KR20080014242A - 항균활성물질을 생산하는 신규의 페니바실러스 폴리믹사ｄｙ1 및 그 항균활성물질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양에서 분리한 항균활성물질을 생산하는 신규한 균주인 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 및 이로부터 생산된 신규한 항균활성물질을 제공한다.

상기 항균물질은 식중독균 및 1군 법정 전염병균에 강한 활성을 나타내는 효과가 있었고, 항생제 내성 세균의 치료제로 사용할 수 있는 물질이다.

페니바실러스 폴리믹사, 항균활성물질

Description

항균활성물질을 생산하는 신규의 페니바실러스 폴리믹사 ＤＹ1 및 그 항균활성물질{Antibiotics-producing Paenibacillus polymyxa DY1 and the antibiotics}

도 1은 분리된 균주 DY1의 BHI 배지에서의 대장균 ATCC 25922에 대한 항균 활성을 보여준다. 콜로니 주변에 억제대가 보인다. a는 10㎕, b는 20㎕, c는 30㎕, d는 40㎕의 DY1 균주를 떨어뜨린 경우이다.

도 2는 DY1의 스캔닝 전자 현미경 사진이다 (X 5000). 배양은 35℃의 BHI 배지에서 48시간 동안 수행하였다.

도 3은 DY1의 그람염색을 보여준다.

도 4는 DY1의 16S rDNA의 부분 염기서열을 보여준다.

도 5는 DY1의 세포 지방산의 가스 크로마토그래피이다. 컬럼은 25 X 0.2mm 메틸 페닐 실리콘 융합된 실리카 모세관 컬럼을 이용하였고, 탐지기는 불꽃 이온화 검출기(FID)이고, 운반 가스는 N₂(30ml/분)이었다.

도 6은 살모넬라, 대장균, 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei)에 대한 항균 활성 테스트의 결과이다.

도 7은 장용혈성 대장균 균주(EHEC)에서의 다제내성에 대한 항균 디스크 테스트의 결과이다.

도 8은 장독소생성 대장균 균주 (ETEC)에서의 다제내성에 대한 항균 디스크 테스트의 결과이다.

도 9는 장병원성 대장균 균주 (EPEC)에서의 다제내성에 대한 항균 디스크 테스트의 결과이다.

도 10은 살모넬라 종에서의 다제내성에 대한 항균 디스크 테스트의 결과이다.

도 11은 쉬겔라 종에서의 다제내성에 대한 항균 디스크 테스트의 결과이다.

도 12는 비브리오 종에서의 다제내성에 대한 항균 디스크 테스트의 결과이다.

도 13은 요동 및 정지 배양 시간에 따른 항균 화합물의 억제대 직경 및 DY1의 수.

: 요동 배양,

: 정지 배양,

: 요동 배양의 억제대 직경,

: 정지 배양의 억제대 직경.

도 14는 여러 탄소 공급원의 기초 배지에서의 DY1의 생장에의 영향을 보여준다. A: 과당, B: 자일로스, C: 만노오스, D: 갈락토오스, E: 덱스트로스 (포도당), F: 말토오스, G: 사카로스, H: 젖당, I: 라피노스, J: 가용성 전분, K: 덱스트린, L: 셀로비오스, M: 이노시톨, N: Na-CMC, O: 에탄올, P: 글리세롤, Q: 아도니톨, R: 살리신.

도 15는 기초배지에서 DY1의 생장에 대한 다양한 덱스트로스 농도의 영향을 보여준다.

도 16은 기초배지에서 DY1의 생장에 대한 다양한 무기 질소원의 영향을 보여 준다. A: NH₄Cl, B: (COONH₄)₂, C: (NH₄)₂HPO₄, D: NH₄H₂PO₄, E: NH₄NO₃, F: NaNO₃, G: (NH₄)₂SO₄.

도 17은 기초배지에서 DY1의 생장에 대한 다양한 (NH₄)₂HPO₄의 농도의 영향을 보여준다.

도 18은 기초배지에서 DY1의 생장에 대한 다양한 질소원의 농도의 영향을 보여준다. A:펩톤, B:트립톤, C: 소이톤, D: 효모 추출물, E: 맥아 추출물, F: 요소, G: 카사미노산.

도 19는 기초배지에서 DY1의 생장에 대한 다양한 펩톤의 농도의 영향을 보여준다.

