CN116240123A - 一株多粘类芽孢杆菌、其微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一株多粘类芽孢杆菌、其微生态制剂及其制备方法，该多粘类芽孢杆菌于2022年6月23日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022950，分类命名为多粘类芽孢杆菌S3，拉丁学名Paenibacillus polymyxa S3。本发明还包括了所述多粘类芽孢杆菌的应用、所述多粘类芽孢杆菌制成的微生态制剂，以及所述微生态制剂的制备方法。本发明多粘类芽孢杆菌S3对嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌等11种淡水鱼类病原菌的抑菌效果良好；能够在鱼体内生存、定殖，并且对鱼类没有伤害；能够促进鱼体生长，增强鱼体免疫力，增强鱼体对病原菌的抵抗力。

Description

一株多粘类芽孢杆菌、其微生态制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一株多粘类芽孢杆菌，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌、其微生态制剂及其制备方法。
背景技术
淡水鱼是人类优质的蛋白质来源。近几十年来，由于对淡水鱼的需求不断增加，淡水鱼养殖规模逐渐扩大。高密度、高投饵量的饲养模式在淡水鱼类养殖业中被广泛应用。虽然这种模式效益高、产量多，但同时也增加了爆发细菌性病害的风险。鱼类病原菌具有繁殖快、毒力强的特点，生活在同一水域的鱼类极易感染死亡。病原菌随着水体的扩散而容易传播，根治难度极大。目前，主要通过抗生素来防治鱼类细菌性病害。而频繁使用抗生素容易出现耐药菌，还会使鱼类肠道菌群失调，导致产品质量下降。抗生素通常残留在水环境中，最终进入人体，对人类健康造成不良影响。因此，寻找可以替代抗生素治疗的产品非常重要。
益生菌能在动物中定殖，促进动物的生长，增强动物的免疫力和抗病能力。益生菌使用方法简单，对人畜无害，并且对环境友好，其基因库中存在着许多表达天然活性物质的基因簇，具有非常重要的研究价值，有望通过益生菌解决了抗生素应用时的缺点。
然而,目前在水产养殖中能起到较好效果的益生菌种类少，抗菌谱较窄，使用范围受限，有必要更进一步作深入研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株抗菌谱宽的多粘类芽孢杆菌、其微生态制剂及其制备方法；所述多粘类芽孢杆菌 S3对多种鱼类致病菌具有较好的拮抗作用，可作为益生菌使用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一株多粘类芽孢杆菌，其分类命名为多粘类芽孢杆菌S3，拉丁文学名为Paenibacillus polymyxa S3，于2022 年6月23日被保藏于中国典型培养物保藏中心(简称“CCTCC”)，保藏编号为 CCTCC NO：M 2022950。
本发明之多粘类芽孢杆菌S3的16S rRNA基因序列如序列表SEQ ID №1所示。本发明多粘类芽孢杆菌S3自湖南长沙地区的鱼塘底泥中筛选得到。
本发明多粘类芽孢杆菌的应用，作为鱼类致病菌拮抗菌兼益生菌。
本发明多粘类芽孢杆菌，可制成微生态制剂使用。
优选地，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。液体制剂使用方便，固体制剂便于长期保存。
优选地，所述微生态制剂用于水产养殖。
优选地，所述水产养殖的动物为淡水鱼。
本发明微生态制剂的制备方法，包括下列步骤：
(1)接种活化：将多粘类芽孢杆菌S3接种于平板固体培养基上，随后挑取单菌落于种子培养基中，活化培养，得种子液；
(2)第一次扩大培养：将步骤(1)所得的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行第一次扩大培养，得扩大培养液I；
(3)第二次扩大培养：将步骤(2)所得的扩大培养液I接种到装有发酵培养基的发酵罐中，再次进行培养，得扩大培养液II；
(4)浓缩收集：将步骤(3)所得的扩大培养液II进行浓缩，得液体制剂；
固体制剂是通过将所述液体制剂或扩大培养液II喷雾干燥所得。
优选地，步骤(1)中，所述种子培养基为TSB液体培养基。
优选地，步骤(1)中，活化培养条件为：温度28～30℃，装液量为容器体积的10～30％，摇床转速180～200rpm。
优选地，步骤(2)中，所述种子液接种到发酵罐中的接种量是培养基体积的1～2％。
优选地，步骤(2)中，第一次扩大培养所用发酵培养基的溶剂为水，配方为：葡萄糖5～12g/L，胰蛋白胨7～15g/L，大豆蛋白胨3～6g/L，酵母提取物5-10 g/L，MgSO4.7H2O 1～3g，NaCl 2～5g/L。
优选地，步骤(2)中，所述第一次扩大培养的溶氧量35～55％。
优选地，步骤(2)中，所述第一次扩大培养的温度28～30℃。
优选地，步骤(2)中，所述第一次扩大培养的时间为22-26h。
