添加量牙膏的检测琼脂糖凝胶电泳结果图；
其中，Marker为2000bp，条带从下至上依次为100、250、500、1000、1500、2000bp六个条带。图中编号1：0.005％、2：0.0005％、3：0.00005％、4：0.000005％、5：阴性对照(ddH2O)。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表达的范围。
实施例1：筛选用于嗜酸乳杆菌的特异性引物
本发明通过嗜酸乳杆菌已公布的tuf基因为目标，在NCBI(National Center forBiotechnology Information)数据库上下载多条已知嗜酸乳杆菌tuf基因序列(NC_021181.2、>AJ418902.2)，同时下载多条与之相关的近缘菌株tuf基因序列如嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、瑞士乳杆菌等。然后利用DNAMAN软件进行目标菌株与非目标菌株tuf基因序列比对，筛选出目标序列保守而针对非目标菌株特异的碱基进行筛选标记，遵循引物3’端延伸过程因非目标序列碱基不匹配原则而终止扩增的原则进行引物设计，同时充分考虑引物的二聚体和发夹结构等影响因素，过程利用Premier primer 5.0软件进行引物辅助设计，最终设计引物的扩增片段长度起始位置为568～968bp之间，共计381bp的长度。设计好的引物在NCBI数据库primer Blast上进行引物比对验证特异性，最后将筛选出引物进行华大基因合成，筛选出的引物序列如下：
正向引物：5’-ATCATGAAGTTGATGGACATT-3’
反向引物：5’-CTTCTTCAAAACATAAACTTGTG-3’
实施例2：利用实施例1所述的特异性引物鉴定嗜酸乳杆菌的方法
(1)嗜酸乳杆菌DNA提取
取对数生长期菌液置于离心管中。12000rpm离心1min，弃上清。向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮。加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min。加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠。将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗也PE，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE。室温放置2min。12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA，-20℃保存。
采用试剂盒为广州东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)
(2)PCR(聚合酶链式反应)及琼脂糖凝胶电泳实验
PCR扩增体系为：12.5ul PCR mix，上游引物各1ul，DNA模板2ul，ddH2O8.5ul，反应总体积25ul。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，变性94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃补平10min，4℃保温。
2％琼脂糖凝胶电泳：电压90V，电泳时长40min。
(3)嗜酸乳杆菌特异性检测
如附图1，编号1-11分别对应1：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(北京北纳生物BNCC185342)、2：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus paracasei)(北京北纳生物BNCC337289)、3：唾液乳杆菌(saliva Lactobacillus)菌粉(润盈生物工程)、4：植物乳杆菌菌粉(微康益生菌)、5：长双歧杆菌菌粉(微康益生菌)、6：罗伊氏乳杆菌菌粉(润盈生物工程)、7：鼠李糖乳杆菌菌粉(微康益生菌)、8：瑞士乳杆菌(Lactobacillus suis)(北京北纳生物BNCC187926)、9：加氏乳杆菌(Lactobacillus gargari)(北京北纳生物BNCC135322)、10：约氏乳杆菌(Lactobacillus yoelii)(北京北纳生物BNCC135265)、11：变异链球菌(Streptococcus mutans)(北京北纳生物BNCC336931)，共计11种菌株进行特异性检测，结果显示仅嗜酸乳杆菌在381bp处出现清晰的条带，表明此引物对检测嗜酸乳杆菌的特异性非常好。
实施例3：漱口水中嗜酸乳杆菌DNA提取及使用该方法检测漱口水产品
用含量1010CFU/g的嗜酸乳杆菌菌粉制作一系列不同浓度嗜酸乳杆菌添加量的漱口水0.001％、0.0001％、0.00001％，0.000001％每个浓度梯度漱口水均吸取2ml置于无菌离心管中。
(1)DNA提取
将离心管中1ml漱口水12000rpm离心1min，弃上清。向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮。加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min。加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠。将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗也PE，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE。室温放置2min。12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA，-20℃保存。
(2)PCR扩增
PCR扩增体系为：12.5ul PCR mix，上游引物各1ul，DNA模板2ul，ddH2O 8.5ul，反应总体积25ul。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，变性94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃补平10min，4℃保温。
最后测得漱口水中嗜酸乳杆菌的最低检测限为0.00001％(103CFU/g)。
实施例4：牙膏中嗜酸乳杆菌DNA提取及使用该方法检测牙膏产品
用含量1010CFU/g的嗜酸乳杆菌菌粉制作一系列不同浓度嗜酸乳杆菌添加量的牙膏，浓度分别为0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％四个不同浓度，每个浓度梯度牙膏均称取1g，进行10倍稀释，将稀释后样品3000rpm离心1min，吸取上清液2ml置于另一无菌离心管中，12000rpm离心2min。
(2)DNA提取
采用的试剂盒为广州东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)，将收集到的上清液进行12000rpm离心1min，弃上清。向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮。加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min。加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠。将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗也PE，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE。室温放置2min。12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA，-20℃保存。
(3)PCR扩增
PCR扩增体系为：12.5ul PCR mix，上游引物各1ul，DNA模板2ul，ddH2O8.5ul，反应总体积25ul。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，变性94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃补平10min，4℃保温。
2％琼脂糖凝胶电泳，电压90V，电泳时长40min，
(4)结果分析
如图3所示，1-5分别为0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％嗜酸乳杆菌添加量的益生菌牙膏，最后测得牙膏中嗜酸乳杆菌的最低添加量为0.0001％(104CFU/g)时能够被检出，说明该方法的样品检测限低、灵敏度高。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州舒客实业有限公司
<120> 用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用
<130> 2021.11.22
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcatgaagt tgatggacat t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttcttcaaa acataaactt gtg 23

Claims (8)

1.用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物对，其特征在于，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括：PCRMIX、DNA模板、ddH2O。
4.一种使用如权利要求1所述的引物对检测嗜酸乳杆菌的方法，其特征在于，提取待测物的DNA模板，以权利要求1所述的引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若出现381bp的DNA条带，则待测物含有嗜酸乳杆菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃补平10min，4℃保温。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提取待测物的DNA模板的步骤如下：取待测物置于离心管中；12000rpm离心1min，弃上清；向收集到的菌体沉淀中加入200ul缓冲液DS，用涡旋振荡器剧烈震荡至菌体彻底悬浮；加入20ul蛋白酶K，55℃水浴30min；加入220ul裂解液MS，涡旋震荡混匀，直至形成均一的悬浮液，65℃温浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；加入220ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠；将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中；12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul漂洗也PE，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500ul漂洗液再漂洗一次，弃滤液，12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体；将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中；向纯化柱中央处，悬空滴加30-100ul洗脱液TE；室温放置2min；12000rpm离心2min，管底即为纯的DNA模板，-20℃保存。
7.一种如权利要求4-5任一项所述的方法在口腔护理产品检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述口腔护理产品包括漱口水或牙膏。
CN202111439523.2A 2021-11-30 2021-11-30 用于快速鉴定嗜酸乳杆菌的特异性引物、试剂盒、检测方法及其应用 Pending CN113981117A (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108588245A (zh) * 2018-04-19 2018-09-28 上海市质量监督检验技术研究院 乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量pcr检测方法、检测试剂盒及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Title
SEN-JE SHEU等: "Development and use of tuf gene-based primers for the multiplex PCR detection of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei group, Lactobacillus delbrueckii, and Bifidobacterium longum in commercial dairy products", J FOOD PROT *

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