CN112029884B - 用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法 - Google Patents

用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112029884B
CN112029884B CN202011049128.9A CN202011049128A CN112029884B CN 112029884 B CN112029884 B CN 112029884B CN 202011049128 A CN202011049128 A CN 202011049128A CN 112029884 B CN112029884 B CN 112029884B
Authority
CN
China
Prior art keywords
paracasei
lactobacillus
lactobacillus casei
rhamnosus
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011049128.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112029884A (zh
Inventor
张淑红
黄远斌
吴清平
张菊梅
丁郁
薛亮
陈谋通
王涓
叶青华
陈玲
谢新强
李滢
杨小鹃
庞锐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Original Assignee
Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology filed Critical Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority to CN202011049128.9A priority Critical patent/CN112029884B/zh
Publication of CN112029884A publication Critical patent/CN112029884A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112029884B publication Critical patent/CN112029884B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法。鉴定干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的特异性分子标记，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。本发明公开的新分子检测靶标对目标菌具有高特异性。公开的PCR方法包括检测靶标PCR引物设计和PCR体系检测。本发明能有效鉴定干酪乳杆菌群中的不同亚种，具有快速、准确、经济和操作简单等优点，便于食品企业和检验机构使用。

Description

用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鉴定干酪乳杆菌类群(干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)的分子标记、检测引物和检测方法。
背景技术：
干酪乳杆菌广泛存在于奶酪、面包、泡菜、人体口腔肠道等环境，具有调节肠道菌群、促进人体消化吸收以及增强免疫等多种保健作用。食品应用方面，干酪乳杆菌不仅可以增进发酵食品的营养价值、改善口感和风味，还能够产生抗菌物质、延长发酵食品的保存时间，在益生菌领域具有十分广阔的开发应用前景。
干酪乳杆菌在细菌分类学上属于乳杆菌属(Lactobacillus spp.)干酪乳杆菌种(Lactobacillus casei)。从发现至今，干酪乳杆菌及亚种的分类一直存有争议，种内系统发育关系随着分子生物学技术的发展不断被提出新的质疑。干酪乳杆菌在1971年被鉴定为新种，但其特征在1996年被首次证实，L.casei ATCC 334被认为是该物种的代表菌株。2000-2001年Felis和Chen等人通过recA基因和23S-5srRNA基因间间隔区序列比较，认为干酪乳杆菌需重新分类。2002年，Dellaglio提议将干酪乳杆菌L.casei ATCC393重新分类为L.zeae，副干酪乳杆菌重新分类为L.casei ATCC 334。2008年，干酪乳杆菌标准菌株被确认为L.casei ATCC 393，而L.casei ATCC 334菌株被认为代表了一个单独的分类群—副干酪乳杆菌L.paracasei。目前，部分学者将干酪乳杆菌划归为干酪和副干酪两亚种，但有学者认为这两个亚种高度相似，可归为一种。现有的文献资料表明，大多数学者认可1989年Collins对L.casei进行的重新分类，将之前鉴定的亚种分别归为2个新种——副干酪乳杆菌(L.paracasei)和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)。近年来关于干酪乳杆菌分类学的争论导致干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌在文献及NCBI数据库中互用。