优选地，步骤(2)中，培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。
优选地，步骤(3)中，所述扩大培养液I的接种量是培养基体积的10～15％。
优选地，步骤(3)中，所述发酵培养基的溶剂为水，配方为葡萄糖5～12g/L，胰蛋白胨7～15g/L，大豆蛋白胨3～6g/L，酵母提取物5～10g/L，MgSO4.7H2O 1～3g，NaCl 2～5g/L。
优选地，步骤(3)中，所述培养的溶氧量35～55％。
优选地，步骤(3)中，所述培养的温度28～30℃。
优选地，步骤(3)中，所述培养的时间为24～48h。
优选地，步骤(3)中，培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。
本发明之微生态制剂能抑制嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌等11种鱼类病原菌的生长，菌株发酵液中的抑菌活性物质的理化性质对高温、强酸强碱、紫外光及蛋白酶均不敏感。通过微生态制剂，可简洁方便地将多粘类芽孢杆菌S3添加到需要使用的环境中，如将微生态制剂掺入饲料或加入水体环境中等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明多粘类芽孢杆菌S3抗菌谱宽，对主要鱼类病原菌嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、异常嗜糖气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、欧文氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、厦门希瓦氏菌、类志贺邻单胞菌等11种淡水鱼类病原菌均具有显著抑菌效果；
(2)本发明多粘类芽孢杆菌S3能够在鱼体内生存、定殖，并且对鱼类没有伤害，使用安全，有效期长；
(3)将本发明多粘类芽孢杆菌S3作为饲料添加剂添和水体益生菌补充剂分别通过饲喂和浸泡的方式处理草鱼，发现能够明显加快鱼体生长速度，增强鱼体免疫力，增强鱼体对病原菌的抵抗力；
(4)将多粘类芽孢杆菌S3通过发酵制备成微生态制剂的方法较为简便，生产成本较低，同时还能有效降低抗生素滥用所导致的药物残留、致病菌耐药等风险，具有良好的应用前景。
微生物保藏情况说明
本发明之多粘类芽孢杆菌，分类命名为：多粘类芽孢杆菌S3，拉丁文学名：Paenibacillus polymyxa S3，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心 (简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学)，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2022950。
附图说明
图1是本发明多粘类芽孢杆菌S3对鱼类病原菌的抑菌效果图。
图2是本发明多粘类芽孢杆菌S3形态学特征观察图。
图3是本发明多粘类芽孢杆菌S3的16S rRNA基因序列构建系统发育树图。
图4是本发明多粘类芽孢杆菌S3抑菌活性物质与温度影响的分析图。
图5是本发明多粘类芽孢杆菌S3抑菌活性物质与pH影响的分析图。
图6是本发明多粘类芽孢杆菌S3抑菌活性物质与紫外照射影响的分析图。
图7是本发明多粘类芽孢杆菌S3抑菌活性物质与蛋白酶影响的分析图。
图8是小动物活体成像系统观察本发明多粘类芽孢杆菌S3绿色荧光标记菌株在草鱼体内的定殖分布图。
图9是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼肌肉中抑制肌肉生长的相关基因MSTN和促进肌肉生长的相关基因IGF表达的影响分析结果图；图中*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。
图10是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼血清酸性磷酸酶酶活的影响分析结果图；图中*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。
图11是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼血清碱性磷酸酶酶活的影响分析结果图；图中*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。
图12是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼过氧化氢酶酶活的影响分析结果图；图中*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。
图13是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼血清谷胱甘肽过氧化酶酶活的影响分析结果图；图中*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P ＜0.001。
图14是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼肝脏中免疫相关基因表达的影响分析结果图；图中*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P ＜0.001。
图15是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼肾脏中免疫相关基因表达的影响分析结果图；图中*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P ＜0.001。
图16是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼脾脏中免疫相关基因表达的影响分析结果图；图中*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P ＜0.001。
图17是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼肠道肾脏中免疫相关基因表达的影响分析结果图；图中*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。
图18是本发明多粘类芽孢杆菌S3制备的微生态制剂对草鱼保护力分析结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
(一)多粘类芽孢杆菌S3的筛选以及抑菌谱的测定试验
用无菌水将取自湖南长沙的鱼塘底泥样品以10倍梯度稀释法进行稀释，充分震荡均匀后，吸取100微升稀释至10-1、10-2、10-3、10-4的土壤样品混悬液至 LB平板中央，涂布均匀后，将平板放至培养箱直至出现明显菌落。挑取单克隆纯化两次，接种于发酵培养基中，30℃，180转/分发酵24小时。以主要鱼类病原菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、异常嗜糖气单胞菌(Aeromonasallosaccharophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、欧文氏菌(Erwinia spp.)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloide)为指示菌，使用打孔法法检测候选益生菌的发酵上清液对上述病原菌的抑菌活性(参见图1)，发现本发明者筛选所得多粘类芽孢杆菌对以上11种鱼类病原菌具有良好抑菌效果，抑菌圈直径均在 16毫米以上，其中最大抑菌圈直径达到了19毫米，推定这是一株新型多粘类芽孢杆菌，命名为多粘类芽孢杆菌S3
(二)多粘类芽孢杆菌S3的形态学特征
菌株CSM平板上菌落呈湿润、不透明、中间凸起、黏稠、边缘不规则状，菌落易挑起。菌株为革兰氏阳性菌。在扫描电子显微镜下观察到菌株S3的显微结构呈均一的杆状(参见图2)。菌株S3所表现出的形态学特征与芽孢杆菌相符合。
(三)多粘类芽孢杆菌S3的16S rRNA基因鉴定
将菌株S3接种至CSM培养基中，30℃，180转/分培养24小时，收集菌体，使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司) 提取该菌的基因组DNA，利用16S rRNA基因扩增引物。
27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。
以上述引物扩增16S rRNA基因序列，序列预期长度约1500bp。
PCR反应体系(20μL)：无菌双蒸水，14微升；10×Buffer，2微升；dNTP， 1.6微升；Bf-R(10微摩尔/升)，0.6微升；Bf-F(10微摩尔/升)，0.6微升；基因组模板，1微升；PrimerSTAR DNA Polymerase(Takara)，0.2微升；
PCR反应程序：95℃预变性5分钟；30个循环：95℃，45秒；55℃，45sec； 72℃，1.5分钟；72℃，10分钟。
16S rRNA基因PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，将扩增成功的产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。
菌株S3的16S rRNA基因序列经测序显示长度为1476bp，扩增测序结果在 NCBI上经过BLAST比对分析，于软件MEGA 7.0.26采用邻接法构建该菌株的系统发育树(参见图3)。发现该菌与Paenibacillus polymyxa WY110同源性最高。
(四)多粘类芽孢杆菌S3抑菌活性物质的理化性质分析
(1)热稳定性
收集菌株S3发酵15小时的无菌上清液，分别在40℃、60℃、80℃、100℃、 120℃下处理30分钟，处理结束后放置室温，以不做处理的作为对照，检测不同温度处理下发酵液的抑菌活性。每个处理重复3次(测试结果参见图4)。
(2)酸碱耐受性
收集菌株S3发酵15小时时的无菌上清液，分别将其pH调至1、3、5、7、 9、11并维持1小时，随后调回原始pH(7.2±0.2)，以不做处理的作为对照，通过打孔法检测不同pH处理下发酵液的抑菌活性。每个处理重复3次(测试结果参见图5)。
(3)紫外光耐受性
收集菌株S3发酵15小时时的无菌上清液，分别将其暴露在紫外灯下照射1 小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时，以不做处理的作为对照，通过打孔法检测不同紫外灯照射时长下发酵液的抑菌活性。每个处理重复3次(测试结果参见图6)。
(4)蛋白酶耐受性
收集菌株S3发酵15小时时的无菌上清液，每1毫升发酵液中加入20微升 20毫克/毫升蛋白酶K，在56℃下反应1小时，再加热至100℃维持10分钟灭活蛋白酶K，以不做处理的作为对照，通过打孔法检测经蛋白酶K处理下发酵液的抑菌活性。每个处理重复3次(测试结果参见图7)。
以上试验结果表明，菌株S3发酵液的抑菌活性不受环境温度、pH值、紫外光和蛋白酶变化/存在的影响。
(五)多粘类芽孢杆菌S3微生态制剂的制备
(1)接种活化：将多粘类芽孢杆菌S3菌保于LB固体平板上活化，随后挑取单克隆于发酵培养基中。活化培养的条件为：温度为30℃，装液量为容器体积的15％，摇床转速180转/分；
(2)第一次扩大培养：将步骤(1)所得的活化好的种子液按1％的接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行第一次扩大培养，得第一次扩大培养的种子液；发酵培养基配方为：为葡萄糖10克/升，胰蛋白胨10克/升，大豆蛋白胨 5克/升，酵母提取物7克/升，MgSO4.7H2O 2克/升，NaCl 3克/升；培养条件为：整个培养过程在线监控，溶氧浓度45％，温度30℃，培养24小时，实时在线补加消泡剂；
(3)第二次扩大培养：将步骤(2)所得的第一次扩大培养的种子液按10％的接种量接种到装有70％的发酵培养基的500升发酵罐中，得扩大培养液；发酵培养基配方同步骤(2)所述发酵培养基配方；培养条件为：溶氧浓度45％，温度30℃，培养48小时，实时在线补加消泡剂；
(4)浓缩收集：收集(3)所得的扩大培养液，进行浓缩，得微生态液体菌剂；或者再将微生态液体菌剂喷雾干燥，即得微生态固体制剂。
(六)多粘类芽孢杆菌S3在鱼类养殖中的应用
a.多粘类芽孢杆菌S3在草鱼体内的定殖分布情况
选取大小一致的健康草鱼，随机分为1个对照组和1个实验组，每组10尾，并设置重复。实验前首先饲喂7天，进行驯化使草鱼适应实验环境，实验中使用曝气48小时的水，水温控制在25℃左右，对照组的草鱼饲喂基础饲料，实验组的草鱼饲喂添加有浓度为1×108菌落形成单位/克(cfu/g)的绿色荧光基因标记菌株S3GFP的饲料，饲料投量为体重的2％，每日喂2次，利用小动物活体成像观察菌株S3GFP在草鱼体内的定殖分布情况(参见图8)，实验持续14天。结果显示，第4天时，草鱼的鳃部开始出现明显的荧光，腹部出现微弱的荧光，随后随着时间的延长，荧光信号在草鱼的鳃部和腹部逐渐增强。该试验表明菌株S3 能在草鱼的鳃部和腹部定殖，为菌株S3益生功能的发挥提供了基础。
b.多粘类芽孢杆菌S3对草鱼生长及抗病性的影响
选择体重体和长大小一致的草鱼幼苗，试验分为3组，每组60尾，每10 尾1个养殖箱。对照组饲喂普通饲料，饲喂组饲喂1×108cfu/g S3菌拌饲料，浸泡组在养殖水体中加入终浓度为1×105菌落形成单位/毫升(cfu/mL)菌株S3并饲喂普通饲料。饲料的投喂量为体重的2％左右，每日2次，实验持续30天。通过向饲料或水体中加入微生态制剂引入菌株S3。
(1)多粘类芽孢杆菌S3对草鱼生长性能的影响
试验鱼饲喂30天后，饥饿处理24小时，参照如下公式计算草鱼体重增长率(weight gain rate，WGR)、体重比生长率(specifific growth rate，SGR)和成活率(survival rate，SR)。WGR(％)＝100×[(Wt-W0)/W0]；SGR(％)＝100×(lnWt-lnW0)/ T；SR(％)＝试验结束鱼尾数/试验初始鱼尾数×100％。其中W0(g)表示试验草鱼的初体重，Wt(g)表示试验周期结束后的终体重，T表示生测试验周期。(参见表 1)。随后荧光定量PCR分析肌肉生长相关因子的表达水平，肌肉中抑制肌肉生长的相关基因MSTN表达量显著下调，促进肌肉生长的相关基因IGF表达量显著上调(参见图9)
表1草鱼生长性能参数
Figure RE-GDA0003797102280000081
注：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001
(2)多粘类芽孢杆菌S3对草鱼血清非特异性免疫指标的影响
试验30天后，取试验鱼的血清，测定其ACP、AKP、CAT和GSH-Px的酶活性。(参见图10-图13)与对照组草鱼相比，饲喂组和浸泡组草鱼的4种酶活性均显著提高，其中浸泡组草鱼的CAT活性极显著高于对照组，其活性为对照组的1.95倍；饲喂组和浸泡组草鱼的GSH-Px极显著高于对照组，分别为对照组的2.23倍和2.57倍。该试验结果表明菌株S3可以提高草鱼的非特异性免疫能力。
(3)多粘类芽孢杆菌S3对草鱼组织中免疫相关基因表达的影响
试验30天后，分析草鱼肝脏、肾脏、脾脏以及肠道中免疫相关基因的表达水平(参见图14-图17)。菌株S3饲喂组草鱼的肾脏Keap1、C3、LZM、IgM、 TLR-4、MyD-88的表达水平显著上调，菌株S3浸泡组草鱼肝脏中Keap1、C3、 LZM、IgM、TLR-4的表达水平显著上调，表明该菌能提高草鱼的抗免疫力。
(4)多粘类芽孢杆菌S3对草鱼的保护性试验
试验30天后，每组取40尾试验鱼。每尾注射200微升，1×106cfu/mL的Ah X040，连续观察15天。对照组草鱼攻毒后在第5天开始死亡，到第10天时全部死亡；饲喂组草鱼攻毒后，在第10天开始死亡，比对照组推迟5天，到第13天时草鱼的存活率为51％，并一直维持到试验结束；浸泡组草鱼攻毒后，在第9天开始死亡，比对照组推迟4天，到第13天时草鱼的存活率为58％，并一直维持到试验结束。攻毒试验表明，菌株S3可以提高草鱼在遭受嗜水气单胞菌感染时的存活率。(参见图18) 。

Claims (10)

1.一株多粘类芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为多粘类芽孢杆菌S3（Paenibacillus polymyxa S3），于2022年6月23日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022950。
2.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌的应用，其特征在于，作为鱼类致病菌拮抗菌。
3.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌制成的微生态制剂。
4.根据权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，为液体制剂或固体制剂；用于水产养殖。
5.根据权利要求4所述的微生态制剂，其特征在于，所述水产养殖的动物为淡水鱼。
6.一种如权利要求3~5之一所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）接种活化：将多粘类芽孢杆菌S3接种于平板固体培养基上，随后挑取单菌落于种子培养基中，活化培养，得种子液；
（2）第一次扩大培养：将步骤（1）所得的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行第一次扩大培养，得扩大培养液I；
（3）第二次扩大培养：将步骤（2）所得的扩大培养液I接种到装有发酵培养基的发酵罐中，再次进行培养，得扩大培养液II；
（4）浓缩收集：将步骤（3）所得的扩大培养液II进行浓缩，得液体制剂；
固体制剂是是通过将所述液体制剂或扩大培养液II喷雾干燥所得。
7.根据权利要求6所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述种子培养基为TSB液体培养基；活化培养条件为：温度28～30℃，装液量为容器体积的10～30%，摇床转速180～200 rpm。
8.根据权利要求6或7所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子液接种到发酵罐中的接种量是培养基体积的1～2%；第一次扩大培养所用发酵培养基的溶剂为水，配方为：葡萄糖5~12 g/L，胰蛋白胨7~15 g/L，大豆蛋白胨3~6 g/L，酵母提取物5-10 g/L，MgSO4.7H2O 1~3g，NaCl 2~5 g/L。
9.根据权利要求6~8之一所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述第一次扩大培养的溶氧量35~55%；所述第一次扩大培养的温度28～30 ℃；所述第一次扩大培养的时间为22-26 h；培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。
10.根据权利要求6~9之一所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述扩大培养液I的接种量是培养基体积的10～15%；所述发酵培养基的溶剂为水，配方为葡萄糖5~12 g/L，胰蛋白胨7~15 g/L，大豆蛋白胨3~6 g/L，酵母提取物 5~10 g/L，MgSO4.7H2O1~3g，NaCl 2~5 g/L；所述培养的溶氧量35~55%；所述培养的温度28~30 ℃；所述培养的时间为24~48 h；培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。
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