CN106967649A - 一种马乳酒样乳杆菌菌株及其筛选培养基、筛选方法和应用 - Google Patents

一种马乳酒样乳杆菌菌株及其筛选培养基、筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种马乳酒样乳杆菌菌株及其筛选培养基、筛选方法和应用，属于微生物技术领域。一种马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种菌株Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciens，保藏编号CGMCC No.2809。一种所述马乳酒样乳杆菌菌株的筛选培养基，利用所述筛选培养基进行筛选，能够得到马乳酒样乳杆菌，重复性较好，同时缩短了筛选的时间，简化筛选工艺。所述菌株在制备用于预防或治疗便秘和腹泻及提高机体抵抗力的药物中应用时，能有效促进肠道有益菌的生长，抑制有害菌繁殖，同时在改善干酪品质中的应用时能增加马苏里拉干酪干酪的拉伸性能。

Description

一种马乳酒样乳杆菌菌株及其筛选培养基、筛选方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种马乳酒样乳杆菌菌株及其筛选培养基、筛选方法和应用。
背景技术
人体肠道的正常微生物，如双岐杆菌，乳酸杆菌等能合成多种人体生长发育必须的维生素，还能利用蛋白质残渣合成非必需氨基酸，并参与糖类和蛋白质的代谢，同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收。这些营养物质对人类的健康有着重要作用，一旦缺少会引起多种疾病。肠道菌群按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存，在质和量上形成一种生态平衡，一旦机体内外环境发生变化，敏感肠菌被抑制，未被抑制的细菌而乘机繁殖，从而引起菌群失调，其正常生理组合被破坏，而产生病理性组合，引起临床症状就称为肠道菌群失调。
目前，调节肠道菌群的方法有很多，例如，公开号为CN104623478的专利公开了采用中药配伍制成的药物，具体由芡实、白扁豆、山药、益智仁、陈皮和木瓜组成按照一定剂量配比组成，具有较好的调节肠道菌群恢复正常的效果，但是疗效较慢，难以短时间内起效。公开号为CN104546914的专利公开了一种在短时间内起效的药物，主要成分为健康儿童大便和生理盐水配置而成，该药不仅具有恢复肠道正常菌群的功能，而且还能促进消化吸收，还能抑制危害人体健康的致病菌，效果显著，但是该药用户体验不佳，来源有限等原因，严重影响了市场的认可度。
虽然肠道中含有大量益生菌，这些益生菌通过协同作用调节肠道微生态平衡，降低有害菌的增长，增强机体的免疫力，提高机体的健康水平的功能。单一微生物调节肠道菌群的研究也有报道，例如，公开号为CN102994416的专利公开了一株地衣芽孢杆菌中的应用，该菌具有耐酸、耐盐、抑菌效果好降低腹泻率的特点，但是该菌株的应用针对犬类，并未公开对人体有效。另外，肠道中还含有多种致病微生物，如何从众多微生物中筛选得到单一有益菌也是比较重要的研究方向。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种马乳酒样乳杆菌菌株及其应用，使所述菌株具有促进肠道有益菌的生长，抑制有害菌繁殖，从而调节肠道菌群结构，保护肠道健康；同时所述菌株具有增强干酪拉丝效果。
本发明的目的还在于提供一种马乳酒样乳杆菌菌株的筛选用培养基及所述菌株的筛选方法，具有准确筛选的特点同时能显著缩短筛选的周期。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种菌株Lactobacilluskefiranofaciens subsp.kefiranofaciens，保藏编号CGMCC No.2809，菌株编号ZW3。
本发明提供了一种所述马乳酒样乳杆菌菌株的筛选用培养基，每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液包含以下质量的组分，葡萄糖8～15g，乳糖8～14g，吐温-801～7ml，32°～38°白酒8～65ml，酸性指示剂2～10ml，抗霉菌类抗生素1～2ng，琼脂12～22g。
优选的，每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液包含以下质量的组分，葡萄糖10～12g，乳糖10～12g，吐温-802～5ml，32°～38°白酒10～60ml，酸性指示剂4～8ml，抗霉菌类抗生素1.2～1.8ng，琼脂15～20g。
本发明提供了一种分离所述马乳酒样乳杆菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：
1)取西藏开菲尔粒加入富集培养基，厌氧培养，得到富集乳液；
2)将所述步骤1)中得到的富集乳液接种到所述筛选培养基上，厌氧培养，得到菌落；
3)从所述步骤2)中得到的菌落中筛选得到黄色菌落接种至所述筛选培养基中，得到初筛菌；
4)从所述步骤3)中的初筛菌中挑选颜色为黄色或乳白色且质地粘稠的菌落划线接种到复筛培养基中，厌氧培养，重复划线接种培养步骤2～4次，得到纯化马乳酒样乳杆菌菌株。
优选的，所述富集培养基为羊奶粉水溶液或鲜羊奶；所述羊奶粉水溶液的质量浓度为10％～14％。
优选的，复筛培养基包括质量浓度为15～25％的脱脂牛奶粉和质量浓度为2～3.5％的琼脂。
