CN104450941A - 一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物对 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)的方法及其试剂盒和引物对。该引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1所示和如序列表中SEQ ID NO.2所示。所述的方法包括以下步骤：(1)提取待检样品的基因组DNA作为模板，以核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对作为引物，进行PCR扩增；(2)检测步骤(1)PCR扩增产物中是否在461bp位置存在单一扩增产物。所述的检测方法检测时间短；检测成本低；检测结果可靠，可以应用于乳制品中干酪乳杆菌的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物。
背景技术
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)属于乳杆菌属(Lactobacillus)，是革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶；最适生长温度为37℃，G+C含量为45.6％～47.2％；菌体长短不一，两端呈方形，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色，能发酵多种糖。干酪乳杆菌存在于人的口腔、肠道内含物和大便及阴道中，也常常出现在牛奶和干酪、乳制品、饲料、面团和垃圾中。干酪乳杆菌是一种有益于人体健康的益生菌。2001年卫生部公布了可用于保健食品中的益生菌菌种名单，其中包括干酪乳杆菌及干酪乳杆菌干酪亚种(又叫副干酪乳杆菌)。目前我国对干酪乳杆菌的研究甚少。
干酪乳杆菌作为益生菌的一种，能够耐受有机体的防御机制，其中包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小肠的胆汁酸等。所以干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用。同时，干酪乳杆菌具有高效降血压、降胆固醇、促进细胞分裂，产生抗体免疫、增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等功能；还具有缓解乳糖不耐症、过敏等益生保健作用。近年来，由于干酪乳杆菌对其宿主营养、免疫、防病等具有显著的益生功效，越来越成为人们研究、开发、生产的焦点。而高血压人群的增加使得对干酪乳杆菌的研究以及用其开发功能性乳制品的意义显得愈加重要。
干酪乳杆菌作为益生菌之一被用作牛奶、酸乳、豆奶、奶油和干酪等乳制品的发酵剂及辅助发酵剂，尤其在干酪中应用较多，为了适应干酪中的高含量盐及低pH值，需要通过一些重要氨基酸的代谢以增加风味并促进干酪的成熟。近几年来，干酪乳杆菌越来越多地用于乳制品中，但是其是否真正添加以及是否能够存活于乳制品中则需要乳品检测机构进行快速鉴定。传统的检测方法费时费力，通常需要3～5天才能确定。此外，传统的检测方法按照国标GB4789.35-2010的要求，所需的样品量至少为25g或25mL，因此检测的灵敏度通常＞4CFU/g或＞4CFU/mL，由上可知，传统的乳制品中干酪乳杆菌的检测方法其检测效率较低，检测成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有传统技术检测时间长、费时费力、成本高的缺陷，提供一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物。采用所述的方法检测干酪乳杆菌，检测速度快，成本低，灵敏度高，检测结果特异性好，判定简单易行，并且检测食品中的干酪乳杆菌菌株也结果准确可靠。
本发明的目的是通过下列技术方案来实现的。
本发明采用的技术方案之一是：一种特异性扩增干酪乳杆菌的引物对，其核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1所示和如序列表中SEQ ID NO.2所示。
其中，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示的引物称为SEN2-L；核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示的引物称为SEN2-R。所述引物SEN2-L和引物SEN2-R所扩增的序列为干酪乳杆菌组氨酸激酶基因序列中的保守序列。
本发明采用的技术方案之二是：一种用于特异性扩增干酪乳杆菌的试剂盒，其包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示和如序列表中SEQ IDNO.2所示的引物对。
较佳地，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR缓冲液、Mg2+、Taq DNA聚合酶和ddH2O中的一种或多种；更佳地，所述的试剂盒还包括基因组DNA抽提试剂。
