CN113475621A - 一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法 - Google Patents

一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113475621A
CN113475621A CN202110628967.4A CN202110628967A CN113475621A CN 113475621 A CN113475621 A CN 113475621A CN 202110628967 A CN202110628967 A CN 202110628967A CN 113475621 A CN113475621 A CN 113475621A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bifidobacterium lactis
fermentation
seed liquid
fermented feed
fermented
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110628967.4A
Other languages
English (en)
Inventor
康凌宇
陈华友
姚丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Kangxing Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Kangxing Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Kangxing Biotechnology Co ltd filed Critical Zhejiang Kangxing Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110628967.4A priority Critical patent/CN113475621A/zh
Publication of CN113475621A publication Critical patent/CN113475621A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23KFODDER
    • A23K10/00Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/12Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23KFODDER
    • A23K10/00Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A23K10/37Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms from waste material
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23KFODDER
    • A23K30/00Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571Microorganisms; Enzymes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11Lactobacillus
    • A23V2400/165Paracasei
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51Bifidobacterium
    • A23V2400/531Lactis
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87Re-use of by-products of food processing for fodder production

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物饲料领域,具体涉及一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法;步骤为:活化菌株,得到枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌、凝结芽孢杆菌和副干酪乳杆菌发酵种子液;豆粕与豆渣、次粉混合得到发酵培养基,在密封条件下进行厌氧发酵后获得成品;本发明采用混菌厌氧发酵模式,利用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和凝结芽孢杆菌消耗发酵初期环境中的残余氧气,副干酪乳杆菌产酸丰富,为乳双歧杆菌提供适宜生长的环境pH,通过菌株间的共生协同作用,提高菌体密度,发酵彻底,乳双歧杆菌菌量高,有机酸含量丰富,适口性好,经济效益高;本发明利用qPCR方法检测发酵饲料中乳双歧杆菌的数量,检测时间短、灵敏度高。

Description

一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法
技术领域
本发明属于生物饲料领域,具体涉及一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法。
背景技术