优选的，所述步骤1)或步骤4)中厌氧培养的时间为48～72h；
所述步骤2)中厌氧培养的时间为72～120h。
优选的，所述步骤1)、步骤2)或步骤4)中厌氧培养的温度为30～37℃。
本发明还提供了所述菌株或所述方法筛选得到的菌株在制备功能性食品或预防或治疗便秘和腹泻及提高机体抵抗力的药物中应用。
本发明还提供了所述的菌株或所述方法筛选得到的菌株在在改善干酪品质中的应用。
本发明提供了一种所述马乳酒样乳杆菌菌株的筛选培养基，每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液包含以下质量的组分，葡萄糖8～15g，乳糖8～14g，吐温-801～7ml，32°～38°白酒8～65ml，酸性指示剂2～10ml，抗霉菌类抗生素1～2ng，琼脂12～22g。本发明筛选用培养基中通过脱蛋白羊奶乳清提供菌体生长的氮源，葡萄糖、乳糖提供碳源，吐温-80作为固溶剂，白酒作为有效杀菌剂，酸性指示剂提供颜色指示，抗霉菌类抗生素有效抑制霉菌的生长，省去了蛋白胨，牛肉膏，柠檬酸二铵、硫酸镁等组分，节省了成本，简化了工艺。本发明利用所述筛选培养基使马乳酒样乳杆菌菌株从众多杂菌中筛选出来，所述筛选培养基较常规筛选培养基筛选马乳酒样乳杆菌菌株菌数提高了2～3倍，说明所述筛选培养基的筛选能力较强，并且所述菌株形成的菌落时间较常规筛选培养基缩短了8～10h。
本发明提供了一种分离所述马乳酒样乳杆菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：1)取西藏开菲尔粒加入富集培养基，厌氧培养，得到富集乳液；2)将所述步骤1)中得到的富集乳液接种到所述的筛选培养基上，厌氧培养，得到菌落；3)从所述步骤2)中得到的菌落中筛选得到黄色菌落接种至所述筛选培养基中，得到初筛菌；4)从所述步骤3)中的初筛菌中挑选颜色为黄色或乳白色且质地粘稠的菌落划线接种到富筛培养基中，厌氧培养，重复划线接种培养步骤2～4次，得到纯化马乳酒样乳杆菌菌株。本发明所述筛选方法，利用筛选培养基将马乳酒样乳杆菌菌株从众多杂菌中筛选出来，筛选时间较常规方法缩短了8～10h，同时筛选步骤简便，重复性好，菌体活力强适合后续的发酵生产和药物的制备。
本发明还提供了所述菌株或所述方法筛选得到的菌株在制备功能性食品或预防或治疗便秘和腹泻及提高机体抵抗力的药物中应用。将所述菌株用于便秘或腹泻的小鼠中，经过菌群结构的分析，结果发现灌胃后的小鼠肠道中，产生丁酸的毛螺菌科和乳杆菌科明显增多，而致病性理研菌科和红球菌属明显减少，说明所述菌株可以有效促进肠道有益菌的生长，抑制有害菌繁殖，从而调节肠道菌群结构，保护肠道健康。同时菌株ZW3还能有效的促进巨噬细胞株RAW264.7的增殖，加任何刺激物质的空白组提高20％。
本发明还提供了所述的菌株或所述方法筛选得到的菌株在在改善干酪品质中的应用。本发明利用菌株由于含有大量的开菲尔多糖和保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌共同发酵，使其发酵产物具有较强的弹性和拉丝效果，将所述菌株应用到制备干酪中，与对照组相比，其实验组的马苏里拉干酪(mozzarella)的拉丝效果是原来的1.5倍，大大提高了干酪的弹性和拉丝效果。
附图说明
图1为实施例1中马乳酒样乳杆菌ZW3的个体形态(5000X)图；
图2为实施例1中马乳酒样乳杆菌ZW3的菌落形态；
图3为实施例7中马乳酒样乳杆菌ZW3发酵培养基生长曲线及pH曲线；
图4为实施例7中马乳酒样乳杆菌ZW3在发酵培养基中的产糖曲线；
图5为实施例8中马乳酒样乳杆菌ZW3小鼠灌胃实验设计图；
图6为实施例8中马乳酒样乳杆菌ZW3的肠道菌群变化图；
图7为实施例9中干酪发酵对照组的Mazirilla拉伸效果图；
图8为实施例9中干酪发酵实验组的Mazirilla拉伸效果图。
生物保藏信息
马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种菌株Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心，地址为中国.北京.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏机构简称CGMCC，保藏日期为2008年12月18日，保藏编号CGMCCNo.2809，菌株编号ZW3。
具体实施方式
本发明提供了一种马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种菌株Lactobacilluskefiranofaciens subsp.kefiranofaciens，保藏编号CGMCC No.2809，菌株编号ZW3。
本发明提供了一种所述马乳酒样乳杆菌菌株的筛选培养基，每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液包含以下质量的组分，葡萄糖8～15g，乳糖8～14g，吐温-801～7ml，32°～38°白酒8～65ml，酸性指示剂2～10ml，抗霉菌类抗生素1～2ng，琼脂12～22g。
本发明提供的筛选培养基包括脱蛋白羊奶乳清溶液。所述脱蛋白羊奶乳清溶液的质量浓度优选为10～14％，更优选为12％。所述脱蛋白羊奶乳清溶液作为溶剂。所述脱蛋白羊奶乳清溶液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的脱蛋白羊奶乳清溶液即可。本发明中，所述脱蛋白羊奶乳清溶液为提供菌体生长的氮源。