本发明采用的技术方案之三是：一种检测干酪乳杆菌菌株的方法，其包括以下步骤：
(1)提取待检样品的基因组DNA作为模板，核苷酸序列分别为如序列表中SEQ ID NO.1所示和如序列表中SEQ ID NO.2所示的引物对作为引物，进行PCR扩增；
(2)检测步骤(1)PCR扩增产物中是否在461bp位置存在单一扩增产物。
步骤(1)为提取待检样品的基因组DNA作为模板，核苷酸序列分别为如序列表中SEQ ID NO.1所示和如序列表中SEQ ID NO.2所示的引物对作为引物，进行PCR扩增。其中，所述基因组DNA的提取方法为本领域常规的提取方法；较佳地为CTAB法；更佳地，所述CTAB法提取基因组DNA包括以下的步骤：在待检样品中加入EDTA(500mM，pH8.0)；4℃下6500g离心30分钟后，-20℃静置10分钟；室温下溶解后再加入去离子水，12000r/min离心5min，弃上清；加入TE缓冲液，37℃水浴1-2h；加入10％SDS，68℃烘干15min；加入5M NaCl，1％CTAB，68℃烘干15min；加入苯酚，氯仿-异戊醇(24:1，v/v)，静置，12000r/min离心10min；取上清加入等体积氯仿-异戊醇(24:1，v/v)，12000r/min离心5min，取上清，加入冰无水乙醇，-20℃放置2h；10000r/min离心2min，弃上清，加入70％乙醇清洗，12000r/min离心2min，弃上清后室温下风干，即可。
所述PCR扩增的反应体系为本领域常规的反应体系；较佳地为1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg2+，0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3μM所述引物，Taq酶0.01-0.1U/μL，所述模板10-100ng/μL；更佳地为1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTP，0.2μM所述引物，Taq酶0.04U/μL，所述模板40ng/μL。所述PCR扩增的反应程序为本领域常规的反应程序，较佳地为92-95℃预变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：92-95℃变性20-40s，58-63℃退火20-40s，68-74℃延伸20-40s，循环共30-35个，循环结束后，70-74℃延伸8-12min，降温至4-15℃，结束；更佳地为4℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环共30个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。
步骤(2)为检测步骤(1)PCR扩增产物中是否在461bp位置存在单一扩增产物。其中，所述的检测为本领域常规的检测，可以观察所述扩增产物即可。较佳地为凝胶电泳检测；更佳地为琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；最佳地为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。较佳地，所述的检测的判断方法如下：如果存在461bp位置的单一扩增产物，则说明待检样品中含有干酪乳杆菌菌株；如果不存在461bp位置的单一扩增产物，则待检样品中不含有干酪乳杆菌菌株。
本发明所述的室温为10～30℃。
本发明所述干酪乳杆菌为Lactobacillus casei，包括干酪乳杆菌和干酪乳杆菌亚种(又称副干酪乳杆菌)。
本发明所述的待检样品为本领域常规的待检样品，较佳地为奶酪或酸奶。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的检测方法检测干酪乳杆菌菌株，检测时间最快仅需24小时，提高了检测效率；简单易行，检测成本低；检测结果可靠，结果判定简单，可以特异性地判断是否为干酪乳杆菌。本发明为乳品检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测干酪乳杆菌细菌的方法，对判别乳品中是否添加有干酪乳杆菌具有较大意义。
附图说明
图1为实施例2中PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳实验结果。泳道1～17依次为：干酪乳杆菌ATCC334，干酪乳杆菌LC2W，干酪乳杆菌BD-II，干酪乳杆菌str-zhang，干酪乳杆菌BD0059，干酪乳杆菌BD0090，干酪乳杆菌BD1649，干酪乳杆菌BD1803，干酪乳杆菌BD3552，干酪乳杆菌BD3553，干酪乳杆菌BD3554，干酪乳杆菌BD3555，干酪乳杆菌BDlb-01，干酪乳杆菌BDlb-02，副干酪乳杆菌BDlb-03，阴性对照(无菌去离子水)，100bp DNAMarker。
图2为实施例2中PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳实验结果。泳道18～21依次为：副干酪乳杆菌BD00095，副干酪乳杆菌BD00116，副干酪乳杆菌BD01950，副干酪乳杆菌BD02004，M为100bp DNA Marker。