目前，干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌已被国家食品药品监督管理局批准作为益生菌可用于保健食品生产，卫生部2010年4月22日出台的《可用于食品的菌种名单》，也允许将这几种乳酸菌作为普通食品使用。对于乳杆菌鉴定，大多数的食品检测机构主要采用传统的生理生化试验和16S rDNA测序来完成，包括菌落特征观察、糖、醇类发酵、产酸试验，结合通用引物27F和1541R对菌株的16S rDNA片段进行扩增、产物测序比对等过程。然而，这些近缘种的形态特征非常相似，生理生化方法往往无法准确鉴定，且操作烦杂，鉴定周期较长。法国梅里埃的API 50 CHL试剂条可用于乳酸杆菌生化鉴定，但价格昂贵，检测成本高。Huang用MALDI Biotyper结合ClinProTools芯片进行干酪乳杆菌群鉴定，鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌未能获得很好的区分。常规16S rDNA序列同源性分析可辅助乳酸菌分子鉴定，但部分干酪/副干酪和鼠李糖16S rDNA序列相似性达到97％以上，不能鉴定到亚种。pheS和recA对于区分乳杆菌具有一定参考意义，但是部分序列同源性高的菌株，仍无法准确区分。因此，迫切需要寻找新的特异性分子检测靶标对干酪乳杆菌群进行准确分类鉴定。随着微生物全基因组测序技术的发展，基于全基因组序列比对分析，筛选种间特异性分子检测靶标，可建立高通量、特异、高效的PCR鉴定方法，实现干酪乳杆菌群及近缘种快速、准确鉴定。
发明内容：
本发明的目的是提供一种用于鉴定干酪乳杆菌类群(干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)的特异性分子标记。
本发明在筛选干酪/副干酪乳杆菌分子标记时，对NCBI数据中所有已测序干酪/副干酪乳杆菌菌株进行了泛基因组分析，聚类结果证实二者存在高度相似的基因组序列，无法进行有效区分。因此，本发明依据最新的测序数据并参考文献中分类，将干酪乳杆菌和副干酪合并归为一类，按照干/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌亚类筛选新的检测靶基因。
本发明基于全基因组比对分析筛选出干酪乳杆菌类群中干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的特异分子检测靶标，针对新靶标设计引物进行PCR扩增，可特异性鉴定目标菌，这些新的分子检测靶标未见报道。与16S rDNA PCR方法和生理生化方法相比，本发明中建立的PCR方法具有更高特异性，可减少部分菌株的测序过程，缩短了鉴定周期，降低了检测成本，特别适合大批量菌株的快速鉴定，从而实现了本发明的目的。
本发明的鉴定干酪乳杆菌类群(干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)的特异性分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示
本发明的第二个目的是提供一种鉴定干酪乳杆菌类群(干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)的鉴定引物组，包括以下3对引物：
Paracasei_00592-1-F：5'-AGGCTTGGCTTGGGTGTATC-3'
Paracasei_00592-1-R：5'-CCGTTTGTGACAGGTGCTTG-3'
Paracasei-_00471-F：5'-ACCGGTTTGATTGGCAACAC-3'
Paracasei-_00471-R：5'-ATGAAGCCAGCGGAGATACC-3'
Rhamnosus-Ydap4-F：5'-GATTGATACGCAGCCGGAGA-3'
Rhamnosus-Ydap4-R：5'-TCAGCATTACTGTGTGCGGT-3'
本发明的第三个目的是提供一种鉴定干酪、副干酪和鼠李糖乳杆菌菌株的试剂盒，其包括PCR反应试剂和上述鉴定引物组。
本发明的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的鉴定干酪、副干酪和鼠李糖乳杆菌菌株的方法，其包括以下步骤：
提取待检测菌株的基因组DNA，以上述鉴定引物组为扩增引物，分别进行PCR反应，观察扩增产物的有无，判断是否为目标菌，如果出现预期大小的单一条带，则说明为阳性菌株，如果没有出现目的条带，说明不属于目标菌。
具体是经PCR扩增和电泳检测，若出现目标基因_genomic_00592条带(326bp，Paracasei_00592-1引物扩增片段)和_genomic_00471条带(662bp，Paracasei-_00471引物扩增片段)，可判断菌株为干酪/副干酪乳杆菌。若出现目的基因Putative thiaminepyrophosphate-containing protein YdaP条带(648bp，Rhamnosus-Ydap4扩增片段)，则鉴定为鼠李糖乳杆菌。
所述的PCR反应，其PCR反应体系组成为：浓度为10μmol/L的上、下游靶标DNA特异性引物1.0μL，1.5U Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，DNA模板2.0μL，补足无菌去离子水25μL。
所述的PCR反应程序，95℃预变性5min；95℃变性1min，55-60℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。
本发明公开了一种干酪乳杆菌群中干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的特异性PCR方法，能够快速鉴定目标菌。本发明公开的新分子检测靶标对目标菌具有高特异性。公开的PCR方法包括检测靶标PCR引物设计和PCR体系检测。经PCR扩增和电泳检测，若出现目标基因_genomic_00592条带(326bp)和_genomic_00471条带(662bp)，可判断菌株为干酪/副干酪乳杆菌。若出现目的基因Putative thiamine pyrophosphate-containing proteinYdaP条带(648bp)，则鉴定为鼠李糖乳杆菌。本发明能有效鉴定干酪乳杆菌群中的不同亚种，具有快速、准确、经济和操作简单等优点，便于食品企业和检验机构使用。
附图说明：
图1是引物Paracasei_00592-1扩增片段电泳图；其中1-6 para副干酪乳杆菌、7casei干酪乳杆菌CICC 23185、8 helv瑞士乳杆菌、9 plant植物乳杆菌、10 wei类肠膜魏斯氏菌、11 fer发酵乳杆菌、12 rh鼠李糖乳杆菌、13 cur弯曲乳杆菌、14 leu肠膜状明串珠菌、15 acid嗜酸乳杆菌、16 Pen戊糖乳杆菌、17单核细胞增生李斯特菌CMCC54004、18蜡样芽孢杆菌CMCC63301、19粪链球菌、20金黄色葡萄球菌ATCC29213、21大肠杆菌O157ATCC35150、22阴性对照；