本发明提供的筛选培养基包括葡萄糖。按照每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液计，所述葡萄糖的质量为8～15g，更优选为10～12g，最优选为11g。所述葡萄糖的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的葡萄糖即可。本发明中，所述葡萄糖为提供菌体生长的碳源。
本发明提供的筛选培养基包括乳糖。按照每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液计，所述乳糖的质量为8～14g，更优选为10～12g，最优选为11g。所述乳糖的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的乳糖即可。本发明中，所述乳糖为提供菌体生长的碳源。
本发明提供的筛选培养基包括吐温-80。按照每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液计，所述吐温-80的体积为1～7m，更优选为2～5ml，最优选为3ml。所述吐温-80的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的吐温-80即可。本发明中，所述吐温-80为提供原料组分的固溶剂。
本发明提供的筛选培养基包括32°～38°白酒。按照每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液计，所述白酒的体积为8～65ml，更优选为10～60ml，最优选为3g。所述白酒的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的白酒即可。本发明中，所述白酒作为抑菌剂使用。
本发明提供的筛选培养基包括酸性指示剂。按照每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液计，所述酸性指示剂的体积为2～10ml，更优选为4～8ml，最优选为5ml。所述酸性指示剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酸性指示剂即可。本发明中，所述酸性指示剂为产酸指示剂的作用。本发明中，所述酸性指示剂优选为溴甲酚紫溶液或石蕊溶液。所述溴甲酚紫溶液的质量浓度优选为1.5～2.0％，最优选为1.6％。所述溴甲酚紫溶液的体积优选为2～4ml，更优选为3ml。所述石蕊溶液的质量浓度优选为1.8～2.2％，更优选为2％。所述石蕊溶液的体积优选为7～12ml，更优选为8～10ml，最优选为9ml。
本发明提供的筛选培养基包括抗霉菌类抗生素。按照每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液计，所述抗霉菌类抗生素的质量浓度为1～2ng，更优选为1.2～1.8ng，最优选为1.5ng。所述抗霉菌类抗生素的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的抗霉菌类抗生素即可。本发明中，所述抗霉菌类抗生素为抗霉菌的作用。所述抗霉菌类抗生素优选为制霉菌素。
本发明提供的筛选培养基包括琼脂。按照每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液计，所述琼脂的质量为12～22g，更优选15～20g，最优选为18g。所述琼脂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的琼脂即可。本发明中，所述琼脂为凝固剂。
本发明中，筛选培养基的pH值优选为5.0～6.0，更优选为5.5。
本发明中，所述筛选培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基的配制方法即可。
本发明提供了一种分离所述马乳酒样乳杆菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：
1)取西藏开菲尔粒加入富集培养基，厌氧培养，得到富集乳液；
2)将所述步骤1)中得到的富集乳液接种到所述筛选培养基上，厌氧培养，得到菌落；
3)从所述步骤2)中得到的菌落中筛选得到黄色菌落接种至所述筛选培养基中，得到初筛菌；
4)从所述步骤3)中的初筛菌中挑选颜色为黄色或乳白色且质地粘稠的菌落划线接种到复筛培养基中，厌氧培养，重复划线接种培养步骤2～4次，得到纯化马乳酒样乳杆菌菌株。
本发明取西藏开菲尔粒加入富集培养基，厌氧培养，得到富集乳液。
本发明中，所述西藏开菲尔粒的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的西藏开菲尔粒即可。本发明实施例中，西藏开菲尔粒的来源为西藏传统民间发酵乳。本发明中，所述西藏开菲尔粒的接种量优选为1％～10％，更优选为5％。
本发明中，所述富集培养基优选为羊奶粉水溶液或鲜羊奶，更优选为鲜羊奶。所述羊奶粉水溶液的质量浓度优选为10％～14％，更优选为13％。所述鲜羊奶优选采集1～5h的鲜羊奶。
本发明中，所述厌氧培养的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的厌氧培养的方法即可。所述厌氧培养的时间优选为48～72h，更优选为54～65h，最优选为60h。所述厌氧培养的温度优选为30～37℃，更优选为35℃。
本发明中，所述富集乳液的制备优选反复传代2～3次。