图3为实施例2中PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1～17依次为：干酪乳杆菌ATCC334，罗伊氏乳杆菌JCM112，鼠李糖乳杆菌LGG，植物乳杆菌ATCC14917，植物乳杆菌ST-III，嗜热链球菌BDST001，瑞士乳杆菌BDLH001，德氏乳杆菌BDLD6240，嗜酸乳杆菌BDLA6075，植物乳杆菌BDLP6102，保加利亚乳杆菌L99，类芽孢杆菌BD3526，肠系膜明串珠菌BD1710，长双歧杆菌BDBL001，两歧双歧杆菌BDBB001，阴性对照(无菌去离子水)，100bp DNA Marker。
图4为实施例3中PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳验证引物灵敏度实验图谱。泳道1～10依次为：100bp DNA Marker，105.3ng/PCR，10.5ng/PCR，1.05ng/PCR，105pg/PCR，10.5pg/PCR，10.5pg/PCR，105fg/PCR，ddH2O。
图5为实施例4中实际样品经PCR检测后，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1～11依次为：干酪乳杆菌ATCC334，干酪样品1，干酪样品2，酸乳样品1，酸乳样品2，干酪样品3，干酪样品4，干酪样品5.酸乳样品3，酸乳样品4，ddH2O，M为100bp DNA Marker。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
所述的室温指10～30℃。
实施例1检测干酪乳杆菌菌株的引物合成和PCR检测
(一)引物合成
合成能够PCR扩增干酪乳杆菌组氨酸激酶基因序列中的保守序列的引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，引物序列如下：
SEN2-L：5’ATTAAAACCCCGCTGACCGT’3(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示)；
SEN2-R：5’TCAACGAGCTGGTCAGCATT’3(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示)。
(二)PCR检测
采用上述引物，以干酪乳杆菌标准菌株ATCC334的基因组DNA为模板，进行PCR反应体系和反应程序的建立和优化，发现以下反应体系和反应程序能得到单一的461bp左右的扩增产物。
其中，干酪乳杆菌标准菌株ATCC334的基因组DNA的获得包括手机菌体和CTAB法提取基因组DNA的步骤，具体包括如下的步骤：
1)、收集菌体：将干酪乳杆菌标准菌株ATCC334接种至5mL的MRS液体培养基中，37℃增菌2h后，取1mL菌液，放入1.5mL离心管中；然后3000r/min离心10min，取上清液，再12000r/min离心5min，收集菌体。用无菌双蒸水悬浮菌体，离心洗涤后加入400μL TE，得菌体悬浮液；
2)、利用CTAB法提取基因组DNA：
(1)取25mL步骤1)所得的菌体悬浮液中加入5mL EDTA(500mM，pH8.0)；
(2)4℃下6500g离心30分钟后，-20℃静置10分钟；
(3)室温下溶解后再用无菌去离子水重悬清洗菌体，12000r/min离心5min，弃上清；
(4)加入456μL TE缓冲液和24μL溶菌酶，37℃水浴1-2h；加入53μL10％SDS，68℃烘干15min；加入87μL 5M NaCl，69μL 1％CTAB，68℃烘干15min；
(5)加入苯酚250μL，氯仿-异戊醇(24:1，v/v)250μL，静置，12,000r/min离心10min；
(6)取上清400μL，加入等体积(400μL)氯仿-异戊醇(24:1，v/v)，12,000r/min离心5min，取上清300μL，加入600μL冰无水乙醇，-20℃放置2h；
(7)10000r/min离心2min，弃上清，加入70％乙醇清洗，12000r/min离心2min，弃上清后室温下风干。加入50～100μL无菌去离子水或TE溶解DNA，-20℃保存待用，可以作为后续PCR反应体系的模板。
PCR反应体系为：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg2+，0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3μM引物SEN2-L，0.1-0.3μM引物SEN2-R，Taq酶0.01-0.1U/μL，DNA模板10-100ng/μL。
PCR扩增程序为：92-95℃预变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：92-95℃变性20-40s，58-63℃退火20-40s，68-74℃延伸20-40s；共30-35个循环；循环结束后，70-74℃延伸8-12min，降温至4-15℃，结束。