图2是引物Paracasei-_00471扩增电泳图，其中1-6 para副干酪乳杆菌、7 casei干酪乳杆菌CICC 23185、8 helv瑞士乳杆菌、9 plant植物乳杆菌、10 wei类肠膜魏斯氏菌、11 fer发酵乳杆菌、12 rh鼠李糖乳杆菌、13 cur弯曲乳杆菌、14 leu肠膜状明串珠菌、15acid嗜酸乳杆菌、16 Pen戊糖乳杆菌、17单核细胞增生李斯特菌CMCC54004、18蜡样芽孢杆菌CMCC63301、19粪链球菌、20金黄色葡萄球菌ATCC29213、21大肠杆菌O157ATCC35150、22阴性对照；
图3是引物Rhamnosus-Ydap4扩增电泳图，其中1-4鼠李糖乳杆菌、5 acid嗜酸乳杆菌、6 casei干酪乳杆菌CICC 23185、7 cur弯曲乳杆菌、8 fer发酵乳杆菌、9 wei类肠膜魏斯氏菌、10 helv瑞士乳杆菌、11 plant植物乳杆菌、12 pen戊糖乳杆菌、13 leu肠膜状明串珠菌、14 para副干酪乳杆菌、15蜡样芽孢杆菌CMCC63301、16单核细胞增生李斯特菌CMCC54004、17粪链球菌、18金黄色葡萄球菌ATCC29213、19大肠杆菌O157ATCC35150、20阴性对照；
图4是酸奶中干酪/副干酪乳杆菌检测结果图，其中M:2000bp marker 1-4为用引物Paracasei_00592-1扩增；
图5是酸奶中干酪/副干酪乳杆菌检测结果图，其中M:2000bp marker 1-4为用引物Paracasei-_00471扩增；
图6是益生菌粉中鼠李糖乳杆菌检测结果图，其中M:2000bp marker 1-2为用引物Rhamnosus-Ydap4扩增。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
(1)序列筛选
从NCBI数据库下载的干酪乳杆菌群及近缘种的完成图全基因组序列。采用软件(Pan-Genomics Analysis Pipeline，PGAP)中MP方法进行泛基因组分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，获得所有菌株的核心基因及非必须基因信息。根据泛基因组分析结果筛选菌株特有的非必需基因，提取乳杆菌及近缘属种特有的非核心基因蛋白序列，通过本地Blast分别将其比对乳杆菌的蛋白总库及NCBI非冗余蛋白数据库(NR)。除去匹配的共有蛋白的序列，筛选出干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌特定标记基因。通过数据库blast比对，验证所筛选的分子靶标属于目标菌特有核苷酸序列，其他非目标菌不含有该基因片段，表明筛选的基因片段具有高特异性。通过分析共筛选到3个特异性靶标片段(干酪/副干酪2个，鼠李糖乳杆菌1个)与文献比对，未见与本研究相同的分子标记。
因此通过对NCBI数据库中干酪乳杆菌群及近缘种的全基因组序列比对筛选，获得干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌特异性分子检测靶标，包括：
1、副干酪/副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)靶标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示；
2、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus Rhamnosus)靶标序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
(2)引物设计
提供3套引物PCR鉴定干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的检测引物组，该检测引物组对新分子靶标具有特异性。
表1 干酪/副干酪乳杆菌引物序列
Figure BDA0002708995120000071
表2 鼠李糖乳杆菌引物序列
Figure BDA0002708995120000072
(3)鉴定方法
提供一种干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌特异性PCR鉴定方法，以新分子靶标为目的基因，通过PCR法用上述检测引物组对菌体DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。
具体步骤如下：
(1)菌株DNA提取
将待鉴定菌株于乳酸菌MRS肉汤复苏24h-48h，取1mL细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μL细菌DNA提取试剂盒的裂解液，充分悬浮混匀，于100℃水浴15min，冰浴3min，12000r/min离心10min，取上清液备用，该上清液含有细菌的DNA，作为模板DNA。
(2)PCR扩增
PCR采用25μL反应体系，其中浓度为10μmol/L的每条靶标DNA特异性引物1.0μL，1.5U Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，DNA模板2.0μL，无菌去离子水补足25μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
(3)PCR反应产物的检测
扩增后的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像分析系统UVI观察结果并拍照。观察扩增产物的有无，判断是否为目标菌。如果出现预期大小的单一条带，则说明为阳性菌株，如果没有出现目的条带，说明不属于目标菌。