도 20은 기초배지에서 DY1의 생장에 대한 다양한 아미노산 공급원의 영향을 보여준다. A: 아스파라긴, B: 글루타민, C: 아르기닌, D: 메티오닌, E: 발린, F: 히스티딘, G: 아스파르트산, H: 프롤린, I:시스테인, J:루이신, K: 글루타민산, L:트레오닌.

도 21은 기초배지에서 DY1의 생장에 대한 다양한 글루타민의 농도의 영향을 보여준다.

도 22는 기초배지에서 DY1의 생장에 대한 다양한 무기염의 농도의 영향을 보여준다. A: KCl, B: BaCl₂, C: CaCl₂, D: CoCl₂, E: Li₂SO₄, F: MnSO₄, G: ZnSO₄, H: FeSO₄, I: MgSO₄, J: AgNO₃, K: Na₂MoO₄, L: KH₂PO₄, M: FeCl₃.

도 23은 기초배지에서 DY1의 생장에 대한 다양한 Na₂MoO₄의 농도의 영향을 보여준다.

도 24는 DY1의 생장에 대한 다양한 pH 조건의 영향을 보여준다.

도 25는 DY1의 생장에 대한 다양한 온도 조건의 영향을 보여준다.

도 26은 기초배지에서 DY1의 생장 억제 성분의 생산에 대한 다양한 탄소 공급원의 영향을 보여준다. A: 없음, B: 과당, C: 자일로스, D: 만노오스, E: 갈락토오스, F: 덱스트로스, G: 말토오스, H: 사카로스, I: 젖당, J: 라피노스, K: 가용성 전분, L: 덱스트린, M: 셀로비오스, N: 이노시톨, O: Na-CMC, P: 에탄올, Q: 글리세롤, R: 아도니톨 S: 살리신.

도 27은 기초배지에서 DY1의 생장 억제 성분의 생산에 대한 다양한 덱스트로스 농도의 영향을 보여준다.

도 28은 기초배지에서 DY1의 생장 억제 성분의 생산에 대한 다양한 덱스트로스 농도의 영향을 보여준다. A: 없음 B: 펩톤, C: 트립톤, D: 소이톤, E: 효모 추출물, F: 맥아 추출물, G: 요소 H: 카사미노산, I:NH₄Cl, J: (CooNH₄)₂, K: (NH₄)₂HPO₄, L: NH₄H₂PO₄, M: NH₄NO₃, N: NaNO₃, O: (NH₄)₂SO₄.

도 29는 기초배지에서 DY1의 생장 억제 성분의 생산에 대한 다양한 (NH₄)₂SO₄ 농도의 영향을 보여준다.

도 30는 기초배지에서 DY1의 생장 억제 성분의 생산에 대한 다양한 카사미노산의 농도의 영향을 보여준다.

도 31은 기초배지에서 DY1의 생장 억제 성분의 생산에 대한 다양한 아미노산 공급원의 영향을 보여준다. A: 없음, B: 아스파라긴, C: 글루타민, D: 아르기닌, E: 메티오닌, F: 발린, G: 히스티딘, H: 아스파르트산, I: 프롤린, J: 시스테인, K: 루이신, L:글루타민산 M:트레오닌.

도 32은 기초배지에서 DY1의 생장 억제 성분의 생산에 대한 다양한 아스파르트산의 농도의 영향을 보여준다.

도 33은 기초배지에서 DY1의 생장 억제 성분의 생산에 대한 다양한 무기 염의 영향을 보여준다. A: 없음, B: KCl, C: BaCl₂, D: CaCl₂, E: ZnSO₄, F: Li₂SO₄, G: MnSO₄, H: FeSO₄, I: MgSO₄, J: AgNO₃, K: Na₂MoO₄, L: KH₂PO₄, M: FeCl₃, N: NaCl.

도 34는 기초배지에서 DY1의 생장 억제 성분의 생산에 대한 다양한 FeSO₄의 농도의 영향을 보여준다.

도 35는 항균 성분에 의한 대장균 ATCC 25922의 온도 안정성을 보여준다. 40℃에서 18시간동안 배양.

도 36은 80℃에서 120분간 항균 성분에 의한 대장균 ATCC 25922의 온도 안정성을 보여준다. 40℃에서 18시간 동안 배양.

도 37은 80℃에서 대장균 ATCC 25922의 생장 억제 성분에 대한 열안정성을 보여준다. 40℃에서 18시간 동안 배양.