得到富集乳液后，本发明将所述富集乳液接种到上述技术方案的筛选培养基上，厌氧培养，得到菌落。
本发明中，所述厌氧培养的时间优选为72～120h，更优选为80～110h，更优选为100h。
本发明中，所述厌氧培养的温度优选为30～37℃，更优选为35℃。
本发明中，所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的接种方案即可。所述接种的接种量优选为2～6％，更优选为5％。
得到菌落后，本发明从所述菌落中筛选得到黄色菌落接种至所述筛选培养基中，得到初筛菌。
本发明中，所述筛选的方法优选为挑取目的菌落接种至筛选培养基中。
得到初筛菌后，本发明从所述初筛菌中挑选颜色为黄色或乳白色且质地粘稠的菌落划线接种到复筛培养基中，厌氧培养，重复划线接种培养步骤2～4次，得到纯化马乳酒样乳杆菌菌株。
本发明中，复筛培养基优选包括质量浓度为15～25％的脱脂牛奶粉和质量浓度为2～3.5％的琼脂。所述复筛培养基的pH值优选为6.0～7.0，更优选为6.5。
本发明中，所述划线接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的划线接种方法即可。
本发明中，所述厌氧培养的时间优选为48～72h，更优选为54～65h，最优选为60h。
本发明中，所述厌氧培养的温度优选为30～37℃，更优选为35℃。
本发明中，所述质地粘稠的菌落表明菌体产多糖较高，视为候选菌落。
本发明中，所述马乳酒样乳杆菌菌株优选进行验证。所述验证方法包括16S rDNA分子鉴定法、生化试验和多糖含量测定法进行。所述16S rDNA分子鉴定法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的16S rDNA分子鉴定法即可。所述多糖含量测定法优选采用苯酚-硫酸法测定。所述生化试验为革兰氏染色法、触酶试验、形态学观察和菌落质地观察等。所述形态学观察是在显微镜下观察单个菌为长杆状。触酶试验为阴性。革兰氏染色法为阳性。菌落质地为粘稠状态。
本发明还提供了所述菌株或所述方法筛选得到的菌株在制备功能性食品或预防或治疗便秘和腹泻及提高机体抵抗力的药物中应用。
本发明还提供了所述的菌株或所述方法筛选得到的菌株在改善干酪品质中的应用。
所述应用优选所述的菌株和保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌共同发酵。
下面结合实施例对本发明提供的一种马乳酒样乳杆菌菌株及其筛选用培养基、筛选方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)富集培养：取数粒西藏开菲尔粒按照接种量为10％的量加入富集培养基(E)中，35℃厌氧培养60小时，反复传代3次；富集培养基为14％的羊奶粉水溶液或鲜羊奶，115℃灭菌20min制备得到。
(2)初筛与纯化：取上述含有开菲尔粒的开菲尔乳液在无菌研钵中研碎均匀，将富集液体按照接种量为2％的量接种在筛选培养基(S1)的平板上梯度稀释，在37℃厌氧箱中培养72小时，挑取典型黄色菌落至另一个初筛培养基(S1)的平板上，进一步挑取黄色或乳白色及粘稠菌落的菌株划线纯化，反复至单一菌落。初筛培养基(S1)为：脱蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖10g，半乳糖12g，吐温-801ml，32-38度白酒60ml(或0.5-1％95的酒精)，2ml 1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液10ml，制霉菌素1ng，琼脂20g。具体制备方法：将羊奶用乳酸将其pH调节到5.5，100℃加热30mim，8000rpm离心20min，弃沉淀后上清液备用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分钟灭菌，琼脂采用121℃灭菌30min。其中脱蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐温-80ml采用115℃灭菌20min；白酒、制霉菌素分别用用0.25um的微滤膜过滤除菌，按比例将上述备用成分在60-70℃条件下无菌混匀，倒平板。
(3)菌株纯化：将初筛出来的菌株于复筛培养基S2平板上划线，置于30～37℃厌氧箱中继续培养48～72小时，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察形态单一的长杆状菌体，则认为已纯化。复筛培养基为：20％的脱脂牛奶粉，与等体积的3％的琼脂混合，115℃灭菌20min，混合均匀，倒平板。
(4)将纯化后的单菌落，如果革兰氏染色法为阳性，触酶试验为阴性，显微镜下观察为长杆状(见图1)，菌落粘稠(图2)，为疑似马乳酒样乳杆菌，编号为ZW3。
实施例2
(1)富集培养：取数粒西藏开菲尔粒按照接种量为8％的量加入富集培养基(E)中，30℃厌氧培养48小时，反复传代2次；富集培养基为12％的羊奶粉水溶液或鲜羊奶，115℃灭菌20min制备得到。