经PCR扩增和电泳检测，若出现目标基因_genomic_00592条带(326bp)和_genomic_00471条带(662bp)，可判断菌株为干酪/副干酪乳杆菌。若出现目的基因Putativethiamine pyrophosphate-containing protein YdaP条带(648bp)，则鉴定为鼠李糖乳杆菌。
实施例1：干酪/副干酪乳杆菌鉴定
1、细菌DNA的提取
取1mL细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μL细菌DNA提取试剂盒的裂解液，充分悬浮混匀，于100℃水浴15min，冰浴3min，12000r/min离心10min，取上清液备用，该上清液含有细菌的DNA，作为模板DNA。
2、PCR扩增
PCR采用25μL反应体系，其中浓度为10μmol/L的上、下游靶标DNA特异性引物1.0μL，1.5U Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，DNA模板2.0μL，无菌去离子水补足25μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
3、电泳观察结果
扩增结束后的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像分析系统UVI观察结果并拍照。以引物Paracasei_00592-1进行PCR扩增，干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌均可扩增出326bp单一条带(图1)，以引物Paracasei-_00471进行PCR扩增，干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌均扩增出662bp单一条带(图2)。这些鉴定结果与MALDI-TOF质谱鉴定结果一致，证明此方法数据可靠。其他非目标菌没有扩增条带。
实施例2：鼠李糖乳杆菌鉴定
1、细菌DNA的提取
取1mL细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μL细菌DNA提取试剂盒的裂解液，充分悬浮混匀，于100℃水浴15min，冰浴3min，12000r/min离心10min，取上清液备用，该上清液含有细菌的DNA，作为模板DNA。
2、PCR扩增
PCR采用25μL反应体系，其中浓度为10μmol/L的上、下游靶标DNA特异性引物1.0μL，1.5U Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，DNA模板2.0μL，无菌去离子水补足25μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
3、电泳观察结果
扩增结束后的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像分析系统UVI观察结果并拍照。以引物Rhamnosus-Ydap4进行PCR扩增，鼠李糖乳杆菌均可扩增出单一条带(图3)，鉴定结果为阳性菌株，与MALDI-TOF质谱鉴定结果一致。
实施例3：实际样品检测
1、样品处理
市场销售的奶酪和益生菌粉，取1-2g加入到10mL MRS肉汤中，37℃培养48h，取1mL菌液，离心收集菌体，加入50μLDNA裂解液，充分悬浮混匀，于100℃水浴15min，冰浴3min，12000r/min离心10min，取上清为模板DNA。另用接种环划线接种MRS平板，37℃培养48h，取单菌落进行DNA提取、PCR鉴定和质谱鉴定。
2、PCR扩增
PCR采用25μL反应体系，其中浓度为10μmol/L的上、下游靶标DNA特异性引物1.0μL，1.5U Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，DNA模板2.0μL，无菌去离子水补足25μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
3、PCR反应产物的检测
扩增后的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像分析系统UVI观察结果并拍照。以引物Paracasei_00592-1进行PCR扩增，干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌均可扩增出326bp单一条带(图4)，以引物Paracasei-_00471进行PCR扩增，干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌均扩增出662bp单一条带(图5)，说明样品中存在干酪/副干酪乳杆菌。以引物Rhamnosus-Ydap4进行PCR扩增，出现648bp条带(图6)，说明样品中存在鼠李糖乳杆菌。菌株鉴定结果与质谱鉴定一致。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 912
<212> DNA
<213> 副干酪/副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 1
atgaaaaaag catgggtata cgggttagct gccaggcttg gcttgggtgt atcagcggtg 60
attgctaatc aggcatcagc ttccgcagca acagtgccga ttgtgattca atcagcgaca 120
tcgaaatgcg acactggttc tgcgccggat catggggcat cacaatcagc gatcgtacca 180
ccgattgctg acaacaaggt tgaagtacca attgtcacgg tttcaagcga tgatgatcaa 240
aaggcgggca ataccagcag tgcggatagt tcatcggttt catcgagtca gcaaaatggg 300
gcagcaacat cggacacagg tgcggaaact gtgggcagtc aagcacctgt cacaaacggg 360