双歧杆菌是厌氧益生菌,是动物肠道菌群的重要组成部分,可以分解糖类,产生醋酸、乳酸等酸类;双歧杆菌通过细胞壁中的磷壁酸与肠黏膜上皮细胞特异性结合,黏附在肠黏膜表面,形成生物菌膜,起到占位保护作用,具有稳定肠道内环境、抵御有害菌感染,促进消化等功能。双歧杆菌可以较好地利用豆粕中的水苏糖,降解原料中抗营养因子。然而,双歧杆菌比其他细菌更易受氧气、pH值、储藏温度等因素的影响,发酵基质中不同菌株的存在也会影响双歧杆菌生长,如微生物代谢产生的抑菌物质以及菌株对底物营养的竞争利用或菌株间的拮抗作用,都可能抑制双歧杆菌的生长;当发酵基质中存在与双歧杆菌具有共生或协同作用的微生物时,则会促进双歧杆菌的生长。双歧杆菌即使在牛奶中也需要较长的发酵条件和严格的厌氧条件。因此,双歧杆菌多以微生物制剂形式应用于养殖行业,在发酵饲料中的应用受到限制。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌,具有芽孢杆菌和乳酸菌的双重特性,在有氧、微氧和无氧环境下均可以进行代谢反应,弥补了枯草芽孢杆菌在微氧、无氧条件的下代谢变缓、产酶量降低的不足。凝结芽孢杆菌通过EMP途径发酵葡萄糖,通过磷酸戊糖途径发酵木糖,具有较高的乳酸产量。凝结芽孢杆菌是芽孢产生菌,与其他乳酸菌相比,其在热处理和低温贮藏过程中具有更好的抗逆性和稳定性。此外,凝结芽孢杆菌还能提高蛋白酶和淀粉酶的活性。
目前已有一些研究将双歧杆菌应用于饲料发酵,如专利CN 103981123A,其采用豆粕、麸皮和玉米粉作为发酵原料,利用植物乳杆菌和乳双歧杆菌进行分段发酵,但是工艺复杂且增加污染风险。专利CN 103421710A将干酪乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌进行混合固态发酵,发酵后pH值较高,为5.10,而只有当pH低于4.5时,才能有效抑制病原菌生长,因此缩短了保存期。此两个公开发明专利均未添加枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、酵母菌等产消化酶丰富的菌株,底物代谢不彻底,同时由于发酵环境中可能存在残留氧气,缺失好氧菌会影响厌氧环境营造,抑制双歧杆菌的生长,降低发酵质量。现有研究报道没有检测发酵饲料中双歧杆菌的菌量变化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和乳双歧杆菌进行一步厌氧固态发酵豆粕、豆渣和次粉,从而制备一种富含乳双歧杆菌的发酵饲料,所述发酵饲料发酵彻底,有机酸含量高,具有酸香味,含有乳双歧杆菌菌量高,适口性好,饲料利用率高;同时操作简单,生产成本低,具有较高经济价值。
为了实现以上目的,本发明采用的技术方案具体如下:
(1)将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基中进行活化培养,分别得到枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液;
(2)将豆粕、豆渣和次粉混合均匀,得到厌氧发酵培养基:
(3)接种步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液分别加入步骤(2)得到的厌氧发酵培养基中,混合均匀,得到厌氧发酵混合物,调整发酵温度以及培养基含水量,在密封条件下进行厌氧发酵,厌氧发酵后获得成品,即为富含乳双歧杆菌发酵饲料;
(4)制作乳双歧杆菌标准曲线:将乳双歧杆菌基因组DNA用乳双歧杆菌特异性引物进行PCR扩增,获得的PCR产物经切胶、回收后,稀释至1×102~1×109拷贝/μL,作为标准品进行荧光定量PCR(qPCR)反应,记录荧光定量PCR反应过程中产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数(Ct值);将测得的标准品DNA浓度换算成拷贝数,以拷贝数的对数值为横坐标,对应Ct值为纵坐标,生成标准曲线;
其中拷贝数计算公式如下:拷贝数=DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数);
(5)取步骤(3)制备的一定量饲料样品,提取DNA进行qPCR检测,得到Ct值,根据步骤(4)所得标准曲线计算乳双歧杆菌数量。
优选的,步骤(1)所述乳酸菌为凝结芽孢杆菌、副干酪乳杆菌或乳双歧杆菌的一种或多种。
优选的,步骤(2)中所述厌氧发酵培养基的各组分重量百分含量分别为:
豆粕37%~52.5%;
豆渣40%~55.5%;
次粉7.5%~19.5%。
优选的,步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌种子液和酿酒酵母种子液的接种量均为厌氧发酵培养基重量的1%~3%;所述枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液的活菌总数均为1.0×108~2.1×109cfu/mL。
优选的,步骤(3)中所述乳双歧杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的2%~4%,所述乳双歧杆菌种子液的活菌总数为1.3×108~2.7×109cfu/mL。
优选的,步骤(3)中所述乳酸菌种子液包括凝结芽孢杆菌种子液、副干酪乳杆菌种子液的一种或多种;凝结芽孢杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的4%~6%,所述凝结芽孢杆菌种子液的活菌总数为2.5×108~5.3×109cfu/mL;副干酪乳杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的1%~4%,所述副干酪乳杆菌种子液的活菌总数为1.1×108~3.7×109cfu/mL。
优选的,步骤(3)中所述发酵的温度为25~38℃,时间为5~30天。
优选的,步骤(3)中所述调整培养基的含水量为40%~60%。
优选的,步骤(4)中所述乳双歧杆菌特异性引物是以细菌延展因子蛋白的编码基因tuf作为目标基因,上游引物F:TCACGACAAGTGGGTTGCCA,下游引物R:GTTGATCGGCAGCTTGCCG,扩增片段大小为178bp。
优选的,步骤(4)中所述取乳双歧杆菌DNA提取方法为:取乳双歧杆菌发酵种子液1mL,12000rpm离心2分钟,弃上清,加入60μL TE Buffer,100℃煮沸2分钟,冷却后8000rpm离心1分钟,吸取上清液,得到乳双歧杆菌基因组DNA。
优选的,步骤(5)所述发酵饲料DNA提取方法为:准确称取1g发酵饲料,加入10mLPBS缓冲液,振荡20分钟后用8层纱布过滤,取1mL滤液,12000rpm离心2分钟,弃上清,加入60μL TE Buffer,100℃煮沸2分钟,冷却后8000rpm离心1分钟,吸取上清液,得到饲料样品DNA模板。
优选的,步骤(5)中所述qPCR反应体系为SYBR Green Premix Ex Taq 10μL,RoxReference Dye 0.4μL,上、下游引物各0.8μL,DNA模板2μL,ddH2O 6μL。
优选的,步骤(5)中所述qPCR反应条件:95℃预变性30s,扩增95℃5s、60℃30s共40个循环,之后进行熔解曲线分析。
菌种来源:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC1.921、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.1527、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC1.10823、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CGMCC1.12731、乳双歧杆菌(Bifidobacterim animalis subsp.lactis)CGMCC1.15623,上述菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本发明的有益效果是:
(1)本发明方法采用豆渣和豆粕这种价格低廉的豆制品作为发酵原料,生产成本低;采用厌氧发酵工艺,物料损失少,生产过程中不易污染;不需要大型设备的投入,生产工艺简便易操作。
(2)本发明采用混菌固态发酵,发酵彻底,产物丰富,富含有机酸、小肽、维生素等小分子物质,具有独特的酸香味,适口性好,乳双歧杆菌菌量高,提高动物对饲料的消化吸收率,减少肠道条件致病菌,降低疾病的发生率。
(3)本发明采用多种益生菌协同发酵,所用凝结芽孢杆菌可以产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及木聚糖酶等,凝结芽孢杆菌既具有芽孢杆菌特性又能产乳酸,发酵前期凝结芽孢杆菌消耗部分氧气,同时分泌蛋白酶,给双歧杆菌提供良好的生长环境。副干酪乳杆菌产酸丰富,有较好的益生效用。枯草芽孢杆菌可以分泌丰富的胞外酶系,在其繁殖过程中,大量分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶等,有助于降解饲料原料中蛋白质、多糖、脂肪等有机物,为其他益生菌的生长提供能量物质。酿酒酵母可以消耗发酵前期共生环境中的氧气,提高益生菌在饲料表面的黏附性,为乳酸菌创造有益于其发酵的厌氧环境,特别是酿酒酵母可以根据不同的碳源分泌对乳酸菌有促进作用的生长因子。在枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、凝结芽孢杆菌发酵耗氧达到乳酸菌发酵的氧气量时乳双歧杆菌和其他乳酸菌开始增殖发酵且产酸,使得发酵料成品具有浓郁的酸香味,同时抑制其他杂菌的生长,发酵后期凝结芽孢杆菌逐渐生成芽孢,饲料保存时间长。
(4)本发明应用qPCR方法检测发酵饲料中乳双歧杆菌的数量,检测时间短、灵敏度高,为生物饲料发酵过程中菌群变化的研究提供方法参考。
附图说明
图1为乳双歧杆菌引物特异性验证图;
其中,M为DNA Marker,从上到下依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp,1、2号泳道为乳双歧杆菌;3、4号泳道为发酵乳杆菌,5、6号泳道为植物乳杆菌,7、8号泳道为副干酪乳杆菌,9、10号泳道为鼠李糖乳杆菌,11、12号泳道为凝结芽孢杆菌。
图2为乳双歧杆菌的标准曲线图。
图3为实施例1中乳双歧杆菌菌量测定结果图。
图4为实施例2中乳双歧杆菌菌量测定结果图。
图5为实施例3中乳双歧杆菌菌量测定结果图。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1:
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌的活化培养:
A、培养基配制
枯草芽孢杆菌液体和固体培养基:胰蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母粉5g,蒸馏水1L,pH自然,121℃灭菌20min;枯草芽孢杆菌固体培养基的成分同液体培养基,区别是加入琼脂15g。
酿酒酵母液体和固体培养基:200g马铃薯煮软后8层纱布滤汁,葡萄糖20g,磷酸二氢钾3g,硫酸镁1.5g,蒸馏水定容至1L,pH自然,121℃灭菌20min;酿酒酵母固体培养基的成分同液体培养基,区别是加入琼脂15g
乳酸菌液体和固体培养基:牛肉膏10g,胰蛋白胨10g,葡萄糖20g,酵母粉5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二铵2g,无水乙酸钠5g,吐温80 1mL,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g,蒸馏水1L,pH7.2,121℃灭菌20min,乳酸菌固体培养基的成分同液体培养基,区别是加入琼脂15g。
双歧杆菌液体和固体培养基:牛肉膏10g,胰蛋白胨10g,葡萄糖20g,酵母粉5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二铵2g,无水乙酸钠5g,吐温80 1mL,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g,L-半胱氨酸盐酸盐0.5g,蒸馏水1L,pH7.2,121℃灭菌20min,双歧杆菌固体培养基的成分同液体培养基,区别是加入琼脂15g。
B、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌的活化培养方法:
枯草芽孢杆菌液体菌种培养:无菌条件下将-80℃保存的甘油菌接种至固体培养基,30℃培养18h复苏菌种,挑取单菌落接种于装有100m L枯草芽孢杆液体培养基的摇瓶(250m L)中,180r/min,30℃培养12h,得到枯草芽孢杆菌发酵种子液,按实际需要再以2%的接种量接种到枯草芽孢杆液体培养基中扩大培养;
酿酒酵母液体菌种培养:无菌条件下将-80℃保存的甘油菌接种至酵母固体培养基,28℃培养20h复苏菌种,挑取单菌落接种于装有100m L酵母液体培养基的摇瓶(250m L)中,180r/min,28℃培养12h,得到枯草芽孢杆菌发酵种子液,按实际需要再以2%的接种量接种到酵母液体培养基中扩大培养;
乳酸菌液体菌种培养:无菌条件下分别将-80℃保存的甘油菌接种至乳酸菌固体培养基,37℃培养24h复苏菌种,挑取单菌落接种到装有50mL乳酸菌液体培养基的厌氧瓶(50mL)中,静置37℃培养16h,得到乳酸菌发酵种子液,按实际需要再以2%的接种量接种到乳酸菌液体培养基中扩大培养;所述乳酸菌包括凝结芽孢杆菌CGMCC1.10823、副干酪乳杆菌CGMCC1.12731,乳双歧杆菌CGMCC1.15623;
(2)配制好厌氧发酵培养基,各组分重量百分含量分别为:豆渣45%,豆粕45%,次粉10%,混合均匀,得到厌氧发酵培养基;
(3)将步骤(1)活化培养后的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、凝结芽孢杆菌发酵种子液和乳双歧发酵种子液接种到发酵培养基,枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的接种量均为发酵培养基重量的2%,枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌总数均为1.5×109cfu/mL,凝结芽孢杆菌接种量为发酵培养基重量的4%,活菌总数为2.5×109cfu/mL,乳双歧杆菌接种量为发酵培养基重量的2%,活菌总数为1.3×109cfu/mL,混合均匀,调整含水量为55%,得到厌氧发酵混合物;置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵,发酵温度为37%,发酵6天后获得成品,即为富含乳双歧杆菌发酵饲料;
检测步骤(3)所得发酵饲料中乳双歧杆菌的数量;
(4)乳双歧杆菌菌量测定
A、基因组提取:取步骤(1)制备得到的乳双歧杆菌活菌液1mL,12000rpm离心2分钟,弃上清,加入60μL TE Buffer,100℃煮沸2分钟,冷却后8000rpm离心1分钟,小心吸取上清液,得到乳双歧杆菌基因组DNA。
B、标准曲线构建:将乳双歧杆菌基因组DNA用tuf引物对(上游引物F:TCACGACAAGTGGGTTGCCA,下游引物R:GTTGATCGGCAGCTTGCCG)进行PCR扩增,获得的PCR产物经切胶、回收后,稀释至1×102~1×109拷贝/μL,作为标准品进行荧光定量PCR反应。将测得标准品的DNA浓度换算成拷贝数,以拷贝数的对数值为横坐标,对应Ct值为纵坐标,生成乳双歧杆菌标准曲线;
拷贝数计算公式如下:拷贝数=DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数);
结果如图2所示,所述乳双歧杆菌的标准曲线拟合方程为y=-3.6457x+36.845;
C、饲料样品DNA提取:准确称取步骤(3)所得发酵饲料1g,加入10mL PBS缓冲液,振荡20分钟后用8层纱布过滤,取1mL滤液,12000rpm离心2分钟,弃上清,加入60μL TEBuffer,100℃煮沸2分钟,冷却后8000rpm离心1分钟,小心吸取上清液,得到饲料样品DNA模板;
D、荧光定量PCR检测:采用QuantStudio 3Real-Time PCR System(AppliedBiosystems公司)进行扩增与分析。荧光定量PCR反应体系为:SYBR Green Premix Ex Taq10μL,Rox Reference Dye 0.4μL,上、下游引物各0.8μL,DNA模板2μL,ddH2O 6μL。荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30s,扩增95℃5s、60℃30s共40个循环,之后进行熔解曲线分析,所得Ct值根据标准曲线计算乳双歧杆菌数量。
具体结果见图3,图中B.lactis为乳双歧杆菌;通过检测结果可知,本发明所获的成品中,乳双歧杆菌的菌量为1.22×108cfu/g;其中发酵1天乳双歧杆菌菌量达到最大值,为3.30×108cfu/g,是发酵前菌量的14.4倍。
表1是实施例1的发酵成品各检测指标的结果
检测项目 含量
小肽(%) 16.16
总酸(%) 2.99
pH 4.54
实施例2:
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌的活化培养,具体操作同实施例1;
(2)配制厌氧发酵培养基:各组分重量百分含量分别为:豆渣50%;豆粕42.5%;次粉7.5%:混合均匀,得到厌氧发酵培养基;
(3)将步骤(1)活化培养后的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、副干酪乳杆菌种子液和乳双歧杆菌发酵种子液接种到发酵培养基,枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的接种量均为发酵培养基重量的1.5%,枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌总数均为1.3×109cfu/mL,副干酪乳杆菌接种量为发酵培养基重量的1.5%,活菌总数为1.6×109cfu/mL,乳双歧杆菌接种量为发酵培养基重量的3%,活菌总数为1.9×109cfu/mL,混合均匀,调整含水量为50%,得到厌氧发酵混合物;置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵,发酵温度为33℃,发酵15天后获得成品。
(4)乳双歧杆菌菌量测定:具体操作同实施例1。
具体结果见图4,图中B.lactis为乳双歧杆菌;通过检测结果可知,本发明所获的成品中,乳双歧杆菌菌量为5.85×107cfu/g;发酵1天乳双歧杆菌菌量达到最大值,为5.76×108cfu/g,是发酵前菌量的11倍。
表2是实施例2的发酵成品各检测指标的结果
检测项目 含量
小肽(%) 20.06
总酸(%) 4.86
pH 4.13
实施例3:
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌的活化培养,具体操作同实施例1;
(2)配制厌氧发酵培养基:各组分重量百分含量分别为:豆渣48%;豆粕37%;次粉15%:混合均匀,得到厌氧发酵培养基;
(3)将步骤(1)活化培养后的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、凝结芽孢杆菌发酵种子液、副干酪乳杆菌种子液和乳双歧发酵种子液接种到发酵培养基,枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的接种量均为发酵培养基重量的3%,枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌总数均为2.1×109cfu/mL,凝结芽孢杆菌接种量为发酵培养基重量的5%,活菌总数为4.2×109cfu/mL,副干酪乳杆菌接种量为发酵培养基重量的2%,活菌总数为1.9×109cfu/mL,乳双歧杆菌接种量为发酵培养基重量的3.5%,活菌总数为2.5×109cfu/mL,混合均匀,调整含水量为58%,得到厌氧发酵混合物;置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵,发酵温度为35℃,发酵30天后获得成品,并检测各项指标验证饲料品质。
(4)乳双歧杆菌菌量测定:具体操作同实施例1。
具体结果见图5,图中B.lactis为乳双歧杆菌;通过检测结果可知,本发明所获的成品中,乳双歧杆菌菌量为6.04×107cfu/g;发酵10天乳双歧杆菌菌量达到最大值,为4.94×108cfu/g,是发酵前菌量的6.1倍。
表3是实施例3的发酵成品各检测指标的结果
检测项目 含量
小肽(%) 22.65
总酸(%) 4.55
pH 4.34
表1-3是发酵成品各检测指标的结果,其中所测小肽含量指的是小肽占所测样品中粗蛋白含量的比例;测得的物质包括小肽、寡肽以及少量多肽和游离氨基酸等;结果显示,本发明采用混菌固态发酵,发酵彻底,产物丰富,小肽含量高。
说明:以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案;因此,尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明,但是本领域的普通技术人员应当理解,仍然可以对本发明进行修改或等同替换;而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进,其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法,其特征在于,制备步骤如下:
(1)将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基中进行活化培养,分别得到枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液;
(2)将豆粕、豆渣和次粉混合均匀,得到厌氧发酵培养基:
(3)接种步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液分别加入步骤(2)得到的厌氧发酵培养基中,混合均匀,得到厌氧发酵混合物,调整发酵温度以及培养基含水量,在密封条件下进行厌氧发酵,厌氧发酵后获得成品,即为富含乳双歧杆菌发酵饲料;
(4)制作乳双歧杆菌标准曲线:将乳双歧杆菌基因组DNA用乳双歧杆菌特异性引物进行PCR扩增,获得的PCR产物经切胶、回收后,稀释至1×102~1×109拷贝/μL,作为标准品进行荧光定量PCR反应,记录荧光定量PCR反应过程中产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数,即为Ct值;将测得的标准品DNA浓度换算成拷贝数,以拷贝数的对数值为横坐标,对应Ct值为纵坐标,生成标准曲线;
其中拷贝数计算公式如下:拷贝数=DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数);
(5)取步骤(3)制备的一定量饲料样品,提取DNA进行qPCR检测,得到Ct值,根据步骤(4)所得标准曲线计算乳双歧杆菌数量。
2.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法,其特征在于,步骤(1)所述乳酸菌为凝结芽孢杆菌、副干酪乳杆菌或乳双歧杆菌的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法,其特征在于,步骤(2)中所述厌氧发酵培养基的各组分重量百分含量分别为:
豆粕37%~52.5%;
豆渣40%~55.5%;
次粉7.5%~19.5%。
4.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法,其特征在于,步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌种子液和酿酒酵母种子液的接种量均为厌氧发酵培养基重量的1%~3%;所述枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液的活菌总数均为1.0×108~2.1×109cfu/mL。
5.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法,其特征在于,步骤(3)中所述乳双歧杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的2%~4%,所述乳双歧杆菌种子液的活菌总数为1.3×108~2.7×109cfu/mL。
6.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法,其特征在于,步骤(3)中所述乳酸菌种子液包括凝结芽孢杆菌种子液、副干酪乳杆菌种子液的一种或多种;凝结芽孢杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的4%~6%,所述凝结芽孢杆菌种子液的活菌总数为2.5×108~5.3×109cfu/mL;副干酪乳杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的1%~4%,所述副干酪乳杆菌种子液的活菌总数为1.1×108~3.7×109cfu/mL。
7.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法,其特征在于,步骤(3)中所述发酵的温度为25~38℃,时间为5~30天;所述调整培养基的含水量为40%~60%。
8.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法,其特征在于,步骤(4)中所述乳双歧杆菌特异性引物是以细菌延展因子蛋白的编码基因tuf作为目标基因,上游引物F:TCACGACAAGTGGGTTGCCA,下游引物R:GTTGATCGGCAGCTTGCCG,扩增片段大小为178bp;所述取乳双歧杆菌DNA提取方法为:取乳双歧杆菌发酵种子液1mL,12000rpm离心2分钟,弃上清,加入60μL TE Buffer,100℃煮沸2分钟,冷却后8000rpm离心1分钟,吸取上清液,得到乳双歧杆菌基因组DNA。
9.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法,其特征在于,步骤(5)所述发酵饲料DNA提取方法为:称取1g发酵饲料,加入10mL PBS缓冲液,振荡20分钟后用8层纱布过滤,取1mL滤液,12000rpm离心2分钟,弃上清,加入60μL TE Buffer,100℃煮沸2分钟,冷却后8000rpm离心1分钟,吸取上清液,得到饲料样品DNA模板;
所述qPCR反应体系为SYBR Green Premix Ex Taq 10μL,Rox Reference Dye 0.4μL,上、下游引物各0.8μL,DNA模板2μL,ddH2O 6μL;所述qPCR反应条件:95℃预变性30s,扩增95℃5s、60℃30s共40个循环。
10.根据权利要求1~9任一所述方法生产的富含乳双歧杆菌发酵饲料。
CN202110628967.4A 2021-06-04 2021-06-04 一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法 Pending CN113475621A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110628967.4A CN113475621A (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110628967.4A CN113475621A (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113475621A true CN113475621A (zh) 2021-10-08

Family

ID=77934794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110628967.4A Pending CN113475621A (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113475621A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113981115A (zh) * 2021-11-30 2022-01-28 广州舒客实业有限公司 用于快速鉴定副干酪乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用
CN115191523A (zh) * 2022-06-27 2022-10-18 陈华友 一种水质改良型发酵饲料的生产方法及在水产养殖中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2412612C1 (ru) * 2009-12-29 2011-02-27 ООО "Научно-технический центр биологических технологий в сельском хозяйстве" Способ получения пробиотической кормовой добавки ферм км для сельскохозяйственных животных и птицы
CN103911326A (zh) * 2014-03-28 2014-07-09 内蒙古和美科盛生物技术有限公司 凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备
CN109511810A (zh) * 2018-12-28 2019-03-26 浙江康星生物科技有限公司 一种用于哺乳母猪的微生物饲料的制备方法及其应用
CN110079587A (zh) * 2019-05-24 2019-08-02 浙江康星生物科技有限公司 一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法
CN110074252A (zh) * 2019-05-20 2019-08-02 浙江康星生物科技有限公司 一种基于豆渣的高效低成本的发酵饲料加工方法及应用
WO2019178309A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Sustainable Community Development, Llc Probiotic composition and feed additive

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2412612C1 (ru) * 2009-12-29 2011-02-27 ООО "Научно-технический центр биологических технологий в сельском хозяйстве" Способ получения пробиотической кормовой добавки ферм км для сельскохозяйственных животных и птицы
CN103911326A (zh) * 2014-03-28 2014-07-09 内蒙古和美科盛生物技术有限公司 凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备
WO2019178309A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Sustainable Community Development, Llc Probiotic composition and feed additive
CN109511810A (zh) * 2018-12-28 2019-03-26 浙江康星生物科技有限公司 一种用于哺乳母猪的微生物饲料的制备方法及其应用
CN110074252A (zh) * 2019-05-20 2019-08-02 浙江康星生物科技有限公司 一种基于豆渣的高效低成本的发酵饲料加工方法及应用
CN110079587A (zh) * 2019-05-24 2019-08-02 浙江康星生物科技有限公司 一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈皓: "《环境现代仪器分析实验》", 同济大学出版社, pages: 128 - 129 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113981115A (zh) * 2021-11-30 2022-01-28 广州舒客实业有限公司 用于快速鉴定副干酪乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用
CN115191523A (zh) * 2022-06-27 2022-10-18 陈华友 一种水质改良型发酵饲料的生产方法及在水产养殖中的应用
CN115191523B (zh) * 2022-06-27 2023-12-26 陈华友 一种水质改良型发酵饲料的生产方法及在水产养殖中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111363698B (zh) 一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的菌剂与应用
Chang et al. Syntrophic co-culture of aerobic Bacillus and anaerobic Clostridium for bio-fuels and bio-hydrogen production
US8361778B2 (en) Composition comprising enzymatically digested yeast cells and method of preparing same
CN110616159B (zh) 一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉制备方法
CN104996722A (zh) 一种多菌种两步联合发酵饲料的方法
CN102934736A (zh) 一种红薯皮或红薯粉渣发酵饲料的制备方法
CN110226671A (zh) 一种仔猪用全价发酵饲料及其生产方法
CN113475621A (zh) 一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法
CN102334611A (zh) 米糠基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合菌剂的固态发酵方法
CN103013890B (zh) 一种乳酸杆菌和芽孢杆菌混合培养的方法
CN113736716B (zh) 一株副干酪乳杆菌及黄贮复合生物发酵剂和黄贮方法
CN113444664B (zh) 一株产γ-氨基丁酸短乳杆菌及其应用
CN115287202B (zh) 一株马克斯克鲁维酵母菌及其在制备功能性饲料方面的应用
CN108378223A (zh) 一种低抗原饲用发酵豆粕的制备方法
CN113073064B (zh) 一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用
CN114304379A (zh) 一种含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法
CN113367237A (zh) 一种反刍动物专用菌酶复合饲料添加剂的制备方法
CN109423466B (zh) 一种复合发酵菌剂及其应用
CN104498385B (zh) 高产抗菌肽地衣芽孢杆菌及其应用
CN112998120A (zh) 一种菠萝蜜种子饲料的制备方法
CN109971675B (zh) 一株植物乳杆菌scuec6菌株及其应用
CN115316496B (zh) 一种利用废弃羽毛制备高蛋白益生动物饲料的方法
CN110283926B (zh) 一种玉米秸秆生物饲料发酵过程中菌群变化的检测方法及其应用
KR101470995B1 (ko) 프로피온산 생산능을 갖는 미생물 및 그를 포함하는 조사료 조성물
CN113234632A (zh) 一种通过发酵控制提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination