CN109971675B - 一株植物乳杆菌scuec6菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株植物乳杆菌SCUEC6菌株，该菌株的保藏编号为CCTCC NO.M2018722。本发明还提供了所述植物乳杆菌SCUEC6菌株在秸秆发酵饲料中的应用，该植物乳杆菌SCUEC6菌株具有极强的产酸能力和耐酸能力，能够加速饲料的发酵；且能促进地衣芽孢杆菌生长，与地衣芽孢杆菌形成很好的促进生长的关系，能极大地提高发酵饲料的品质。此外，本申请人还发现该植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环具有舒张作用，则该植物乳杆菌SCUEC6菌株可在制备气管平滑肌舒张药物中进行应用。

Description

一株植物乳杆菌SCUEC6菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株植物乳杆菌SCUEC6菌株及其应用。

背景技术

乳酸菌是指发酵糖类产生乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。目前至少可分为18个属，共有200多种。通常寄居在人或动物的口腔和肠道中，能够增强机体免疫力，发挥抗突变和抗癌作用，并防止一些胃肠道疾病的发生。乳酸菌中属于乳杆菌属的有50多个不同的种，其中，存在于人或动物肠道且用于传统以及工业发酵食品中的主要乳杆菌种有：卷曲乳杆菌、格式乳杆菌和植物乳杆菌。

植物乳杆菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，最适生长温度为30～35℃，厌氧或兼性厌氧，菌种为杆状，单个、有时成对或成链状。最适pH 6.5左右，属于同型乳酸发酵乳酸菌。植物乳杆菌与人类和动物的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌，能通过胃定植于肠道发挥有益作用。它对肠道微生物有重要影响，无论在食品发酵，还是在工业乳酸发酵以及医疗保健等领域，都有着广泛的应用。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种在土壤中常见的革兰氏阳性细菌。地衣芽孢杆菌是我国农业部2003年318号公告批准使用的饲料级菌株之一。与传统的益生菌、双歧杆菌和乳酸菌相比，地衣芽孢杆菌的活菌成分是芽孢休眠体，并具有耐高温、耐干燥、耐胆盐和人工胃液等特点。地衣芽孢杆菌在医药和畜牧养殖方面具有较高的应用价值。具有调节动物微生态平衡，促进肠道有益菌的生长，降低病原菌的数量，增加动物机体的抗病力，提高机体的免疫功能。

现有的乳酸菌用于发酵饲料时存在以下缺点：(1)由于一般的乳酸菌的产酸能力和耐酸能力低，发酵速率较慢；(2)现有文件中还未有乳酸菌促进地衣芽孢杆菌生长的相关报道，若能筛选到一株植物乳杆菌能促进地衣芽孢杆菌生长，该植物乳杆菌能与地衣芽孢杆菌形成很好的促进生长的关系，则能极大地提高发酵饲料的品质。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一株植物乳杆菌SCUEC6菌株及其应用。该株植物乳杆菌SCUEC6菌株具有极强的产酸能力和耐酸能力，能够加速饲料的发酵；且能促进地衣芽孢杆菌生长，与地衣芽孢杆菌形成很好的促进生长的关系，能极大地提高发酵饲料的品质。此外，本申请人还意外发现该株植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环具有舒张作用，则该株植物乳杆菌SCUEC6菌株可在制备气管平滑肌舒张药物中进行应用。

本发明的目的之一在于提供一株植物乳杆菌SCUEC6菌株，该菌株的分类学命名为：植物乳杆菌SCUEC6菌株(Lactobacillus plantarum SCUEC6 Strain)，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)NO.M2018722。本发明人从刚被宰杀的健康牛的瘤胃中筛选到一株微生物，发现该菌株具有极强的产酸能力和耐酸能力，该细菌经菌落形态、生化及16S rRNA测序分析鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其菌落形态见实施例1，命名为植物乳杆菌SCUEC6菌株。