aatgttacat cgtcagcaac cgcgcagcaa gatgatcgtg atgcacaccc gtcagtttct 420
gaaccaatga ttaaaacggc acaagaagtt aatgcgacag aagcaagctc gtctaaagca 480
ccgacgagta aagagcggga tgaacaggca attgttgctg cagcgcaagc ggcaacacat 540
gataatgtga aatcaggcca cacaatatct gtggtcccgg agagtgtgac ttcttttatc 600
ggttcaaccc ataagcagcc gcagaatgct tttgagatta tttggcaggc gttgattgag 660
actgttcaga tgcgacagca atgcccaaca aatctgattc aaaatttagt gctggggatg 720
ccgcagccaa attttgactt tgtgcaatcg acatttatcg caacgaaaag ggaactcagc 780
aaggcgtttt cttcgcctgt ttttgggaag tcccttcaac tagatagcct gtcgccgttc 840
aatcaggttt ttggcaagat gatcaacttg atcgatcaag tgttgttgac acatcttgtt 900
ttcccagatt aa 912
<210> 2
<211> 930
<212> DNA
<213> 副干酪/副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 2
atggtgacag cagcagataa tattaccggt ttgattggca acaccccttt gcttaagcta 60
aatcgtgtcg tcccagaaga tgcagcagat gtttatgtga agcttgaatt ctttaatccc 120
ggcggttctg tcaaagaccg aattgccttg gccatgattg aagatgccga atacaagggc 180
gttttgaagc caggcggcac cattgttgaa ccaacatctg gcaacactgg catcggcttg 240
gccttggtcg ccgcggctaa aggctaccac ctgatcatca cgatgccaga aacgatgagt 300
gttgaacgtc gtgcgttaat gcggggctat ggcgccgaat tgattctgac accaggggcg 360
gatggcatgc cgggtgcgat taaaaaagct caggcactca gcaaggaaaa tggttacttc 420
ttgccgatgc agttccaaaa tccggctaat ccggatgtgc acgagcgcac caccggtcaa 480
gaaatcatcc gttcttttga tggcggcacc ccagacgcct tcgttgctgg cgtgggcaca 540
ggcggcacgt tgaccggggt tggccgggcg ttgcggaaaa tcaacccgca agtgcaaatt 600
tatgcacttg aagcagctga gtcaccaatg ctcaaagaag ggcacggcgg caagcataag 660
atccaaggta tctccgctgg cttcatccca gacgttttgg ataccaacct ataccaagac 720
attattgaag tcaccagcga ccaagccatc gacatggctc gtcacgttag ccacgaagaa 780
ggcttcctgc caggcatctc tgccggcgcc aatattttcg gtgccattga aattgctaag 840
aaacttggca aaggcaagag cgtggtaaca gtcgcgccgg ataatggtga acgatacttg 900
tcaacggact tgtttaagtt cgaagattaa 930
<210> 3
<211> 1734
<212> DNA
<213> 副干酪/副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 3
atggcaacaa aagcagcgga tcagttagtc agcgtcttga tggattggca ggttaagcat 60
gtgtttggct tacctggtga ctccattgac accaccgtgg atgctttacg gcgccaacaa 120
gataagatca agttcgttca ggtacgccac gaagaagtcg ccgcactggc tgctgcatca 180
acggctaagc tgacaggtgg cctcgggggt tgcttgtcaa tcggcggacc cggcgcgatt 240
catctattga atggcctgta tgatgccaaa atggatcatg tccctgtact ggcgttatta 300
gggcaagtca caaccagtaa cttaaatgaa ggctttttcc aggaagtcaa cacgcctaag 360
ctattcgatg acgtggcggt ttacaacaaa accgtcatgg cgtcggataa tttaggccag 420
atcgttgaca cggctattcg caccgcgttc acggaaaaag gcgttgcggt gttgacgatt 480
cccgacgact tgcctgatca aaaggaaacc accagttatc gcgacagtgc agcggcgttt 540
gctttgaatg taccggaagt ggatcctaag cagttggatg atgtggcttc gcttttgcaa 600
