CN113475621A - 一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法；步骤为：活化菌株，得到枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌、凝结芽孢杆菌和副干酪乳杆菌发酵种子液；豆粕与豆渣、次粉混合得到发酵培养基，在密封条件下进行厌氧发酵后获得成品；本发明采用混菌厌氧发酵模式，利用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和凝结芽孢杆菌消耗发酵初期环境中的残余氧气，副干酪乳杆菌产酸丰富，为乳双歧杆菌提供适宜生长的环境pH，通过菌株间的共生协同作用，提高菌体密度，发酵彻底，乳双歧杆菌菌量高，有机酸含量丰富，适口性好，经济效益高；本发明利用qPCR方法检测发酵饲料中乳双歧杆菌的数量，检测时间短、灵敏度高。

Description

一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法
技术领域
本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法。
背景技术
双歧杆菌是厌氧益生菌，是动物肠道菌群的重要组成部分，可以分解糖类，产生醋酸、乳酸等酸类；双歧杆菌通过细胞壁中的磷壁酸与肠黏膜上皮细胞特异性结合，黏附在肠黏膜表面，形成生物菌膜，起到占位保护作用，具有稳定肠道内环境、抵御有害菌感染，促进消化等功能。双歧杆菌可以较好地利用豆粕中的水苏糖，降解原料中抗营养因子。然而，双歧杆菌比其他细菌更易受氧气、pH值、储藏温度等因素的影响，发酵基质中不同菌株的存在也会影响双歧杆菌生长，如微生物代谢产生的抑菌物质以及菌株对底物营养的竞争利用或菌株间的拮抗作用，都可能抑制双歧杆菌的生长；当发酵基质中存在与双歧杆菌具有共生或协同作用的微生物时，则会促进双歧杆菌的生长。双歧杆菌即使在牛奶中也需要较长的发酵条件和严格的厌氧条件。因此，双歧杆菌多以微生物制剂形式应用于养殖行业，在发酵饲料中的应用受到限制。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，具有芽孢杆菌和乳酸菌的双重特性，在有氧、微氧和无氧环境下均可以进行代谢反应，弥补了枯草芽孢杆菌在微氧、无氧条件的下代谢变缓、产酶量降低的不足。凝结芽孢杆菌通过EMP途径发酵葡萄糖，通过磷酸戊糖途径发酵木糖，具有较高的乳酸产量。凝结芽孢杆菌是芽孢产生菌，与其他乳酸菌相比，其在热处理和低温贮藏过程中具有更好的抗逆性和稳定性。此外，凝结芽孢杆菌还能提高蛋白酶和淀粉酶的活性。
目前已有一些研究将双歧杆菌应用于饲料发酵，如专利CN 103981123A，其采用豆粕、麸皮和玉米粉作为发酵原料，利用植物乳杆菌和乳双歧杆菌进行分段发酵，但是工艺复杂且增加污染风险。专利CN 103421710A将干酪乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌进行混合固态发酵，发酵后pH值较高，为5.10，而只有当pH低于4.5时，才能有效抑制病原菌生长，因此缩短了保存期。此两个公开发明专利均未添加枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、酵母菌等产消化酶丰富的菌株，底物代谢不彻底，同时由于发酵环境中可能存在残留氧气，缺失好氧菌会影响厌氧环境营造，抑制双歧杆菌的生长，降低发酵质量。现有研究报道没有检测发酵饲料中双歧杆菌的菌量变化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和乳双歧杆菌进行一步厌氧固态发酵豆粕、豆渣和次粉，从而制备一种富含乳双歧杆菌的发酵饲料，所述发酵饲料发酵彻底，有机酸含量高，具有酸香味，含有乳双歧杆菌菌量高，适口性好，饲料利用率高；同时操作简单，生产成本低，具有较高经济价值。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案具体如下：
(1)将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基中进行活化培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液；
(2)将豆粕、豆渣和次粉混合均匀，得到厌氧发酵培养基：
(3)接种步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液分别加入步骤(2)得到的厌氧发酵培养基中，混合均匀，得到厌氧发酵混合物，调整发酵温度以及培养基含水量，在密封条件下进行厌氧发酵，厌氧发酵后获得成品，即为富含乳双歧杆菌发酵饲料；
(4)制作乳双歧杆菌标准曲线:将乳双歧杆菌基因组DNA用乳双歧杆菌特异性引物进行PCR扩增，获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×102～1×109拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR(qPCR)反应，记录荧光定量PCR反应过程中产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数(Ct值)；将测得的标准品DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成标准曲线；
其中拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；
(5)取步骤(3)制备的一定量饲料样品，提取DNA进行qPCR检测，得到Ct值，根据步骤(4)所得标准曲线计算乳双歧杆菌数量。
优选的，步骤(1)所述乳酸菌为凝结芽孢杆菌、副干酪乳杆菌或乳双歧杆菌的一种或多种。
优选的，步骤(2)中所述厌氧发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：
豆粕37％～52.5％；
豆渣40％～55.5％；
次粉7.5％～19.5％。
优选的，步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌种子液和酿酒酵母种子液的接种量均为厌氧发酵培养基重量的1％～3％；所述枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液的活菌总数均为1.0×108～2.1×109cfu/mL。
优选的，步骤(3)中所述乳双歧杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的2％～4％，所述乳双歧杆菌种子液的活菌总数为1.3×108～2.7×109cfu/mL。
优选的，步骤(3)中所述乳酸菌种子液包括凝结芽孢杆菌种子液、副干酪乳杆菌种子液的一种或多种；凝结芽孢杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的4％～6％，所述凝结芽孢杆菌种子液的活菌总数为2.5×108～5.3×109cfu/mL；副干酪乳杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的1％～4％，所述副干酪乳杆菌种子液的活菌总数为1.1×108～3.7×109cfu/mL。
优选的，步骤(3)中所述发酵的温度为25～38℃，时间为5～30天。
优选的，步骤(3)中所述调整培养基的含水量为40％～60％。
优选的，步骤(4)中所述乳双歧杆菌特异性引物是以细菌延展因子蛋白的编码基因tuf作为目标基因，上游引物F:TCACGACAAGTGGGTTGCCA,下游引物R:GTTGATCGGCAGCTTGCCG，扩增片段大小为178bp。
优选的，步骤(4)中所述取乳双歧杆菌DNA提取方法为：取乳双歧杆菌发酵种子液1mL，12000rpm离心2分钟，弃上清，加入60μL TE Buffer，100℃煮沸2分钟，冷却后8000rpm离心1分钟，吸取上清液，得到乳双歧杆菌基因组DNA。
优选的，步骤(5)所述发酵饲料DNA提取方法为：准确称取1g发酵饲料，加入10mLPBS缓冲液，振荡20分钟后用8层纱布过滤，取1mL滤液，12000rpm离心2分钟，弃上清，加入60μL TE Buffer，100℃煮沸2分钟，冷却后8000rpm离心1分钟，吸取上清液，得到饲料样品DNA模板。
优选的，步骤(5)中所述qPCR反应体系为SYBR Green Premix Ex Taq 10μL，RoxReference Dye 0.4μL，上、下游引物各0.8μL，DNA模板2μL，ddH2O 6μL。
优选的，步骤(5)中所述qPCR反应条件：95℃预变性30s，扩增95℃5s、60℃30s共40个循环，之后进行熔解曲线分析。
菌种来源：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC1.921、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.1527、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC1.10823、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CGMCC1.12731、乳双歧杆菌(Bifidobacterim animalis subsp.lactis)CGMCC1.15623，上述菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本发明的有益效果是：
(1)本发明方法采用豆渣和豆粕这种价格低廉的豆制品作为发酵原料，生产成本低；采用厌氧发酵工艺，物料损失少，生产过程中不易污染；不需要大型设备的投入，生产工艺简便易操作。
(2)本发明采用混菌固态发酵，发酵彻底，产物丰富，富含有机酸、小肽、维生素等小分子物质，具有独特的酸香味，适口性好，乳双歧杆菌菌量高，提高动物对饲料的消化吸收率，减少肠道条件致病菌，降低疾病的发生率。
(3)本发明采用多种益生菌协同发酵，所用凝结芽孢杆菌可以产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及木聚糖酶等，凝结芽孢杆菌既具有芽孢杆菌特性又能产乳酸，发酵前期凝结芽孢杆菌消耗部分氧气，同时分泌蛋白酶，给双歧杆菌提供良好的生长环境。副干酪乳杆菌产酸丰富，有较好的益生效用。枯草芽孢杆菌可以分泌丰富的胞外酶系，在其繁殖过程中，大量分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶等，有助于降解饲料原料中蛋白质、多糖、脂肪等有机物，为其他益生菌的生长提供能量物质。酿酒酵母可以消耗发酵前期共生环境中的氧气，提高益生菌在饲料表面的黏附性，为乳酸菌创造有益于其发酵的厌氧环境，特别是酿酒酵母可以根据不同的碳源分泌对乳酸菌有促进作用的生长因子。在枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、凝结芽孢杆菌发酵耗氧达到乳酸菌发酵的氧气量时乳双歧杆菌和其他乳酸菌开始增殖发酵且产酸，使得发酵料成品具有浓郁的酸香味，同时抑制其他杂菌的生长，发酵后期凝结芽孢杆菌逐渐生成芽孢，饲料保存时间长。
(4)本发明应用qPCR方法检测发酵饲料中乳双歧杆菌的数量，检测时间短、灵敏度高，为生物饲料发酵过程中菌群变化的研究提供方法参考。
附图说明
图1为乳双歧杆菌引物特异性验证图；
其中，M为DNA Marker，从上到下依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp，1、2号泳道为乳双歧杆菌；3、4号泳道为发酵乳杆菌，5、6号泳道为植物乳杆菌，7、8号泳道为副干酪乳杆菌，9、10号泳道为鼠李糖乳杆菌，11、12号泳道为凝结芽孢杆菌。
图2为乳双歧杆菌的标准曲线图。
图3为实施例1中乳双歧杆菌菌量测定结果图。
图4为实施例2中乳双歧杆菌菌量测定结果图。
图5为实施例3中乳双歧杆菌菌量测定结果图。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌的活化培养：
A、培养基配制
枯草芽孢杆菌液体和固体培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g，蒸馏水1L，pH自然，121℃灭菌20min；枯草芽孢杆菌固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g。
酿酒酵母液体和固体培养基：200g马铃薯煮软后8层纱布滤汁，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，蒸馏水定容至1L，pH自然，121℃灭菌20min；酿酒酵母固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g
乳酸菌液体和固体培养基：牛肉膏10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，无水乙酸钠5g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min，乳酸菌固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g。
双歧杆菌液体和固体培养基：牛肉膏10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，无水乙酸钠5g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min，双歧杆菌固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g。
B、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌的活化培养方法：
枯草芽孢杆菌液体菌种培养：无菌条件下将-80℃保存的甘油菌接种至固体培养基，30℃培养18h复苏菌种，挑取单菌落接种于装有100m L枯草芽孢杆液体培养基的摇瓶(250m L)中，180r/min，30℃培养12h，得到枯草芽孢杆菌发酵种子液，按实际需要再以2％的接种量接种到枯草芽孢杆液体培养基中扩大培养；
酿酒酵母液体菌种培养：无菌条件下将-80℃保存的甘油菌接种至酵母固体培养基，28℃培养20h复苏菌种，挑取单菌落接种于装有100m L酵母液体培养基的摇瓶(250m L)中，180r/min，28℃培养12h，得到枯草芽孢杆菌发酵种子液，按实际需要再以2％的接种量接种到酵母液体培养基中扩大培养；
乳酸菌液体菌种培养：无菌条件下分别将-80℃保存的甘油菌接种至乳酸菌固体培养基，37℃培养24h复苏菌种，挑取单菌落接种到装有50mL乳酸菌液体培养基的厌氧瓶(50mL)中，静置37℃培养16h，得到乳酸菌发酵种子液，按实际需要再以2％的接种量接种到乳酸菌液体培养基中扩大培养；所述乳酸菌包括凝结芽孢杆菌CGMCC1.10823、副干酪乳杆菌CGMCC1.12731，乳双歧杆菌CGMCC1.15623；
(2)配制好厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：豆渣45％，豆粕45％，次粉10％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基；
(3)将步骤(1)活化培养后的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、凝结芽孢杆菌发酵种子液和乳双歧发酵种子液接种到发酵培养基，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的接种量均为发酵培养基重量的2％，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌总数均为1.5×109cfu/mL，凝结芽孢杆菌接种量为发酵培养基重量的4％，活菌总数为2.5×109cfu/mL，乳双歧杆菌接种量为发酵培养基重量的2％，活菌总数为1.3×109cfu/mL，混合均匀，调整含水量为55％，得到厌氧发酵混合物；置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵，发酵温度为37％，发酵6天后获得成品，即为富含乳双歧杆菌发酵饲料；
检测步骤(3)所得发酵饲料中乳双歧杆菌的数量；
(4)乳双歧杆菌菌量测定
A、基因组提取：取步骤(1)制备得到的乳双歧杆菌活菌液1mL，12000rpm离心2分钟，弃上清，加入60μL TE Buffer，100℃煮沸2分钟，冷却后8000rpm离心1分钟，小心吸取上清液，得到乳双歧杆菌基因组DNA。
B、标准曲线构建：将乳双歧杆菌基因组DNA用tuf引物对(上游引物F:TCACGACAAGTGGGTTGCCA,下游引物R:GTTGATCGGCAGCTTGCCG)进行PCR扩增，获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×102～1×109拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR反应。将测得标准品的DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成乳双歧杆菌标准曲线；
拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；
结果如图2所示，所述乳双歧杆菌的标准曲线拟合方程为y＝-3.6457x+36.845；
C、饲料样品DNA提取：准确称取步骤(3)所得发酵饲料1g，加入10mL PBS缓冲液，振荡20分钟后用8层纱布过滤，取1mL滤液，12000rpm离心2分钟，弃上清，加入60μL TEBuffer，100℃煮沸2分钟，冷却后8000rpm离心1分钟，小心吸取上清液，得到饲料样品DNA模板；
D、荧光定量PCR检测：采用QuantStudio 3Real-Time PCR System(AppliedBiosystems公司)进行扩增与分析。荧光定量PCR反应体系为：SYBR Green Premix Ex Taq10μL，Rox Reference Dye 0.4μL，上、下游引物各0.8μL，DNA模板2μL，ddH2O 6μL。荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s，扩增95℃5s、60℃30s共40个循环，之后进行熔解曲线分析，所得Ct值根据标准曲线计算乳双歧杆菌数量。
具体结果见图3，图中B.lactis为乳双歧杆菌；通过检测结果可知，本发明所获的成品中，乳双歧杆菌的菌量为1.22×108cfu/g；其中发酵1天乳双歧杆菌菌量达到最大值，为3.30×108cfu/g，是发酵前菌量的14.4倍。
表1是实施例1的发酵成品各检测指标的结果
检测项目 含量
小肽(％) 16.16
总酸(％) 2.99
pH 4.54
实施例2：
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌的活化培养，具体操作同实施例1；
(2)配制厌氧发酵培养基：各组分重量百分含量分别为：豆渣50％；豆粕42.5％；次粉7.5％：混合均匀，得到厌氧发酵培养基；
(3)将步骤(1)活化培养后的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、副干酪乳杆菌种子液和乳双歧杆菌发酵种子液接种到发酵培养基，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的接种量均为发酵培养基重量的1.5％，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌总数均为1.3×109cfu/mL，副干酪乳杆菌接种量为发酵培养基重量的1.5％，活菌总数为1.6×109cfu/mL，乳双歧杆菌接种量为发酵培养基重量的3％，活菌总数为1.9×109cfu/mL，混合均匀，调整含水量为50％，得到厌氧发酵混合物；置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵，发酵温度为33℃，发酵15天后获得成品。
(4)乳双歧杆菌菌量测定：具体操作同实施例1。
具体结果见图4，图中B.lactis为乳双歧杆菌；通过检测结果可知，本发明所获的成品中，乳双歧杆菌菌量为5.85×107cfu/g；发酵1天乳双歧杆菌菌量达到最大值，为5.76×108cfu/g，是发酵前菌量的11倍。
表2是实施例2的发酵成品各检测指标的结果
检测项目 含量
小肽(％) 20.06
总酸(％) 4.86
pH 4.13
实施例3：
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌的活化培养，具体操作同实施例1；
(2)配制厌氧发酵培养基：各组分重量百分含量分别为：豆渣48％；豆粕37％；次粉15％：混合均匀，得到厌氧发酵培养基；
(3)将步骤(1)活化培养后的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、凝结芽孢杆菌发酵种子液、副干酪乳杆菌种子液和乳双歧发酵种子液接种到发酵培养基，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的接种量均为发酵培养基重量的3％，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌总数均为2.1×109cfu/mL，凝结芽孢杆菌接种量为发酵培养基重量的5％，活菌总数为4.2×109cfu/mL，副干酪乳杆菌接种量为发酵培养基重量的2％，活菌总数为1.9×109cfu/mL，乳双歧杆菌接种量为发酵培养基重量的3.5％，活菌总数为2.5×109cfu/mL，混合均匀，调整含水量为58％，得到厌氧发酵混合物；置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵，发酵温度为35℃，发酵30天后获得成品，并检测各项指标验证饲料品质。
(4)乳双歧杆菌菌量测定：具体操作同实施例1。
具体结果见图5，图中B.lactis为乳双歧杆菌；通过检测结果可知，本发明所获的成品中，乳双歧杆菌菌量为6.04×107cfu/g；发酵10天乳双歧杆菌菌量达到最大值，为4.94×108cfu/g，是发酵前菌量的6.1倍。
表3是实施例3的发酵成品各检测指标的结果
检测项目 含量
小肽(％) 22.65
总酸(％) 4.55
pH 4.34
表1-3是发酵成品各检测指标的结果，其中所测小肽含量指的是小肽占所测样品中粗蛋白含量的比例；测得的物质包括小肽、寡肽以及少量多肽和游离氨基酸等；结果显示，本发明采用混菌固态发酵，发酵彻底，产物丰富，小肽含量高。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，制备步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基中进行活化培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液；
(2)将豆粕、豆渣和次粉混合均匀，得到厌氧发酵培养基：
(3)接种步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液分别加入步骤(2)得到的厌氧发酵培养基中，混合均匀，得到厌氧发酵混合物，调整发酵温度以及培养基含水量，在密封条件下进行厌氧发酵，厌氧发酵后获得成品，即为富含乳双歧杆菌发酵饲料；
(4)制作乳双歧杆菌标准曲线:将乳双歧杆菌基因组DNA用乳双歧杆菌特异性引物进行PCR扩增，获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×102～1×109拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR反应，记录荧光定量PCR反应过程中产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数，即为Ct值；将测得的标准品DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成标准曲线；
其中拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；
(5)取步骤(3)制备的一定量饲料样品，提取DNA进行qPCR检测，得到Ct值，根据步骤(4)所得标准曲线计算乳双歧杆菌数量。
2.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(1)所述乳酸菌为凝结芽孢杆菌、副干酪乳杆菌或乳双歧杆菌的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(2)中所述厌氧发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：
豆粕37％～52.5％；
豆渣40％～55.5％；
次粉7.5％～19.5％。
4.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌种子液和酿酒酵母种子液的接种量均为厌氧发酵培养基重量的1％～3％；所述枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液的活菌总数均为1.0×108～2.1×109cfu/mL。
5.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述乳双歧杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的2％～4％，所述乳双歧杆菌种子液的活菌总数为1.3×108～2.7×109cfu/mL。
6.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述乳酸菌种子液包括凝结芽孢杆菌种子液、副干酪乳杆菌种子液的一种或多种；凝结芽孢杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的4％～6％，所述凝结芽孢杆菌种子液的活菌总数为2.5×108～5.3×109cfu/mL；副干酪乳杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的1％～4％，所述副干酪乳杆菌种子液的活菌总数为1.1×108～3.7×109cfu/mL。
7.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵的温度为25～38℃，时间为5～30天；所述调整培养基的含水量为40％～60％。
8.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(4)中所述乳双歧杆菌特异性引物是以细菌延展因子蛋白的编码基因tuf作为目标基因，上游引物F:TCACGACAAGTGGGTTGCCA，下游引物R:GTTGATCGGCAGCTTGCCG，扩增片段大小为178bp；所述取乳双歧杆菌DNA提取方法为：取乳双歧杆菌发酵种子液1mL，12000rpm离心2分钟，弃上清，加入60μL TE Buffer，100℃煮沸2分钟，冷却后8000rpm离心1分钟，吸取上清液，得到乳双歧杆菌基因组DNA。
9.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(5)所述发酵饲料DNA提取方法为：称取1g发酵饲料，加入10mL PBS缓冲液，振荡20分钟后用8层纱布过滤，取1mL滤液，12000rpm离心2分钟，弃上清，加入60μL TE Buffer，100℃煮沸2分钟，冷却后8000rpm离心1分钟，吸取上清液，得到饲料样品DNA模板；
所述qPCR反应体系为SYBR Green Premix Ex Taq 10μL，Rox Reference Dye 0.4μL，上、下游引物各0.8μL，DNA模板2μL，ddH2O 6μL；所述qPCR反应条件：95℃预变性30s，扩增95℃5s、60℃30s共40个循环。
10.根据权利要求1～9任一所述方法生产的富含乳双歧杆菌发酵饲料。
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