도 38는 대장균 ATCC 25922의 생장 억제 성분에 대한 pH 안정성을 보여준다. 반응은 37℃에서 60분 동안 수행되었다. -◆-: 아세테이트 완충액, -▲-: 포스페 이트 완충액, -●-: 트리스 완충액.

도 39는 NB, BHI 및 합성 배지 I 및 II 에서의 DY1에 의해 생산된 항균 활성성분의 항균할성 결과를 보여준다.

도 40은 합성 배지 I, II 및 NB (8X) 배지에서의 DY1에 의해 생산된 항균 활성성분의 항균할성 결과를 보여준다.

도 41은 HP 20 Diaion 컬럼 크로마토그래피로부터의 4개의 분획의 항균 활성을 보여준다.

도 42는 에테르 분획으로부터의 활성 분획의 얇은 막 크로마토그래피를 보여준다.

도 43a 내지 도 43d는 TLC로부터의 4개 분획의 항균 활성을 보여준다.

도 44는 DY1에서 생산된 항균 성분의 ¹H-NMR 스펙트럼을 보여준다.

본 발명은 항균활성물질을 생산하는 신규의 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 및 그 항균활성물질에 관한 것이다.

페니바실러스(Paenibacillus)는 Ash 등 (Ash, C., Priest, F. G. and Collins, M. D. 1993. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli using a PCR probe test. Proposal for the creation of a new genus Paenibacillus. Antonie van Leeuwenhoek 64: 253-260)이 rRNA 그룹을 이용한 분자생물학적 분류방법으로 분류한 새로운 3 종류의 바실러스(Bacillus) 그룹 중 새로운 속(genus)으로 최초로 보고한 토양미생물로서, Kajimura와 Kaneda (Kajimura, Y. and Kaneda, M. 1997. Fusaricidins B, C and D, new depsipeptide antibiotics produced by Bacillus polymyxa KT-8 isolation, structure elucidation and biological activity. Japan Journal of Antibiotics 50: 220-228)는 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa) KT-8이 뎁시펩타이드 항생제를 생산함을 보고하였으며, Aguilera 등 (Aguilera, M., Monteoliva-Sanchez, M., Suarez, A., Guerra, V., Lizama, C., Bennaser, A. and Ramos Cormenzana, A. 2001. Paenibacillus jamilae sp. nov., an exopolysaccharide-producing bacterium able to grow in olive-mill waste water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1687-1692)은 올리브-밀 폐수에서 자라는 페니바실러스 자밀레(P. jamilae)를 보고하였다. Elo 등 (Elo, S., Suominen, I., Kampfer, P., Juhanoja, J., Salkinoja-Salsonen, M. and Haahtela, K. 2001. Paenibacillus borealis sp. nov., a nitrogen fixing species isolated from spruce forest humus in Finland. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 535-545)은 부엽토에서 질소고정능력을 갖고 있는 새로운 페니바실러스 보레알리스(P. borealis) 를 보고하였으며, Shida 등 (Shida, O., Takagi, H., Kadowaki, K., Nakamura, L. K. and Komagata, K. 1997. Emended description of Paenibacillus amylolyticus and description of Paenibacillus illinoisensis sp. nov. and Paenibacillus chibensis sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 299-306)은 페 니바실러스 아밀롤리티쿠스(P. amylolyticus), 페니바실러스 일리노이센시스(P. illinoisensis) 및 페니바실러스 치벤시스(P. chibensis)의 3 종의 새로운 종을 보고하였고, Tcherpakov 등 (Tcherpakov, M., Ben-Jacob, E. and Gutnick, D. L. 1999. Paenibacillus dendritiformis sp. nov., proposal for a new pattern forming species and its localization within a phylogenetic cluster. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 239-246)은 새로운 패턴을 나타내는 페니바실러스 덴드리티포르미스(P. dendritiformis)를 보고한 바 있다. 국내에서도 여러 새로운 균주들이 보고되었고 최근에 Yoon 등 (Yoon, J. H., H. M. Oh, B. D. Yoon, K. H. Kang and Y. H Park. 2003. Paenibacillus kribbensis sp. nov. and Paenibacillus terrae sp. nov., bioflocculants for efficient harvesting of algal cells. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 295-301)은 토양에서 페니바실러스 크리벤시스(P. kribbensis) 와 페니바실러스 테라(P. terrae)의 새로운 균주를 보고하였다.