aagtcccaga aacctttagc cttgattggt cgcggggcgg aaaaagccgg tgaagccgtt 660
caaaaatttg tcgaaacgaa tcacatcccg tttattcaga ccatgccggc gaaaggaacg 720
gtggcagacg atcatccgaa tagcctcggt aatgtcggca agctcgggac gaagcctgcg 780
tatgaagcca tgaaggcaac agatctgctg ttcatgatcg ggaccaatta tccatacacc 840
ccttatttac cagatacagg gcaggctaag tgtgtccaga ttgatacgca gccggagaac 900
ttaggcaagc ggtattcggt tgatgttgcc gtggacggcg atgtcggtgc ctttttaacc 960
gaactgaatg ctaagggagc tttgcgtgat gatgatcgct tcttgaaggc atgccggaag 1020
aatatggaaa gttgggacaa atggatggcc gaaaaacggt tactggatac gaaccctgcc 1080
tcaccggaag ccgtctttgc gacaattgac caaacggcac ctaaagatgc ggtttactcg 1140
attgatgtcg gcacgtcaac gtcttggggt gcccgttttc tcaatgtcca gccaacgcag 1200
aagtatacga tttctgcgtg gttagggacg atgggctgcg ggttgcctgg tgcgattgcg 1260
ggtgccgagg catttccaaa gcggcaaaat atcagcgtgg ccggtgacgg tgcttttgcc 1320
atggtcatgc aggattttgt cacggcggtc aagtataagc tgccaatcat catggtggtt 1380
ttgaataatc aaaagcttgc cttcattgaa tacgaacaac aaagcgccgg tcagttgaat 1440
tatgaaattg atttggccga catggattac gccaaaattg ccgaggccgc tggtggcgtt 1500
ggctataccg cacacagtaa tgctgaattt aaagaggcac tcaccaaagc ctatcaagaa 1560
acagacaagc cggttttgat caatacctat gttcaagacg acgcgccact accaggaaaa 1620
attgttggtg aagaagcgaa aggctacatg aagtatggct cccagtatct tgaaaattat 1680
tggaagattc cttccatgcc gccattgaaa gatattatgc ggcaattctt ctaa 1734

Claims (6)

1.鉴定干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的特异性分子标记组合，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
2.一种鉴定干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的鉴定引物组，其特征在于，包括以下3对引物：
Paracasei_00592-1-F：5'-AGGCTTGGCTTGGGTGTATC-3'
Paracasei_00592-1-R：5'-CCGTTTGTGACAGGTGCTTG-3'；
Paracasei-_00471-F：5'-ACCGGTTTGATTGGCAACAC-3'
Paracasei-_00471-R：5'-ATGAAGCCAGCGGAGATACC-3'；
Rhamnosus-Ydap4-F：5'-GATTGATACGCAGCCGGAGA-3'
Rhamnosus-Ydap4-R：5'-TCAGCATTACTGTGTGCGGT-3'。
3.一种鉴定干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应试剂和权利要求2所述的鉴定引物组。
4. 一种非疾病的诊断和治疗目的的鉴定干酪/副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待检测菌株的基因组DNA，以权利要求2所述的鉴定引物组为扩增引物，分别进行PCR反应，观察扩增产物的有无，判断是否为目标菌，如果出现预期大小的单一条带，则说明为阳性菌株，如果没有出现目的条带，说明不属于目标菌
所述的预期大小的条带是：
Paracasei_00592-1-F/R扩增产物大小为326bp；
Paracasei-_00471-F/R扩增产物大小为662bp；
Rhamnosus-Ydap4-F/R扩增产物大小为648bp。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应，其PCR反应体系组成为：浓度为10 μmol/L的上、下游靶标DNA特异性引物1.0 μL，1.5 U Taq DNA polymerase 0.5μL，25 mmol/L MgCl2 2μL，10 mmol/L的dNTP 2 μL，10×PCR buffer 2.5 µL，DNA模板2.0μL，补足无菌去离子水25 μL。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应程序，95℃预变性5 min；95℃变性1min，55-60℃退火45 s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10 min。