本发明的目的之二在于提供所述的植物乳杆菌SCUEC6菌株在秸秆发酵饲料中的应用。将所述植物乳杆菌SCUEC6菌株制备的菌液以1×10⁹cfu/g～1×10¹¹cfu/g的接种量接种到秸秆饲料(并添加相应辅料)中，通过秸秆饲料发酵机处理，采用包装机密封包装后储藏。该株植物乳杆菌SCUEC6菌株具有极强的产酸能力和耐酸能力，能够加速秸秆饲料的发酵。

本发明的目的之三在于提供植物乳杆菌SCUEC6菌株在促进地衣芽孢杆生长中的应用。本申请人还发现植物乳杆菌SCUEC6菌株能促进地衣芽孢杆菌生长，利用此特性，采用植物乳杆菌SCUEC6菌株制备发酵饲料，能极大地提高发酵饲料的品质。

本发明的目的之四在于提供植物乳杆菌SCUEC6菌株在制备气管平滑肌舒张药物中的应用。本申请人还发现该株植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵发酵液具有舒张气管的作用，因而可以用于制备气管平滑肌舒张药物。

本发明的目的之五在于提供一种菌剂，包括液体菌剂或干粉菌剂，所述液体菌剂为将所述的植物乳杆菌SCUEC6菌株进行发酵获得的发酵液，所述干粉菌剂为将所述发酵液经喷雾干燥获得。

本发明的有益效果是：

1、本发明所筛选得到的植物乳杆菌SCUEC6菌株具有较高的产酸能力和耐酸能力，能够加速饲料的发酵；且能促进地衣芽孢杆菌生长，极大地提高发酵饲料的品质；将所述一株植物乳杆菌SCUEC6菌株进行发酵获得的发酵液或该发酵液经喷雾干燥获得的干粉菌剂用于各种饲料的发酵，能够加速饲料的发酵，促进地衣芽孢杆菌生长，极大地提高发酵饲料的品质。

2、本发明所筛选得到的植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵液具有舒张气管的作用，因而可以用于制备气管平滑肌舒张药物。

其中，本发明的菌株的保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CCTCCNO.M2018722。其分类命名为植物乳杆菌SCUEC6菌株(Lactobacillus plantarum SCUEC6Strain)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

附图说明

图1为本发明提供的植物乳杆菌SCUEC6菌株在平板中菌落形态图；

图2为本发明提供的基于16S rRNA基因序列的植物乳杆菌SCUEC6菌株系统发育树；

图3为植物乳杆菌SCUEC6菌株12h和24h培养物的上清液和菌悬液促进地衣芽孢杆菌生长圈图；其中A：24h菌悬液50uL；B：24h上清液50uL；C：12h上清液50uL；D：12h菌悬液50uL。

具体实施方式

实施例1植物乳杆菌SCUEC6菌株的定向富集分离与鉴定

1、SCUEC6菌株的定向富集分离

从刚被宰杀的健康牛的瘤胃中无菌采集样品，称取10g瘤胃样品，加入90mL pH4.0的植物乳杆菌液体培养基(LPB)，37℃富集培养12小时，用无菌水10倍梯度逐级稀释(10^-1～10^-5)，取200μL均匀涂布于含0.5％CaCO₃植物乳杆菌固体培养基(LPA)平板中，37℃厌氧培养48h，挑取融钙圈较大的菌落，再多次划线分离纯化，筛选到多株融钙圈较大的微生物。其中，SCUEC6菌株12h培养物上清液融钙圈直径为29mm。表明SCUEC6菌株具有较强的产酸特性。

2、SCUEC6菌株的鉴定

SCUEC6菌株显微观察和生理生化实验结果表明：SCUEC6菌株革兰氏染色阳性，在植物乳杆菌固体培养基(LPA)平板上菌落呈乳白色、圆形、边缘整齐(如图1所示)；过氧化氢酶实验阴性，含嗅甲酚紫平板上菌落颜色为黄色，初步鉴定为乳酸菌。

进一步提取菌株的总DNA，以菌株的总DNA为模板，PCR扩增16SrRNA基因，扩增产物进行测序，测序结果通过NCBI在线进行BLAST比对构建系统发育树(图2所示)。SCUEC6菌株的16SrDNA序列长度为1471bp(如序列表SEQ ID NO1所示)。序列同源性分析表明，SCUEC6菌株与植物乳杆菌属(Lactobacillus plantarum)多个的菌株同源性均在96％以上，结合生理生化特性，初步确定SCUEC6菌株为植物乳杆菌属，并命名为植物乳杆菌SCUEC6菌株。

实施2：植物乳杆菌SCUEC6菌株的产酸能力和耐酸能力测定

1、植物乳杆菌SCUEC6菌株的产酸能力

植物乳杆菌SCUEC6菌株和植物乳杆菌ATCC 80149菌株(对照菌株)分别同时在pH为6.5的植物乳杆菌液体培养基(LPB)液中，37℃培养，结果如表1所示。

表1-不同培养时间不同菌株的生长状况和培养基pH值的变化

注：表1中ATCC 80149菌株为植物乳杆菌ATCC 80149菌株，作为对照菌株；SCUEC6菌株为植物乳杆菌SCUEC6菌株。

由表1可知，植物乳杆菌ATCC 80149菌株(对照菌株)培养24h，pH值由6.511降低到4.216，OD₆₀₀达到2.354；而植物乳杆菌SCUEC6菌株培养24h，pH值由6.511降低到3.012，OD₆₀₀达到3.816。表明：与对照菌株相比，植物乳杆菌SCUEC6菌株具有产酸能力强、产酸速度快、生长速度快等特点。在24h培养时间内，pH值由6.511降低到3.012的乳酸菌未见文献报道。

2、植物乳杆菌SCUEC6菌株的耐酸能力

植物乳杆菌SCUEC6菌株在不同pH值的植物乳杆菌液体培养基(LPB)液中，37℃培养。结果如表2所示，植物乳杆菌SCUEC6菌株培养24h，在初始pH值1-7的范围内，植物乳杆菌SCUEC6菌株的生长随pH值增加生长速度加快。在初始pH值1-3的范围内，植物乳杆菌SCUEC6菌株的生长缓慢，培养后培养基pH值增加；在初始pH值4-7的范围内，植物乳杆菌SCUEC6菌株的生长较快，培养后培养基pH值降低。在pH值为1-3的液体培养基中具有生长能力的植物乳杆菌未见文献报道。植物乳杆菌ATCC 80149菌株(对照菌株)在pH值为1-3的液体培养基中基本不生长。

表2-不同pH值培养基中植物乳杆菌SCUEC6菌株的生长状况和培养基pH值的变化

实施例3：植物乳杆菌SCUEC6菌株的抑菌活性测定

以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为指示菌，植物乳杆菌SCUEC6菌株培养液进行12000r/min离心10min，用5μL植物乳杆菌SCUEC6菌株12h培养物的上清液进行抑菌实验，结果如表3所示：大肠杆菌抑菌圈直径为22.5mm，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为18.4mm，沙门氏菌抑菌圈直径为14.2mm，表明植物乳杆菌SCUEC6菌株培养物的上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等病原菌具有一定的抑菌效果。

表3-植物乳杆菌SCUEC6菌株培养物的上清液对三种致病菌抑菌效果

注：牛津杯的外径为8mm。

实施例4：植物乳杆菌SCUEC6菌株促进地衣芽孢杆菌的生长

1、以地衣芽孢杆菌为指示菌，在牛津杯中分别加入5μL植物乳杆菌SCUEC6菌株12h培养物的上清液、植物乳杆菌SCUEC6菌株12h培养物菌悬液、植物乳杆菌SCUEC6菌株24h培养物的上清液、植物乳杆菌SCUEC6菌株24h培养物菌悬液进行实验，结果如图3所示：5μL植物乳杆菌SCUEC6菌株24h培养物的上清液和菌悬液促进地衣芽孢杆菌生长圈直径分别为20.5mm和21.3mm，5μL植物乳杆菌SCUEC6菌株12h培养物的上清液和菌悬液促进地衣芽孢杆菌生长圈直径分别为18.3mm和19.2mm。表明植物乳杆菌SCUEC6菌株培养物的上清液和菌液对地衣芽孢杆菌生长有促进作用。

2、在50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，添加不同体积的培养12h的植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液的上清液，地衣芽孢杆菌培养12h的生长状况如表4所示，添加植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液的上清液与不添加上清液相比，地衣芽孢杆菌生长明显加快。在50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，添加1250μL植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液的上清液，地衣芽孢杆菌OD₆₀₀是未添加的2.16倍；添加2500μL植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液的上清液，地衣芽孢杆菌OD₆₀₀是未添加的2.33倍。表明植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液的上清液具有促进地衣芽孢杆生长的特性，在文献中未见报道。

表4-添加不同体积的植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液的上清液对地衣芽孢杆菌生长的影响

实施例5：植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环的舒张作用

取8～10周龄SPF级BALB/c小鼠15只，购于湖北省实验动物中心。静脉注射戊巴比妥钠150mg/kg处死小鼠，剪下气管，去除附着组织，剪成3～4mm长的气管环。将气管环套入张力换能器的三角形挂钩中，挂钩上端连接张力换能器，下端固定于氧气出口上方的挂钩上，浸泡于通氧的37℃的PSS灌流槽中。将气管环前负荷设置为0.3g。每15min更换高钙液(PSS)一次，共换液4次，完成预平衡。用100μmol/L乙酰胆碱(Ach)对气管环进行预刺激，待张力达到平台期后，以PSS洗脱起乙酰胆碱(Ach)，等气管环张力达到基线，完成1次预刺激。预刺激3次后开始正式实验。

气管环经平衡和预刺激后，向灌流槽中加入100μmol/L乙酰胆碱(Ach)，刺激气管环使其收缩达到最大值，并进入平台期，读取张力换能器显示的肌张力数值。然后分别加入60μL、120μL、180μL培养12h的植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵上清液和发酵液舒张气管环。待舒张作用达到稳定后，读取肌张力数值。结果如表5所示，植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵上清液和发酵液对舒张气管环有一定作用，植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液效果好于发酵上清液，180μL培养12h的植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵液舒张气管环效果较好，舒张比率达到52.7％。

表5-植物乳杆菌SCUEC6菌株发酵上清液和发酵液对乙酰胆碱(Ach)预收缩的气管环的舒张作用

应用例：植物乳杆菌SCUEC6菌株在饲料发酵中的应用

1、植物乳杆菌SCUEC6菌株的活化

将斜面保存的所述植物乳杆菌SCUEC6菌株活化，接种于植物乳杆菌液固体培养基(LPA)上，在30℃条件下恒温培养24h；挑取活化培养基上的菌种，接种于植物乳杆菌液体体培养基(LPB)基中，培养温度为30℃，培养36h，获得发酵液。或进一步经喷雾干燥获得干粉菌剂，其喷雾干燥优选工艺条件为：进风温度160℃，物料浓度15％，进料速度20mL/min，使其含植物乳杆菌SCUEC6菌株活菌数在1×10⁹cfu/g～1×10¹¹cfu/g。

其中，所述活化培养基为植物乳杆菌液体体培养基(LPB)：大豆蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g，乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.58g，硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.25g，蒸馏水定容至1000mL，pH 6.2～6.6；所述植物乳杆菌固体培养基(LPA)为在所述植物乳杆菌液体体培养基组分的基础上加琼脂20g。

2、植物乳杆菌SCUEC6菌株用于发酵饲料

(1)分组：分为实验组、对照组1和对照组2。

实验组：植物乳杆菌在发酵秸秆饲料中的使用方法为，秸秆粉碎添加相应辅料后置于秸秆饲料发酵机中，在75℃～80℃下灭菌2小时，以千分之三的接种量接种植物乳杆菌SCUEC6菌株菌液或菌粉(即一吨的秸秆加3公斤所述干粉菌剂或3升植物乳杆菌SCUEC6菌株菌液)，并接种活菌数在1×10⁷cfu/g～1×10⁹cfu/g的地衣芽孢杆菌，含水量在40％左右，用封口机密封包装。

对照组1：将所述植物乳杆菌SCUEC6菌株替换为等量的植物乳杆菌ATCC 80149菌株，其余步骤同实验组；

对照组2：不接种所述植物乳杆菌SCUEC6菌株，只接种活菌数在1×10⁷cfu/g～1×10⁹cfu/g的地衣芽孢杆菌，其余步骤同实验组；

(2)微生物数量和pH值检测：饲料在发酵期间，分别于0d，1d，3d，6d和10d取样测定实验组和对照组1的pH，实验组中植物乳杆菌SCUEC6菌株的活菌数、以及对照组1中植物乳杆菌ATCC 80149菌株的活菌数，结果如表2所示。

表6-不同发酵时间的秸秆饲料中的微生物数量和pH值动态变化

注：表6中ATCC 80149菌株为植物乳杆菌ATCC 80149菌株，作为对照菌株；SCUEC6菌株为植物乳杆菌SCUEC6菌株。

由表6可知，添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料(实验组)与加植物乳杆菌ATCC 80149菌株的发酵饲料(对照组1)相比，pH值持续降低，实验组在发酵培养1d，pH值由6.51降低到5.12，呈现明显的下降趋势；在发酵10d时pH值达到3.81，植物乳杆菌的数量为10.58log CFU/g。而对照组发酵10d时pH值为4.52，植物乳杆菌的数量为9.12log CFU/g。添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料比添加植物乳杆菌ATCC 80149菌株的发酵饲料(对照组1)pH值低，表明添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料pH值下降较快。而发酵饲料中植物乳杆菌SCUEC6菌株数量高于对照菌株，表明发酵饲料中植物乳杆菌SCUEC6菌株生长速度较高。

综上所述，本发明所筛选得到的植物乳杆SCUEC6菌株具有较高的产酸能力、耐酸能力、生长速度等特点，能够加速饲料的发酵。

(3)地衣芽孢杆菌的活菌数的测定：测定添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料(实验组)和不添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料(对照组2)中地衣芽孢杆菌的活菌数，结果如表7所示。

表7-秸秆发酵饲料中植物乳杆SCUEC6菌株对地衣芽孢杆菌的促进生长作用

由表7可知，发酵3天，添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料中地衣芽孢杆菌数量为9.12log CFU/g，不添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料中地衣芽孢杆菌数量为7.66log CFU/g，添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料(实验组)与不添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料(对照组2)相比，地衣芽孢杆菌生长速率加快，表明本发明的植物乳杆菌SCUEC6菌株能促进地衣芽孢杆菌生长，极大地提高发酵饲料的品质。

(4)发酵饲料营养成分和微生物检测：检测添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料(实验组)与加植物乳杆菌ATCC 80149菌株的发酵饲料(对照组1)的营养成分和微生物，结果如表8所示。

表8-发酵饲料营养成分和微生物检测结果

由表8可知，添加植物乳杆菌SCUEC6菌株的发酵饲料(实验组)与加植物乳杆菌ATCC 80149菌株的发酵饲料(对照组1)相比，发酵饲料的粗蛋白含量增加17.1％，纤维含量降低15％以上。

以上所述仅为本发明的一个实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南碧野生物科技有限公司

<120> 一株植物乳杆菌SCUEC6菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1471

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 1

tgttcgactt cccctaatca tctgtcccac cttaggcggc tggttcctaa aaggttaccc 60

caccgacttt gggtgttaca aactctcatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg 120

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Claims (5)

1.一株植物乳杆菌SCUEC6菌株，其特征在于，该植物乳杆菌SCUEC6菌株的保藏编号为：CCTCC NO.M2018722。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌SCUEC6菌株在秸秆发酵饲料中的应用。

3.如权利要求1所述的植物乳杆菌SCUEC6菌株在促进地衣芽孢杆生长中的应用。

4.如权利要求1所述的植物乳杆菌SCUEC6菌株在制备小鼠乙酰胆碱预收缩气管环舒张药物中的应用。

5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括将如权利要求1所述的植物乳杆菌SCUEC6菌株进行发酵获得的发酵液，或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。