(2)初筛与纯化：取上述含有开菲尔粒的开菲尔乳液10～50g，无菌研钵中研碎均匀，将富集液体按照接种量为2％的量接种在筛选培养基(S1)的平板上梯度稀释，在30℃厌氧箱中培养120小时，挑取典型黄色菌落至另一个初筛培养基(S1)的平板上，进一步挑取黄色或乳白色及粘稠菌落的菌株划线纯化，反复至单一菌落。初筛培养基(S1)为：脱蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖12g，半乳糖10g，吐温-805ml，32度白酒10ml(或0.5-1％95的酒精)，2ml 1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液10ml，制霉菌素2ng，琼脂15g。具体制备方法：将羊奶用乳酸将其pH调节到5.5，100℃加热30mim，8000rpm离心20min，弃沉淀后上清液备用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分钟灭菌，琼脂采用121℃灭菌30min。其中脱蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐温-80ml采用115℃灭菌20min；白酒、制霉菌素分别用用0.25um的微滤膜过滤除菌，按比例将上述备用成分在60-70℃条件下无菌混匀，倒平板。
(3)菌株纯化：将初筛出来的菌株于复筛培养基S2平板上划线，置于30～37℃厌氧箱中继续培养48～72小时，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察形态单一的长杆状菌体，则认为已纯化。复筛培养基为：20％的脱脂牛奶粉，与等体积的3％的琼脂混合，115℃灭菌20min，混合均匀，倒平板。
(4)将纯化后的单菌落，如果革兰氏染色法为阳性，触酶试验为阴性，显微镜下观察为长杆状，菌落粘稠，为疑似马乳酒样乳杆菌。
实施例3
(1)富集培养：取数粒西藏开菲尔粒按照接种量为5％的量加入富集培养基(E)中，30℃厌氧培养72小时，反复传代2次；富集培养基为10％的羊奶粉水溶液或鲜羊奶，115℃灭菌20min制备得到。
(2)初筛与纯化：取上述含有开菲尔粒的开菲尔乳液10～50g，无菌研钵中研碎均匀，将富集液体按照接种量为3％的量接种在筛选培养基(S1)的平板上梯度稀释，在35℃厌氧箱中培养90小时，挑取典型黄色菌落至另一个初筛培养基(S1)的平板上，进一步挑取黄色或乳白色及粘稠菌落的菌株划线纯化，反复至单一菌落。初筛培养基(S1)为：脱蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖11g，乳糖11g，吐温-803ml，38度白酒40ml(或0.5-1％95的酒精)，3ml 1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液9ml，制霉菌素1.5ng，琼脂18g。具体制备方法：将羊奶用乳酸将其pH调节到5.5，100℃加热30mim，8000rpm离心20min，弃沉淀后上清液备用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分钟灭菌，琼脂采用121℃灭菌30min。其中脱蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐温-80ml采用115℃灭菌20min；白酒、制霉菌素分别用用0.25um的微滤膜过滤除菌，按比例将上述备用成分在60-70℃条件下无菌混匀，倒平板。
(3)菌株纯化：将初筛出来的菌株于复筛培养基S2平板上划线，置于30～37℃厌氧箱中继续培养48～72小时，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察形态单一的长杆状菌体，则认为已纯化。复筛培养基为：20％的脱脂牛奶粉，与等体积的3％的琼脂混合，115℃灭菌20min，混合均匀，倒平板。
(4)将纯化后的单菌落，如果革兰氏染色法为阳性，触酶试验为阴性，显微镜下观察为长杆状，菌落粘稠，为疑似马乳酒样乳杆菌。
实施例4
(1)富集培养：取数粒西藏开菲尔粒按照接种量为5％的量加入富集培养基(E)中，36℃厌氧培养54小时，反复传代2～3次；富集培养基为12％的羊奶粉水溶液或鲜羊奶，115℃灭菌20min制备得到。
(2)初筛与纯化：取上述含有开菲尔粒的开菲尔乳液10～50g，无菌研钵中研碎均匀，将富集液体按照接种量为4％的量接种在筛选培养基(S1)的平板上梯度稀释，在32℃厌氧箱中培养100小时，挑取典型黄色菌落至另一个初筛培养基(S1)的平板上，进一步挑取黄色或乳白色及粘稠菌落的菌株划线纯化，反复至单一菌落。初筛培养基(S1)为：脱蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖8g，乳糖14g，吐温-801ml，38度白酒65ml(或0.5-1％95的酒精)，4ml 1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液10ml，制霉菌素1.8ng，琼脂12g。具体制备方法：将羊奶用乳酸将其pH调节到5.5，100℃加热30mim，8000rpm离心20min，弃沉淀后上清液备用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分钟灭菌，琼脂采用121℃灭菌30min。其中脱蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐温-80ml采用115℃灭菌20min；白酒、制霉菌素分别用用0.25um的微滤膜过滤除菌，按比例将上述备用成分在60-70℃条件下无菌混匀，倒平板。
(3)菌株纯化：将初筛出来的菌株于复筛培养基S2平板上划线，置于30～37℃厌氧箱中继续培养48～72小时，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察形态单一的长杆状菌体，则认为已纯化。复筛培养基为：20％的脱脂牛奶粉，与等体积的3％的琼脂混合，115℃灭菌20min，混合均匀，倒平板。
(4)将纯化后的单菌落，如果革兰氏染色法为阳性，触酶试验为阴性，显微镜下观察为长杆状，菌落粘稠，为疑似马乳酒样乳杆菌。
实施例5
(1)富集培养：取数粒西藏开菲尔粒按照接种量为2％的量加入富集培养基(E)中，32℃厌氧培养65小时，反复传代2次；富集培养基为13％的羊奶粉水溶液或鲜羊奶，115℃灭菌20min制备得到。
(2)初筛与纯化：取上述含有开菲尔粒的开菲尔乳液10～50g，无菌研钵中研碎均匀，将富集液体按照接种量为5％的量接种在筛选培养基(S1)的平板上梯度稀释，在36℃厌氧箱中培养80小时，挑取典型黄色菌落至另一个初筛培养基(S1)的平板上，进一步挑取黄色或乳白色及粘稠菌落的菌株划线纯化，反复至单一菌落。初筛培养基(S1)为：脱蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖15g，乳糖8g，吐温-807ml，32-38度白酒8ml(或0.5-1％95的酒精)，2ml 1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液10ml，制霉菌素1.2ng，琼脂22g。具体制备方法：将羊奶用乳酸将其pH调节到5.5，100℃加热30mim，8000rpm离心20min，弃沉淀后上清液备用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分钟灭菌，琼脂采用121℃灭菌30min。其中脱蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐温-80ml采用115℃灭菌20min；白酒、制霉菌素分别用用0.25um的微滤膜过滤除菌，按比例将上述备用成分在60-70℃条件下无菌混匀，倒平板。
(3)菌株纯化：将初筛出来的菌株于复筛培养基S2平板上划线，置于30～37℃厌氧箱中继续培养48～72小时，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察形态单一的长杆状菌体，则认为已纯化。复筛培养基为：20％的脱脂牛奶粉，与等体积的3％的琼脂混合，115℃灭菌20min，混合均匀，倒平板。
(4)将纯化后的单菌落，如果革兰氏染色法为阳性，触酶试验为阴性，显微镜下观察为长杆状，菌落粘稠，为疑似马乳酒样乳杆菌。
实施例6
将实施例1～5筛选得到的疑似马乳酒样乳杆菌利用16S rDNA分子鉴定法进行菌种分类学鉴定，具体步骤如下：
细菌全基因组DNA提取方法采用康为世纪细菌全基因组提取试剂盒,按照说明书步骤操作。
分离菌株细菌16s rRNA鉴定
PCR扩增采用通用引物进行PCR扩增：通用引物核苷酸序列如下：
正向引物为27F：GAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID No.1)；
反向引物为1492R:TACCGCGGCTGCTGGCAC(SEQ ID No.2)。
以提取的细菌全基因组为模板，以细菌16srRNA序列通用引物进行PCR扩增，PCR引物合成及序列测定均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
反应体系为：
DNA模板 1.0μL
2×TaqPCRMix 25.0μL
正向引物(10μΜ) 1.0μL
反向引物(10μΜ) 1.0μL
ddH2O 22.0μL
总体系 50.0μL
PCR反应程序为：95℃预变性8min；95℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析。序列测序完成后，得到实施例1～5的菌株序列进行比对，发现5段DNA片段序列一致性达到100％(核苷酸序列见SEQ ID No.3)，这说明实施例1～5筛选的菌株为同一种菌。将测序得到的DNA片段利用NCBI数据库进行序列相似性比对，得到序列相似度为100％。
实施例7
将实施例1筛选得到菌种进行发酵，测定发酵产物中多糖含量，具体步骤如下：
将实施例1纯化后的菌种接种到种子培养基(S3)中，容量为250ml的三角瓶中装有25～30ml的种子培养基，在温度35℃下，厌氧培养60小时，然后再以5％的接种量接种到发酵培养基中，发酵条件为：500ml三角瓶中装含有250ml培养基，在温度为37℃下，厌氧培养72小时，每隔8小时测定发酵液的多糖含量、菌体数量和pH值变化情况。将发酵液8000r/min离心10min，上清液。用苯酚-硫酸法测定多糖含量，具体是取三支试管，分别吸取200μL浓度为1mg/mL的多糖溶液至三支试管内，三支试管依次加入200μL蒸馏水，6％的苯酚溶液，1mL浓硫酸，室温静置10min，摇匀后再室温静置20min，酶标仪在490nm处测定其吸光度值。
发酵过程中菌体含量和pH值变化情况如图3所示。由图3可以看出，从发酵24h开始菌体进入对数期，发酵48h时菌体生长进入平稳期。pH值的变化情况，从发酵开始到发酵40h内，发酵液的pH值迅速下降，说明这阶段是菌体大量产酸的过程。
发酵过程中多糖含量变化情况如图4所示。由图4可以看出，从发酵16h到48h内，多糖含量迅速升高，到56h时多糖含量达到最高值，为2300mg/L，这说明本发明筛选得到的菌株具有产多糖含量的特点。
实施例8
马乳酒样乳杆菌具有调节肠道菌群平衡的测定
(1)实验选取SPF级Balb/c雄性小鼠，体重(33±3.1)g，小鼠饲养于相对湿度55±5％，温度25℃，12h昼夜光照交替，试验期间小鼠自由摄水和饮食。所有试验均按照《实验动物管理与使用指南》进行操作。在实验前进行环境适应4周，所有实验小鼠保证健康状态。
(2)选用12周龄的成年小鼠作为研究对象，所有小鼠均身体健康，正常摄食，皮毛光滑，适应4周后，为了研究ZW3对于小鼠肠道菌群的调节作用，三只小鼠连续灌胃0.4mLZW3菌悬液(108CFU/mL)14天，并且在第0天、第7天、第14天和第21天采用腹部按摩法收集小鼠0.5-0.8g粪便，进行菌群结构的分析结果发现，灌胃后的小鼠肠道中，产生丁酸的毛螺菌科和乳杆菌科明显增多，而致病性理研菌科和红球菌属明显减少，说明ZW3菌株可以一定程度上促进肠道有益菌的生长，抑制有害菌繁殖，从而调节肠道菌群结构，保护肠道健康。
实施例9
马乳酒样乳杆菌具有提升马苏里拉干酪(mozzarella)干酪拉伸性的测定
(1)本研究以一株胞外多糖生产菌株一种马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种菌株Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciens ZW3作为辅助发酵剂，和保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌共同用于马苏里拉奶酪的制备。
(2)干酪的制作流程为：鲜奶→巴氏杀菌(63.5℃30min)→冷却(32℃)→添加发酵剂(2％)→加入凝乳剂→搅拌和加温→乳清排放→加盐(2％)→成型压榨→成熟和贮存。
马苏里拉干酪(mozzarella)的制作参考Scott,R(1981)所描述的方法。新鲜牛奶72℃巴氏杀菌15秒，之后冷却至30℃。随后进行接种发酵。发酵至pH为5.4后，将牛奶温度降低至10℃，随后添加凝乳酶(添加单位不同，凝乳时间不同)。将温度升至30℃后，进行切割，将凝固的牛奶切割至小的立方体。30℃条件下保持20-25分钟后，在45℃进行热处理45min。随后让乳清尽量析出，酪蛋白形成圆形的小球，待乳清析出完毕之后，放于磨具中成型。将干酪保存在4℃。
(3)为了比较ZW3对干酪品质的改善作用，本研究设计了实验组和对照组，其中发酵剂分别为实验组(ZW3、德式乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌)和对照组(德式乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌)，研究结果表明含有ZW3的实验组制得的马苏里拉奶酪样品拉伸长度可超过60cm，远远高于对照组，熟化4周之后奶酪的拉伸性能也有一定程度的提高，含有ZW3实验组组的奶酪拉伸长度增加至112～120cm，对照组为70～74cm，因此添加产EPS的ZW3菌株可以增加马苏里拉干酪的拉伸性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 诺佰克（武汉）生物科技有限公司
<120> 一种调节肠道菌群平衡的菌株及其筛选培养基、筛选方法和应用
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagtttgatc ctggctcag 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taccgcggct gctggcac 18
<210> 3
<211> 1574
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcaaaatga gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc 60
aagtcgagcg agcggaacca gcagaatcac ttcggtgagg acgctgggaa agcgagcggc 120
ggatgggtga gtaacacgtg gggaacctgc ccttaagtct gggataccac ttggaaacag 180
gtgctaatac cggataagaa agcagttcgc atgaacagct tttaaaaggc ggcgcaagct 240
gtcgctaaag gatggacccg cggtgcatta gctagttggt aaggtaacgg cctaccaagg 300
cagtgatgca tagccgagtt gagagactga tcggccacat tgggactgag acacggccca 360
aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc tgatggagca 420
acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggac cgtaaagctc tgttgttggt gaagaaggat 480
agaggtagta actggccttt atttgacggt aatcaaccag aaagtcacgg ctaactacgt 540
gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc 600
gagcgcaggc ggaagaataa gtctgatgtg aaagccctcg gcttaaccga ggaattgcat 660
cggaaactgt ttttcttgag tgcagaagag gagagtagaa ctccatgtgt agcggtggaa 720
tgcgtagata tatggaagaa taccagtggc gaaggcggct ctctggtctg caactgacgc 780
tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa 840
cgatgagtgc taagtgttgg gaggcttccg cctctcagtg ctgcagctaa cgcattaagc 900
actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 960
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 1020
atctagtgcc atttgtagag atacaaagtt cccttcgggg acgctaagac aggtggtgca 1080
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1140
tgttattagt tgccagcatt aagttgggca ctctaatgag actgccggtg acaaaccgga 1200
ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1260
caatgggcag cacaacgagc agcgagcctg caaaggcaag caaatctctg aaagctgttc 1320
tcagttcgga ctgcagtctg caactcgact gcacgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg 1380
atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1440
gagtctgcaa tgcccaaagc cggtggccta accgcaagga aggagccgtc taaggcaggg 1500
cagatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtagga gaacctgcgg ctggatcacc 1560
tcctttctaa ggaa 1574

Claims (10)

1.一种马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种菌株Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciens，保藏编号CGMCC No.2809，菌株编号ZW3。
2.一种权利要求1所述马乳酒样乳杆菌菌株的筛选培养基，其特征在于，每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液包含以下质量的组分，葡萄糖8～15g，乳糖8～14g，吐温-801～7ml，32°～38°白酒8～65ml，酸性指示剂2～10ml，抗霉菌类抗生素1～2ng，琼脂12～22g。
3.根据权利要求2所述的筛选培养基，其特征在于，每1000ml的脱蛋白羊奶乳清溶液包含以下质量的组分，葡萄糖10～12g，乳糖10～12g，吐温-802～5ml，32°～38°白酒10～60ml，酸性指示剂4～8ml，抗霉菌类抗生素1.2～1.8ng，琼脂15～20g。
4.一种分离权利要求1所述马乳酒样乳杆菌菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取西藏开菲尔粒加入富集培养基，厌氧培养，得到富集乳液；
2)将所述步骤1)中得到的富集乳液接种到权利要求2或3所述的筛选培养基上，厌氧培养，得到菌落；
3)从所述步骤2)中得到的菌落中筛选得到黄色菌落接种至所述筛选培养基中，得到初筛菌；
4)从所述步骤3)中的初筛菌中挑选颜色为黄色或乳白色且质地粘稠的菌落划线接种到复筛培养基中，厌氧培养，重复划线接种培养步骤2～4次，得到纯化马乳酒样乳杆菌菌株。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述富集培养基为羊奶粉水溶液或鲜羊奶；所述羊奶粉水溶液的质量浓度为10％～14％。
6.根据权利要求4或5所述的筛选方法，其特征在于，复筛培养基包括质量浓度为15～25％的脱脂牛奶粉和质量浓度为2～3.5％的琼脂。
7.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)或步骤4)中厌氧培养的时间为48～72h；
所述步骤2)中厌氧培养的时间为72～120h。
8.根据权利要求4或7所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)、步骤2)或步骤4)中厌氧培养的温度为30～37℃。
9.权利要求1所述的菌株或权利要求4～8任意一项所述方法筛选得到的菌株在制备功能性食品或预防或治疗便秘和腹泻及提高机体抵抗力的药物中应用。
10.权利要求1所述的菌株或权利要求4～8任意一项所述方法筛选得到的菌株在改善干酪品质中的应用。
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