CN202011049128.9A 2020-09-29 2020-09-29 用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法 Active CN112029884B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011049128.9A CN112029884B (zh) 2020-09-29 2020-09-29 用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011049128.9A CN112029884B (zh) 2020-09-29 2020-09-29 用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112029884A CN112029884A (zh) 2020-12-04
CN112029884B true CN112029884B (zh) 2022-05-10

Family

ID=73572709

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011049128.9A Active CN112029884B (zh) 2020-09-29 2020-09-29 用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112029884B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112662791B (zh) * 2020-12-23 2022-10-11 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 具有降胆固醇功能的乳酸菌及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101407835A (zh) * 2007-10-12 2009-04-15 统一企业(中国)投资有限公司 检测鼠李糖乳杆菌的遗传标记和方法
RU2012103277A (ru) * 2012-02-01 2013-08-20 Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан" Метод видовой и штаммовой индентификации лактобацилл, основанный на использовании проксимального межгенного участка днк оперона f1f0 атф-синтазы
CN104450941A (zh) * 2014-12-24 2015-03-25 光明乳业股份有限公司 一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物对
CN104531695A (zh) * 2014-12-26 2015-04-22 光明乳业股份有限公司 一种干酪乳杆菌的特异性分子标记dna序列及其用途
CN104531873A (zh) * 2014-12-24 2015-04-22 光明乳业股份有限公司 一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物对
CN111286550A (zh) * 2019-07-18 2020-06-16 大连民族大学 一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101407835A (zh) * 2007-10-12 2009-04-15 统一企业(中国)投资有限公司 检测鼠李糖乳杆菌的遗传标记和方法
RU2012103277A (ru) * 2012-02-01 2013-08-20 Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан" Метод видовой и штаммовой индентификации лактобацилл, основанный на использовании проксимального межгенного участка днк оперона f1f0 атф-синтазы
CN104450941A (zh) * 2014-12-24 2015-03-25 光明乳业股份有限公司 一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物对
CN104531873A (zh) * 2014-12-24 2015-04-22 光明乳业股份有限公司 一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物对
CN104531695A (zh) * 2014-12-26 2015-04-22 光明乳业股份有限公司 一种干酪乳杆菌的特异性分子标记dna序列及其用途
CN111286550A (zh) * 2019-07-18 2020-06-16 大连民族大学 一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Novel real-time PCR assay for Lactobacillus casei group species using comparative genomics;Eiseul Kim等;《Food Microbiology》;20200313;第90卷;第1-9页 *
PCR-DGGE结合种特异性PCR技术检测市售酸奶中乳酸菌;王营等;《分析检测》;20140708;第34卷(第8期);第253-258页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112029884A (zh) 2020-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dec et al. 16S-ARDRA and MALDI-TOF mass spectrometry as tools for identification of Lactobacillus bacteria isolated from poultry