发明人经实验还发现，461bp左右的扩增产物的产量最高，电泳条带最明显清晰时的PCR反应体系为：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTP，0.2μM引物SEN2-L，0.2μM引物SEN2-R，Taq酶0.04U/μL，DNA模板40ng/μL。
461bp左右的扩增产物的产量最高，电泳条带最明显清晰时的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环共30个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。
实施例2检测干酪乳杆菌菌株的特异性评价
1)、菌株基因组DNA模板的获取
取干酪乳杆菌标准菌株1株(ATCC334)、干酪乳杆菌分离菌株18株和其他品种的菌株14株(如表1所示)，按照如实施例1所述的步骤分别收集菌体并按CTAB法提取基因组DNA，作为检测干酪乳杆菌的PCR反应模板。
2)、PCR检测是否为干酪乳杆菌菌株
取2μL步骤1)所得的每株菌株的DNA溶液(DNA浓度30ng/μL)作为PCR反应模板添加到PCR反应体系中进行扩增反应。
PCR反应体系为：16.1μL无菌水，依次加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L Mg2+2.0μL，2.5mmol/L dNTP 1.0μL，5μM引物SEN2-L 1.0μL，5μM引物SEN2-R 1.0μL，2.5U/μL Taq酶0.4μL，最后加模板溶液2μL，并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。
PCR反应程序为：4℃预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，退火温度60℃，退火时间为30s，72℃延伸30s，共35个循环，循环结束后72℃延伸10min，降温至12℃，结束。
采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，判断在461bp位置是否存在单一扩增条带，若在461bp位置存在单一扩增的条带，则标记为“+”，即判断为所述干酪乳杆菌；否则标记为“-”。结果见表1，电泳结果见图1～3。
表1.特异性评价所用菌株及试验结果
| 菌株 | 编号 | 菌数 | 结果 |
| 干酪乳杆菌 | ATCC334 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | LC2W | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BD-II | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | str-zhang | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BD0059 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BD0090 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BD1649 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BD1803 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BD3552 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BD3553 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BD3554 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BD3555 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BDlb-01 | 1 | + |
| 干酪乳杆菌 | BDlb-02 | 1 | + |
| 副干酪乳杆菌 | BDlb-03 | 1 | + |
| 副干酪乳杆菌 | BD00095 | 1 | + |
| 副干酪乳杆菌 | BD00116 | 1 | + |
| 副干酪乳杆菌 | BD01950 | 1 | + |
| 副干酪乳杆菌 | BD02004 | 1 | + |
| 罗伊氏乳杆菌 | JCM112 | 1 | - |
| 鼠李糖乳杆菌 | LGG | 1 | - |
| 植物乳杆菌 | ATCC14917 | 1 | - |
| 植物乳杆菌 | ST-III | 1 | - |
| 嗜热链球菌 | BDST001 | 1 | - |
| 瑞士乳杆菌 | BDLH001 | 1 | - |
| 德氏乳杆菌 | BDLD6240 | 1 | - |
| 嗜酸乳杆菌 | BDLA6075 | 1 | - |
| 植物乳杆菌 | BDLP6102 | 1 | - |
| 保加利亚乳杆菌 | L99 | 1 | - |
| 类芽孢杆菌 | BD3526 | 1 | - |