그러나 현재 페니바실러스 폴리믹사 종은 많은 연구가 이루어지지 않은 종으로서, 최근에 새로운 균주를 찾고자하는 연구가 국내외에서 활발하게 이루어지고 있으나, 국내에서는 아직 많은 균주가 분리되지 않았으며, 페니바실러스 폴리믹사로부터 생산하는 항균활성물질에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다.

한편, 세계적으로 주요한 식품 매개질환 병원체이며, 여러가지 항균제에 내성을 가져 공중보건 문제로 주목을 받고 있는 살모넬라 속에는 법정 1군 전염병을 일으키는 장티푸스균 및 파라티푸스균이 포함되어 있다. 또한 최근에 국내에서 설사질환 원인균으로 크고 작은 유행을 일으키는 세균성 이질균은 단체급식에서 설사 질환을 유발하는 전염성 세균이고, 쉬겔라(Shigella) 균은 항생제에 다제내성을 가지고 있어 환자치료에 항생제의 선택이 다양하지 않은 문제점을 가지고 있어 치료에 많은 난점이 있다. 따라서 이들 균들에 대해 항균활성작용을 갖는 물질 및 이를 생산하는 미생물을 분리 동정할 필요가 있다.

그러나 새로운 미생물을 성공적으로 분리하고 분리된 균주가 특정한 생리활성물질을 생합성 할 수 있는 능력을 가지고 있다고 하더라도, 균주가 요구되는 제 기능을 제대로 발현하지 못하고, 배양이 제대로 되지 않는다면 생리활성물질을 대량으로 생산하기에는 많은 문제점이 제기된다. 그러므로 다양하고 새로운 미생물 자원의 탐색방법 개발과 더불어 새로운 배양기술의 개발이 이루어져야 된다.

본 발명의 목적은 항균활성물질을 생산하는 페니바실러스 폴리믹사의 균주를 제공하는 것이다. 또한 상기 균주로부터 항균활성물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 병원성 세균 및 다제내성세균 등의 생장을 강하게 억제하는 물질을 생산하는 균주 및 이에 의해 항생 물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 항균활성물질을 생산하는 균주인 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 및 이로부터 생산된 신규한 항균활성물질 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 항균활성물질을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 토양으로부터 분리한 11 개의 균주들 중에서 대장균 균주에 대해 가장 큰 성장억제효과를 나타내는 균주인 DY1을 선별하였다.

DY1 균주의 형태적 특성, 생리학적 특성, API 50 CHB 테스트 결과 및 세포내 지방산 분석의 결과를 토대로 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (John 등, 1994) 와 The Genus Bacillus (Gordon 등, 1973)를 이용하여 동정하였으며, 16S rDNA 염기서열을 NCBI를 통한 겐방크(GeneBank)로 상동성을 검색한 결과 페니바실러스 폴리믹사와 일치(유사도 99% 이상)하여 페니바실러스 폴리믹사 종으로 동정하였다.

장내병원성 세균 및 항생제 다제내성균에 대한 성장억제력 시험을 통해 DY1 균주에 의해 분비되는 항균활성물질은 식중독균 및 1군 법정 전염병균에 강한 활성을 나타내는 효과가 있었고, 항생제 내성 세균의 치료제로 사용할 수 있는 물질임이 밝혀졌다.

최적 배양 조건 및 항균활성물질 생산 조건이 실험에 의해 밝혀졌다.

마지막으로 항균활성물질의 분리 및 정제 방법이 기술된다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 항균활성물질 생산 균주의 선별

병원성 세균 및 다제내성세균 등의 생장을 강하게 억제하는 물질을 생산하는 균주를 선별하기 위하여 강원도 양구군에 위치한 대암산 용늪 주위의 토양에서 페니실린 G (4㎍/ml)와 폴리믹신 B 황산염 (54㎍/ml)를 함유한 선택배지를 이용하여 항균활성물질을 생산하는 DY1 균주부터 DY11 균주까지 총 11 균주를 분리하였다.

분리한 11 균주 중 대장균(Escherichia coli) ATCC 25922 균주에 가장 큰 성장억제효과를 나타내는 DYI 균주를 선발하였다. DYI 균주를 배양한 후 원심분리하여 얻은 상층액을 대장균이 도말된 평판배지에 10㎕, 20㎕, 30㎕, 40㎕ 떨어뜨린 후 40℃에서 24시간 반응시킨 결과 (도 1) 평판배지 상에서 뚜렷한 생장억제대 (투명환)를 나타내, DYI 균주는 항균활성물질을 생산하는 균주로 판단되었다.

실시예 2. 균주의 특성

1) 형태적 특성

DY1 균주의 형태학적 특성을 조사한 결과 도 3에서와 같이 세포의 크기는 1 이상의 크기를 나타냈다.

DY1 균주를 동정하기 위하여 SEM (히타찌 S 0570) 전자 현미경으로 촬영한 결과 도 2에서와 같이 전형적인 간균의 형태를 나타냈다.

2) 생리학적 특성

DY1 균주의 생리학적 특성을 조사한 결과 표1에서와 같이 카탈라제 양성반응을 나타냈고, L-아라비노스로부터 산을 생산하였으며, L-아라비노스 양성반응을 나 타냈다. 그람염색에서는 그람양성으로 나타났으며 (도 3), 포자낭 팽윤과 파라스포랄 결정(parasporal crystal), 혐기성 성장, VP 테스트, 겔라틴의 가수분해, 난황 레시티나제, 인돌 생성, 용혈, 운동성, 옥시다제, β-갈락토시다제 반응 등은 모두 음성으로 나타났다.

DY1 균주의 생리학적 특성

종목	특성	항목	특성
그람염색	+	겔라틴의 가수분해	-
카탈라제	+	난황 레시티나제	-
혐기성		인돌 생성	-
VP 테스트	-	혈액 아가 플레이트의 용혈	-
		포자낭 팽윤	-
산의 공급원		파라스포랄 결정	-
D-포도당	-	운동성	-
L-아라비노스	+	옥시다제	-
D-자일로스	-	그라이닌의 다이하이드롤라제(Dihydrolase of grainine)	-
-스트렙토마이만니톨	-	β-갈락토시다제	-

3) API 50 CHB 테스트

DY1 균주가 어떠한 탄소원을 이용하는 가를 알아보기 위하여 API 50 CHB 키트 (Bio Merieux 사, 프랑스)를 사용하여 실험하였다. 그 결과 표 2에서와 같이 글리세롤, L-아라비노스, 라이보오스, D-자일로스, β-메틸-D-자일로스, 갈락토오스, 포도당, 과당, 만노오스, 스트렙토마이만니톨, 아미그달린(amygdalin), 아르부틴(arbutin), 에스쿨린(esculin), 살리신(salicine), 셀리비오스(celibiose), 맥아당, 젖당, 멜리비오스(melibiose), 수크로오스, 트레할로스(trehalose), 이눌린(inulin), 라피노스(raffinose), 전분, 글리코겐, 겐티오비오스(gentiobiose), D-투르라노스(turRanose) 등 26 종의 당에는 양성반응을 나타냈으나, 에리트리톨(erythritol), D-아라비노스, L-자일로스, 아도니톨(adonitol), 소르보스, 람노스(rhamnose), 둘시톨(dulcitol), 이노시톨, 소르비톨, α-메틸-D-만노사이드, α-메틸-D-글루코시드, N-아세틸-글루코사민, 멜레지토스(melezitose), 자일리톨, D-라이소스(lyxose), D-타가토스(tagatose), D-퓨코스, L-퓨코스, D-아라비톨, L-아라비톨, 글루코네이트, 2-케토-글루코네이트, 5-케토-글루코네이트 등 23 종의 당에는 음성반응을 나타냈다.

API 50 CHB 테스트에 의한 DY1 균주의 생리학적 특성

탄수화물 공급원	DY1	탄수화물 공급원	DY1
글리세롤	+	살리신	+
에리트리톨	-	셀리비오스(Celibiose)	+
D-아라비노스	-	맥아당	+
L-아라비노스	+	젖당	+
라이보스	+	멜리비오스(Melibiose)	+
D-자일로스	+	수크로오스	+
L-자일로스	-	트레할로스(Trehalose)	+
아도니톨	-	이눌린(Inulin)	+
β-메틸-D-자일로스	+	멜레지토스(Melezitose)	-
갈락토오스	+	라피노스	+
포도당	+	전분	+
과당	+	글리코겐	+
만노오스	+	자일리톨	-
소르보스	-	겐티오비오스(Gentiobiose)	+
람노스	-	D-투르라노스(turRanose)	+
둘시톨(Dulcitol)	-	D-라이소스(lyxose)	-
이노시톨	-	D-타가토스(tagatose)	-
스트렙토마이만니톨	+	D-퓨코스	-
소르비톨	-	L-퓨코스	-
α-메틸-D-만노사이드	-	D-아라비톨	-
α-메틸-D-글루코사이드	-	L-아라비톨	-
N-아세틸-글루코사민	-	글루코네이트	-
아미그달린(Amygdalin)	+	2-케토-글루코네이트	-
아르부틴(Arbutin)	+	5-케토-글루코네이트	-
에스쿨린(Esculin)	+

4) 화학 분류학적 특성

- 16S 리보솜 DNA 염기서열 분석 -

분리한 DY1 균주의 정확한 동정을 위하여 16S rDNA 유전자를 키트 (프러닥스 A 1360; 프로메가사 (미국, 위스콘신주, 메디슨시 소재)를 이용하여 염기서열을 조사한 결과 도 4에서와 같이 1,416 염기쌍의 염기서열이 결정되었다 (서열식별번호 1). 본 발명에서 PCR을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다: 전방향 프라이머 서열식별번호 2 (5`-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3`) 및 후방향 프라이머 서열식별번호 3 (5` GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3`).

데이터베이스 검색은 NCBI 겐방크 네트워크 서비스 사의 BLAST 프로그램 (접근 번호 AY 359632)으로 수행한 결과 페니바실러스 폴리믹사 종과 99% 이상의 유사성을 나타내어 페니바실러스 폴리믹사 종으로 동정하였다.

5) 세포내 지방산 분석

DY1 균주의 지방산을 추출하여 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 지방산 조성은 다른 그람 양성균들처럼 이소-타입과 안테-이소 타입으로 구성되어 있었으며, 안테-이소 타입이 큰 비중을 차지하고 있었다.

C₁₅:0 안테 이소(ante iso)-지방산이 63.55%로 가장 많이 함유하고 있었으며, 나머지는 C₁₆:0 이소(iso)-지방산이 9.3%, C₁₇:0 안테 이소-지방산이 9.25% 함유하고 있었다. 구체적인 분석 결과는 도 5과 같다.

세포내 지방산 분석 결과를 이용하여 DY1 균주를 동정한 결과 페니바실러스에 속하는 페니바실러스 폴리믹사로 최종 확인되었으며, 이 결과는 Yoon 등 (Yoon et al. op. cit.)의 페니바실러스 크리벤시스(P. kribbensis) 와 페니바실러스 테라(P. terrae)의 지방산 분석결과와 유사한 결과를 나타냈다.

실시예 3. 장내병원성 세균에 대한 성장억제력 시험

항균물질을 생산하는 페니바실러스 폴리믹사 DY1이 인간의 장내에 질병을 일으키는 19 종의 장내세균에 대한 감수성시험을 한 결과 표 3과 도 6에서와 같이 페니바실러스 폴리믹사 DY1은 그람양성 세균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 리스테리아 모노사이토겐스(Listeria monocytogens) 등 3종의 세균 성장에는 효과를 나타내지 않았으나, 1군 법정 전염병균인 EHEC, 장티푸스균, 파라티푸스균 및 이질균과 식중독세균인 살모넬라식중독균, 예르시니아 엔테로콜리티아(Yersinia enterocolitiea) 및 비브리오 식중독균 등에는 성장억제효과를 나타냈으며 (도 7, 10, 11, 12), 특히 1군 법정 전염병균인 콜레라균에도 성장을 억제시키는 효과를 나타내었다 (표 3). Piuri 등 (Piuri, M., Sanchez-Rivas, C. and Ruzai, S. M. 1998. A novel antimicrobial activity of a Paenibacillus polymyxa strain isolated from regional fermented sausages. Lett. Appl. Microbiol. 27: 9-13)이 페니바실러스 폴리믹사 균주가 생산하는 폴릭신(polyxin)이 바실러스 세레우스를 포함한 17 종류의 세균에 대한 항균효과를 측정한 결과, 스타필로코커스 아우레우스에 음성을 나타낸다는 보고와는 동일한 결과를 나타냈으나, 슈도모마스 아메루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 뉴포트(Salmonella newport)에 음성반응을 나타낸다는 결과와는 상이한 결과를 보였다, 폴릭신이 일반세균에 양성반응을 나타낸 반면 본 발명에서 분리한 페니바실러스 폴리믹사 DY1에서 생산되는 항균활성물질은 식중독균 및 1군 법정전염병 균에 강한 활성을 나타내는 효과가 있었다.