Yu et al. Diversity of lactic acid bacteria associated with traditional fermented dairy products in Mongolia
Haghshenas et al. Isolation and characterization of probiotics from dairies
Banwo et al. Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from some Nigerian traditional fermented foods
Ruiz-Moyano et al. Rapid discrimination of Bifidobacterium animalis subspecies by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry
CN111286550A (zh) 一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用
CN113564272B (zh) 一种发酵乳中干酪乳酪杆菌的快速鉴定检测方法
Sandes et al. Lactobacillus species identification by amplified ribosomal 16S-23S rRNA restriction fragment length polymorphism analysis
CN112143820B (zh) 用于鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的分子标记、检测引物和检测方法
Kim et al. Development of rapid and highly specific TaqMan probe-based real-time PCR assay for the identification and enumeration of Lactobacillus kefiri in kefir milk
CN112029884B (zh) 用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法
Nurliana et al. Identification of cellulolytic lactic acid bacteria from the intestines of laying hens given AKBISprob based on 16S ribosomal ribonucleic acid gene analysis
Jamshidi et al. Isolation and identification of Campylobacter spp. and Campylobacter coli from poultry carcasses by conventional culture method and multiplex PCR in Mashhad, Iran
Moumene et al. Complete genome sequence and description of Lactococcus garvieae M14 isolated from Algerian fermented milk
Ren et al. Diversity analysis and quantification of lactic acid bacteria in traditionally fermented yaks’ milk products from Tibet
CN113699261B (zh) 鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法
CN110804665A (zh) 在种水平上鉴定环境样本中乳酸菌的引物及方法
CN112029885B (zh) 用于鉴定瑞士乳杆菌、发酵乳杆菌和嗜酸乳杆菌的分子标记、检测引物和检测方法
Mahajan et al. MALDI-TOF MS SPECTROPHOTOMETRIC AND 16S rRNA GENE SEQUENCING IDENTIFICATION OF PROBIOTIC LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM DAIRY FOOD PRODUCTS.
Obis et al. The safety of lactic acid bacteria for use in foods
Ruiz et al. Characterization of bacterial populations from Murciano-Granadina goat colostrum
CN107699514B (zh) 一株马乳酒样乳杆菌zw3菌株及其分子检测方法
Arezki et al. Identification of indigenous Lactobacillus isolated from artisanal Algerian dairy product by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF Mass Spectrometry.
Jannah et al. Molecular diversity of lactic acid bacteria on ileum and coecum broiler chicken fed by Chrysonilia crassa fermentation
CN104531692B (zh) 一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物对

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant