CN107699514B - 一株马乳酒样乳杆菌zw3菌株及其分子检测方法 - Google Patents

Abstract

一株马乳酒样乳杆菌ZW3菌株及其分子检测方法。本方法在结合镜检观察形态学特征和16SrDNA鉴定的基础上，运用多位点序列分型(MLST)方法，将马乳酒样乳杆菌ZW3的全基因组序列作为参考基因组，以7个管家基因为目标基因，设计特异性引物，用于确定ZW3的生物遗传信息标签，进行马乳酒样乳杆菌不同菌株的识别。通过实验证明，基于这7个管家基因的标签可以从其他乳杆菌菌株中快速准确的鉴定出马乳酒样乳杆菌ZW3菌株。因此，所述的分子检测方法以及提供的特异性引物序列，可以用于马乳酒样乳杆菌在发酵乳、发酵果蔬、发酵植物蛋白、发酵肉制品、菌粉等发酵食品和药品方面的检测。

Description

一株马乳酒样乳杆菌ZW3菌株及其分子检测方法

所属技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及乳酸菌的多位点序列分型基因以及利用该序列鉴定其品种的方法。

背景技术

乳酸菌是维持肠道菌群平衡的有益菌群之一，其益生作用与其代谢产物密切相关。马乳酒样乳杆菌作为一种乳酸菌，具有广泛的应用价值。但是，由于乳酸菌的功能具有菌株特异性，精确的菌株识别是益生菌使用的必要前提。传统的生理生化实验耗时长、花费高、准确率低，重要的是不能精确鉴定到菌株的水平。

发明内容

为了快速准确地从复杂的含有乳酸菌的产品中鉴别出ZW3菌株，本发明提供了一种新的马乳酒样乳杆菌ZW3的分子检测方法及特异性引物序列。

本发明所述产胞外多糖及调节肠道菌群平衡的菌株ZW3为已经过全基因组测序确定为乳杆菌属中的一种：即马乳酒样乳杆菌，GenBank序列号为CP002764。该菌株已于2008年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号CGMCC 2809，建议分类命名为马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciens。

相比传统生理生化鉴定和16SrDNA鉴定方法，多位点序列分型(MLST)简单便捷、准确性好、特异性高，可作为菌株的生物标签。所以利用MLST方法快速准确的鉴定乳酸菌十分必要。管家基因通常主要编码代谢功能相关蛋白，普遍存在于每种微生物中。有研究已知，不同种属的菌株在管家基因的遗传方面有着不同程度的差异。通过分析已报道的乳酸菌多位点序列分型常用基因，将马乳酒样乳杆菌ZW3的全基因组序列作为参考基因组，筛选出在乳杆菌中具有较好保守性、在不同种间又具有差异性的7个管家基因为目标基因，比对序列后找出序列两端相对保守的区域设计特异性引物，确定了ZW3的生物遗传信息标签。扩增长度在374-675bp之间，符合多位点序列分型实验设计要求且选取的7个管家基因组合可以保证绝大多数被鉴定菌株的准确性。所选取的七个管家基因基因序列为：rpoA、Hsp60、LeuS、rpsB、glyK、pyrG和fusA。通过实验证明，该标签可以从其他乳酸菌菌株之中，快速准确的鉴定出马乳酒样乳杆菌ZW3菌株。

本发明提供的快速鉴定马乳酒样乳杆菌ZW3的分子检测方法，在结合镜检观察形态学特征和16SrDNA鉴定的基础上主要运用MLST方法，设计特异性引物序列进行PCR，用于识别马乳酒样乳杆菌ZW3；具体包括如下步骤：

(1)形态学观察待测菌株。

(2)提取待测菌株的基因组DNA。

(3)以步骤(2)中提取得到的基因组DNA为模版，利用通用引物扩增待测菌株的16SrDNA基因，并进行序列比对。

16SrDNA序列扩增50.0μL反应体系为：1.0μLDNA模板，25.0μL 2×Taq PCRMix，1.0μLForwardprimer(10μΜ)，1.0μL Reverse primer(10μΜ)，22.0μL ddH₂O；。反应程序是：95℃预变性8min；95℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。

(4)选取管家基因rpoA、Hsp60、LeuS、rpsB、glyK、pyrG和fusA作为目的基因，设计并合成7组特异性引物。

(5)以步骤(2)中提取得到的基因组DNA为模版，用步骤(4)中设计好的7组特异性引物分别进行PCR扩增得到片段产物。

PCR的反应体系为50μL：1.0μLDNA模板，25.0μL 2×Taq PCR Mix，1.0μL上游引物(10μΜ)，1.0μL下游引物(10μΜ)，22.0μLddH₂O。每次只用一组引物进行PCR。以双蒸水代替模板作空白对照。扩增程序为：95℃预变性8min；95℃变性45s，50-55℃中选取合适温度退火30s，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。