다양한 병원성 세균에 대한 항미생물 작용

균주	DY1
살모넬라 타이피(Salmonella typhi)	+
살모넬라 파라타이피(S. paratyphi)	+
살모넬라 타이피무리움(S. typhimurium)	+
살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis)	+
대장균 (EHEC)	+
대장균 (EIEC)	+
대장균 (ETEC)	+
대장균 (EPEC)	+
쉬겔라 손네이(Shigella sonnei)	+
쉬겔라S. flecneri)	+
쉬겔라S. dysenteriae)	+
쉬겔라S. boydii)	+
스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)	-
예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)	+
예르시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica)	+
바실러스 세레우스 (바실러스 세레우스 (Bacillus cereus ))	-
리스테리아 모노사이토겐스 (Listeria monocytogens)	-
비브리오 파라헤몰리티쿠스 (Vibrio parahemolyticus)	+
비브리오 콜레라(V. cholerae)	+

실시예 4. 항생제 다제내성균주에 대한 성장억제력 시험

페니바실러스 폴리믹사가 생성한 항균활성물질의 항균활성에 대한 활성을 알아보기 위하여, 35 균주의 항생제 다제내성 균주들에 대한 디스크 확산 시험과 8 균주의 비브리오 균주에 대한 항균활성을 실험한 결과는 표 4 내지 7과 도 7 내지 12 와 같다. 표 4에서와 같이 4 종류 (암피실린, 세팔로틴, 시프로플로사신, 티카르실린) 또는 7 종류 (암피실린, 암피실린/설박탐, 클로람페니콜, 겐타미신, 설파메트사졸/트리메토프림, 티카르실린, 테트라사이클린)의 항생제에 내성을 나타내는 장출혈성 대장균 (EHEC)은 성장억제대가 12mm에서 14mm로 나타났으며 (도 7), 이 결과는 대장균 ATCC 25922 균의 생장억제대와 유사하거나 같은 효과를 나타내고 있다. 또한 최근 주요 식중독 원인균으로 국내에서 분리되고 있는 여러 가지 항생제에 내성을 가지는 장독소형 대장균 (ETEC)에도 성장억제를 보여주고 있으며 (도 8), 그리고 10 종류의 (암피실린, 암피실린/설박탐, 세팔로틴, 클로람페니콜, 날리딕신산, 스트렙토마이신, 설파메톡사졸/ 트리메토프림, 티카르실린, 테트라사이클린, 아목시실린/클라불란산)의 항생제에 내성을 나타내고 있는 장병원성 대장균 (EPEC)에는 15mm 크기의 생장억제대를 형성하는 놀라운 항균력을 나타내 (도 9), 앞으로 항생제 내성 세균의 치료제로 사용할 수 있는 물질이다.

대장균에서 다제내성(multi-drug resistance)에 대한 항세균 디스크 테스트의 결과

균주	저항 패턴 (수)	생장억제대 직경 (㎜)
대장균 ATCC 25922	모두 내성 없음	14
EHEC 03-36	AM, CF, CIP, TIC(4)	12
EHEC 03-37	AM, SAM, C, GM, SXT, TIC, TE(7)	12
EHEC 03-38	All sensitive	14
EHEC 03-39	NA, SXT, TE(3)	13
EHEC	모두 내성 없음	12
ETEC 2-2	AM, AN, SAM, CF, CIP, GM, NA, SXT, TIC(9)	12
ETEC	모두 내성 없음	11.5
ETEC 04-12	AM, SAM, CF, SXT, TIC(5)	12
ETEC 04-9	AM, SAM, CF, GM, SXT, TIC(6)	11
ETEC 04-13	AM, SAM, CF, GM, SXT, TIC(6)	12
EPEC 02-1	AM, SAM, CF, C, NA, S, SXT, TIC, TE, AMC(10)	15
EPEC	모두 내성 없음	12
EPEC 02-2	S, TE(2)	13
EPEC 02-3	AM, SAM, CF, CRO, TIC, TE, AMC(7)	13
EPEC 02-6	AM, CF, TIC TE(5)	13

AM;암피실린, C;클로람페니콜, GM; 겐타미신, S;스트렙토마이신, TE;테트라사이클린, NA;날리딕신산, CIP시프로플록사신, CRO;세프트리악손, CF;세팔로틴, K;카나마이신, SXT;설파메톡사졸/트리메토프림, SAM;암피실린/설박탐, TIC;티카르실린, FOX;세폭시틴, AMC아목시실린/클라불란산, AN; 아미카신.