| 肠系膜明串珠菌, | BD1710 | 1 | - |
| 长双歧杆菌 | BDBL001 | 1 | - |
| 两歧双歧杆菌 | BDBB001 | 1 | - |
从表1的结果可知，除了干酪乳杆菌菌株的标准菌株和分离株外，其余阴性对照菌株均没有特异扩增条带(461bp)。表1中干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)使用了1株标准菌株(ATCC334)，代表了该属内所有种的典型标准菌株。干酪乳杆菌和乳杆菌属内其它菌株的亲缘关系最近，本次试验的阴性对照共使用了乳杆菌属标准菌株3株(罗伊氏乳杆菌JCM112，鼠李糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌ATCC14917)，乳杆菌属分离菌株为11株。所使用的这些菌株和干酪乳杆菌菌株具有较近的亲缘关系。而这些菌株经本发明的引物SEN2-L和引物SEN2-R通过PCR实验后扩增不到特异的片段(461bp)，那么其它的和干酪乳杆菌菌株亲缘关系较远的菌株就更加难以扩增到该片段，因此经过这些亲缘关系较近的菌株的验证，保证了实施例1所述引物SEN2-L和引物SEN2-R的特异性，也充分证明该方法能扩增干酪乳杆菌种内的任何菌株，而不会扩增其它的任何菌株。
此外，表1中13株干酪乳杆菌分离菌株和5株副干酪乳杆菌分离菌株均为从食品中分离鉴定的分离菌株，其均根据国标GB 4789.35—2010进行分离鉴定，并将分离获得的可疑菌株首先进行镜检，然后进行如下的生理生化实验进行鉴定，所有分离菌株的生理生化实验与干酪乳杆菌菌株的标准菌株的结果一致(表2)，说明13株干酪乳杆菌分离菌株和5株副干酪乳杆菌分离菌株确实为干酪乳杆菌。表2中，干酪乳杆菌可以在该特定碳源的条件下正常生长则标记为“+”；否则标记为“-”。
表2鉴定干酪乳杆菌分离菌株的碳源反应结果
| 菌种 | 七叶苷 | 纤维二糖 | 麦芽糖 | 甘露醇 | 水杨苷 | 山梨醇 | 蔗糖 | 棉籽糖 |
| 干酪乳杆菌 | + | + | + | + | + | + | + | ‐ |
并且，这13株干酪乳杆菌分离菌株和5株副干酪乳杆菌分离菌株是个不相同的：根据这些分离菌株的不同的16S rRNA序列和dnaK基因序列(参考文献：Huang Chien-Hsun,Lee Fwu-ling,The dnaK gene as a molecularmarker for the classification and discrimination of the Lactobacillus casei group,Antonie van Leeuwenhoek,2011,99:319-327)，就能够将这些分离菌株一一区别开来。
在实施例1中，在MRS培养基中增菌不超过19小时，按CTAB法提取基因组DNA约3小时，PCR检测是否为干酪乳杆菌菌株约花费2小时，因此所述检测干酪乳杆菌的方法共需要24小时左右。
实施例3检测干酪乳杆菌方法的灵敏度评价
按实施例1所述的CTAB法提取基因组DNA的方法提取干酪乳杆菌标准菌株ATCC334基因组总DNA。将所得的DNA溶解于无菌水中，浓度为1053ng/uL，再用无菌水作10倍梯度稀释，共稀释8个梯度：105.3ng/PCR，10.5ng/PCR，1.05ng/PCR，105pg/PCR，10.5pg/PCR，10.5pg/PCR，105fg/PCR，每个梯度分别取5μL作为模板加入PCR反应体系。用如实施例1所述的SEN2-L和引物SEN2-R按照如实施例2所述的PCR反应体系和PCR反应程序进行扩增，凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像仪中观察凝胶电泳结果，如图4所示。由图4可知，在第6条泳道可以看到清晰的条带(461bp)，所对应DNA浓度为10.5pg/PCR pg/PCR，而第7条泳道之后看不到扩增条带。因此，判定PCR检测灵敏度为10.5pg/PCR，具有较高的灵敏度。
实施例4检测食品样品中是否含有干酪乳杆菌
10份食品样品(包括奶酪和发酵乳)均为自制。分别将25g样品添加到225mL无菌生理盐水进行稀释，按国标法GB4789.35-2010进行分离鉴定干酪乳杆菌，并将最后鉴定结果与PCR方法进行对照。同时，取1mL样品用如实施例1所述的CTAB法提取基因组DNA，并将总基因组DNA稀释到50ng/uL作为PCR模板，以无菌水作阴性对照，如实施例2所述的PCR反应体系和PCR反应程序进行扩增，每个实验重复3次，结果见表3、图5所示。表3中，采用琼脂糖凝胶电泳检测食品样品的PCR扩增产物，判断在461bp位置是否存在单一扩增条带，若在461bp位置存在单一扩增的条带，则标记为“+”，即判断食品样品中含有干酪乳杆菌；否则标记为“-”。如图5所示，有5份样品检测到特异的片段(461bp)，而该5份样品经国标所述的方法也分离到干酪乳杆菌，由此可见本实验建立的方法具有非常高的可靠性。
表3.食品样品中干酪乳杆菌的检测结果
| 样品名称 | 编号 | 菌数 | 结果 |
| 奶酪 | 1 | 1 | + |
| 奶酪 | 2 | 1 | + |
| 奶酪 | 3 | 1 | + |
| 奶酪 | 4 | 1 | + |
| 发酵乳 | 5 | 1 | + |
| 奶酪 | 6 | 1 | - |
| 发酵乳 | 7 | 1 | - |
| 发酵乳 | 8 | 1 | - |
| 发酵乳 | 9 | 1 | - |
| 发酵乳 | 10 | 1 | - |
对比实施例1
PCR反应程序为：4℃预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，退火温度50℃，退火时间为30s，72℃延伸30s，共35个循环，循环结束后72℃延伸10min，降温至12℃，结束。
其余步骤和条件参数均同实施例2，凝胶电泳检测扩增产物，结果发现在461bp位置难以获得任何清晰的、单一扩增的条带，说明该PCR反应程序不适于检测干酪乳杆菌菌株。
对比实施例2
PCR反应程序为：4℃预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，退火温度68℃，退火时间为30s，72℃延伸30s，共35个循环，循环结束后72℃延伸10min，降温至12℃，结束。
其余步骤和条件参数均同实施例2，凝胶电泳检测扩增产物，结果发现在461bp位置难以获得任何清晰的、单一扩增的条带，说明该PCR反应程序不适于检测干酪乳杆菌菌株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。
Claims (10)
1.一种特异性扩增干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的引物对，其特征在于，其核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1所示和如序列表中SEQ IDNO.2所示。
2.一种用于特异性扩增干酪乳杆菌的试剂盒，其特征在于，其包括核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1所示和如序列表中SEQ ID NO.2所示的引物对。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR缓冲液、Mg2+、Taq DNA聚合酶和ddH2O中的一种或多种；较佳地，还包括基因组DNA抽提试剂。
4.一种检测干酪乳杆菌菌株的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)提取待检样品的基因组DNA作为模板，核苷酸序列分别为如序列表中SEQ ID NO.1所示和如序列表中SEQ ID NO.2所示的引物对作为引物，进行PCR扩增；
(2)检测步骤(1)PCR扩增产物中是否在461bp位置存在单一扩增产物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基因组DNA的提取方法为CTAB法。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增的反应体系为1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg2+，0.2-0.3mmol/LdNTP，0.1-0.3μM所述引物，Taq酶0.01-0.1U/μL，所述模板10-100ng/μL；和/或，所述PCR扩增的反应程序为92-95℃预变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：92-95℃变性20-40s，58-63℃退火20-40s，68-74℃延伸20-40s，循环共30-35个，循环结束后，70-74℃延伸8-12min，降温至4-15℃，结束。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增的反应体系为1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTP，0.2μM所述引物，Taq酶0.04U/μL，所述模板40ng/μL；和/或，所述PCR扩增的反应程序为4℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环共30个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的检测为凝胶电泳检测；较佳地为琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；更佳地为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的检测的判断方法如下：如果存在461bp位置的单一扩增产物，则说明待检样品中含有干酪乳杆菌菌株；如果不存在461bp位置的单一扩增产物，则待检样品中不含有干酪乳杆菌菌株。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待检样品为奶酪或酸奶。
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2014
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