(6)将扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。

(7)将扩增成功的PCR产物进行2次平行实验，并送出测序，测序引物与PCR引物相同。

(8)结合镜检和16SrDNA比对结果的基础，将所获得的测序结果与马乳酒样乳杆菌ZW3菌株各基因的标准序列进行比对。通过比对结果对单个基因的SNP位点进行统计，根据SNP位点确定该菌株的序列型(ST型)。由ST型判断所测菌株是否为马乳酒样乳杆菌ZW3菌株。

步骤(2)中选取已完成全基因组测序的一株马乳酒样乳杆菌ZW3与另外5株马乳酒样乳杆菌和2株开菲尔乳杆菌一同进行总基因组提取，以成功提取的8株细菌的基因组为模板。

步骤(4)中提供的特异性引物一共7组，每组引物均包括正向及反向引物。引物序列如序列表中SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.16所示。

步骤(8)中分析比对结果的具体方法为：将基因扩增产物经过双向测序后，利用Chromas软件检查峰图，切除两端测序不准确部分，对峰图中的每一个SNP位点进行检查和确认，利用DNAMAN6.0进行正向、反向序列拼接，得到准确序列。利用NCBI在线比对工具BLAST，将所获得的测序结果与ZW3菌株各基因的标准序列进行比对，当基因序列比对结果显示相似度全部为100％时，并结合镜检和16SrDNA比对结果的基础上，我们认为该株马乳酒样乳杆菌为ZW3菌株；若序列比对结果显示不一致时，则可判定该菌不是ZW3。通过比对结果对单个基因的SNP位点进行统计，根据SNP位点数目和位置的不同确定对应等位基因的编号，按照各基因在参考基因组上的排列顺序(基因排列顺序为rpoA-Hsp60-LeuS-rpsB-glyK-pyrG-fusA)组合对应该菌株唯一一个序列型(ST型)。

本发明中所用鉴定方法的优点：

1、本发明方法简单快捷，比传统生理生化方法节省时间。

2、本发明的鉴定方法可以直接用于检测菌株的序列差异，以准确区分和鉴定不同菌株。

附图说明

图1是本发明实施例中待测菌株的显微镜形态观察结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，但本发明并不仅限于此实施例。

实施例1

快速鉴定马乳酒样乳杆菌ZW3的分子检测方法，具体包括如下步骤：

2株马乳酒样乳杆菌的分子鉴定方法：

本实施例中所用2株菌株分离自南奥塞梯的开菲尔粒，分菌过程如下：选取开菲尔粒，以袋装鲜奶为原料进行发酵，每48h用干净滤网换奶一次，将菌粒活化至24h凝乳。将菌粒用无菌生理盐水洗去表面发酵乳，研磨成匀浆状，以10^-1梯度稀释，涂布乳清平板(为分离马乳酒样乳杆菌或开菲尔乳杆菌)，在30℃厌氧条件下恒温培养24-72h，用无菌枪头分别挑取外形颜色不同的单菌落逐一在单个乳清平板上划线纯化，挑取单一菌落接种于乳清液体培养基中培养48h，进行革兰氏染色后显微镜观察和接触酶实验，菌株均保藏在乳清液体培养基中。

(1)形态学观察待测菌株，结果见表1及图1中的Lk 1209和Lk 1211。

表1各菌落形态的对比表

(2)提取各菌株的基因组DNA

将已完成全基因组测序的马乳酒样乳杆菌ZW3与(1)中分离出的开菲尔乳杆菌接种于乳清液体培养基中，37℃厌氧培养以进行充分活化。然后按提取菌株基因组DNA试剂盒上说明书的要求进行总基因组提取，将成功提取的细菌基因组做为模板进行后续实验。

(3)对待测菌株进行16SrDNA序列扩增和比对。反应结束后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析。序列测序完成后，利用NCBI数据库进行序列相似性比对。

(4)选取管家基因rpoA、Hsp60、LeuS、rpsB、glyK、pyrG和fusA作为目的基因，7个管家基因的基因信息见表2。同时设计并合成7组特异性引物，7组特异性引物及16SrDNA序列通用引物见表3。

表27个管家基因的基因信息

表37组特异性引物序列的序列表

(5)以提取得到的各菌株基因组DNA为模版，用细菌16SrDNA序列通用引物和设计好的7组特异性引物(参见表3)分别进行PCR扩增得到片段产物。PCR的反应体系为50μL。扩增程序中退火温度为53℃。

(6)将扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。

(7)将扩增成功的PCR产物进行2次平行实验，并进行核酸测序，测序引物与PCR引物相同。

(8)将得到的各测序结果与已知的参考序列在NCBI在线比对工具Blast上进行比对，各菌株16SrDNA序列与ZW3菌株16SrDNA序列比对结果：100％，结合形态学观察，最终判断菌株为2株开菲尔乳杆菌。7个管家基因与ZW3参考基因比对结果见表4。按照基因排列顺序为rpoA-Hsp60-LeuS-rpsB-glyK-pyrG-fusA。对序列中单个基因的SNP位点进行统计，根据SNP位点数目和位置的不同确定对应等位基因的编号。得到不同ST型。ZW3的ST-1序列号编码为SEQ ID NO.17。各ST型及SNP位点在序列中的相对位置如表5所示。

表4各菌株7个管家基因与ZW3参考基因比对结果

表5各菌株SNP位点相对位置

实施例2

快速鉴定马乳酒样乳杆菌ZW3的分子检测方法，大多步骤与实施例1相同，不同之处在于：

4株马乳酒样乳杆菌的分子鉴定方法：

本实施例中所用4株菌株源自西藏雪莲菌粒。

(1)形态学观察待测菌株，结果见表6及图1中的Lk 876、Lk 1197、Lk 1199和Lk1201。

表6各菌落形态的对比表

(2)用设计好的7组特异性引物进行PCR扩增。其中PCR的反应体系为50μL。扩增程序中退火温度为51℃。

(3)对序列中单个基因的SNP位点进行统计，7个管家基因与ZW3参考基因比对结果见表7。各ST型及SNP位点在序列中的相对位置如表8所示。

表7各菌株7个管家基因与ZW3参考基因比对结果

表8各菌株SNP位点相对位置

实施例3

快速鉴定马乳酒样乳杆菌ZW3的分子检测方法，大多步骤与实施例1相同，不同之处在于：

1株马乳酒样乳杆菌的分子鉴定方法：

本实施例中所用菌株分离自俄罗斯开菲尔粒。

(1)形态学观察待测菌株，结果见表9及图1中的Lk 1205。

表9菌落形态的对比表

(2)用设计好的7组特异性引物分别进行PCR扩增，其程序为：95℃预变性8min；95℃变性45s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。

(3)对序列中单个基因的SNP位点进行统计，7个管家基因与ZW3参考基因比对结果见表10。各ST型及SNP位点在序列中的相对位置如表11所示。

表10各菌株7个管家基因与ZW3参考基因比对结果

表11各菌株SNP位点相对位置

Claims (6)

1.一种快速鉴定马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciens)ZW3的分子检测方法，ZW3菌株的保藏编号CGMCC No.2809，保藏日2008年12月18日，其特征是：在结合镜检观察形态学特征和16S rDNA的基础上运用MLST方法，设计特异性引物序列进行PCR，用于识别马乳酒样乳杆菌ZW3；包括以下步骤：

(1)形态学观察待测菌株；

(2)提取待测菌株的基因组DNA；

(3)对待测菌株进行16S rDNA比对；

(4)选取管家基因rpoA、Hsp60、LeuS、rpsB、glyK、pyrG和fusA作为目的基因，设计并合成7组特异性引物；检测方法中用到的管家基因的排列顺序为rpoA-Hsp60-LeuS-rpsB-glyK-pyrG-fusA；

(5)以步骤(2)中提取得到的基因组DNA为模版，用步骤(4)中设计好的特异性引物进行PCR扩增得到片段产物；

(6)将扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行分析；

(7)将扩增成功的PCR产物进行2次平行实验，并进行核酸测序，测序引物与PCR引物相同；

(8)结合镜检和16S rDNA比对结果的基础，将所获得的测序结果与马乳酒样乳杆菌ZW3各基因的标准序列进行比对；通过比对结果对单个基因的SNP位点进行统计，根据SNP位点确定该菌株的序列型即ST型；由ST型判断所测菌株是否为马乳酒样乳杆菌ZW3。

2.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征是：16S rDNA所用引物对如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征是：步骤(4)中设计的7组特异性引物中，每组特异性引物分别包括正向引物和反向引物，引物序列见序列表中SEQ ID NO.3-SEQID NO.16。

4.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征是：马乳酒样乳杆菌ZW3的ST型为ST-1，序列号如SEQ ID NO.17所示。

5.权利要求1所述的快速鉴定马乳酒样乳杆菌ZW3的分子检测方法的应用，其特征是：所述的分子检测方法用于含有马乳酒样乳杆菌ZW3的发酵食品、药物以及保健品中菌株的检测。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是：所述的发酵食品为发酵乳、发酵果蔬、发酵植物蛋白或发酵肉制品。

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