전 세계적으로 주요한 식품 매개질환 병원체이며, 여러가지 항균제에 내성을 가져 공중보건 문제로 주목을 받고 있는 살모넬라균 속에는 법정 1군 전염병을 일으키는 장티푸스균 및 파라티푸스균이 포함되어 있다. 페니바실러스 폴리믹사 DY1이 생산하는 항균활성물질로 다양한 다제내성을 갖고 있는 살모넬라 균에 대해 시험한 결과는 표 5와 도 10에서와 같이 5 종류에서 6 종류의 항생제에 저항성을 나타내는 (MDR) 법정 1군 전염병균인 장티푸스균 (13㎜)과 파라티푸스 (9㎜) 균에 강한 활성을 나타냈으며, 식중독 균인 다제내성 살모넬라 (16850, 1298)에도 10~11㎜의 비교적 강한 활성을 나타냈다 (도 10). 적게는 5 종류 (암피실린, 클로람페니콜, 날리딕신산, 스트렙토마이신, 티카르실린)에서 많게는 12 종류 (암피실린, 암피실린/설박탐, 세팔로틴, 클로람페니콜, 세팍시틴, 겐타미신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 설파메톡사졸/트리메토프림, 티에아르실린, 테트라사이클린, 아목시실린/클라불란산)의 항생제에 다제내성을 나타내는 살모넬라 균에도 큰 억제력을 보이는 놀라운 효과를 나타내, 다제내성 병원균에 대한 치료제로 사용될 수 있다.

살모넬라 혈청형의 다제내성 (MDR) 9 균주에 대한 항세균 디스크 테스트의 결과

균주	저항 패턴(수)	생장억제대 직경 (㎜)
살모넬라 Blockly	AM, K, NA, S, TIC, TE(6)	10
살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis) 13492	AM, C, NA, S, TIC(5)	9
살모넬라 타이피무리움(S. typhimurium) 16850	AM, C, S, SXT, TIC, TE, AMC(8)	10
살모넬라 타이피무리움(S. typhimurium) 1298	AM, C, GM, NA, S, SXT, TIC, TE(8)	11
살모넬라 타이피무리움(S. typhimurium) 14263	AN, CF, CRO, FOX, GM, K, NA, S, TE(9)	10
살모넬라 수베루 (S. Suberu)	AM, SAM, DF, C, FOX, GM, K, S, SXT, TIC, TE, AMC(12)	10
살모넬라 파라타이피 에이(S. Paratyphi) A	AM, C, S, TIC, TE(5)	9
살모넬라 비르쵸우 (S. Virchow)	AM, CF, FOX, NA, TIC, TE, AMC(7)	10
살모넬라 타이피 (S. Typhi)	AM, C, NA, S, TIC, TE(6)	13

세균성 이질균은 설사질환을 유발하는 전염성 세균이다. 페니바실러스 폴리믹사 DY1이 생산하는 항균활성물질로 다양한 다제내성을 갖고 있는 쉬겔라(Shigella) 균에 대한 항균력 시험결과는 표 6과 도 11와 같다. 국내에서는 대부분 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei) 균에 의한 세균성 이질이 전염되고 있어 다제내성을 갖고 있는 이질균을 대상으로 시험한 결과 12㎜내지 14㎜의 성장억제대를 나타냈다 (도 11). 이 결과는 다른 병원성 세균에 대한 시험결과에 비교하여 항균효과가 매우 높은 것이며, 세프트리악손에 내성을 가지는 균(16087) 및 아목시실린/ 클라불란산에 내성을 가지는 균에도 (20760, 15176) 탁월한 성장억제력을 나타내, 다제내성을 나타내는 이질균의 치료제로 사용될 수 있다.

쉬겔라의 다제내성 (MDR) 10 균주에 대한 항세균 디스크 테스트의 결과

균주	저항 패턴 (수)	생장억제대 직경 (㎜)
쉬겔라 손네이(Shigella sonnei) 16981	AM, CF, CRO, GM, NA, S, SXT, TIC, TE(9)	14
쉬겔라 손네이 207	NA, S, SXT, TE(4)	12
쉬겔라 손네이 292	AM, CF, GM, K, NA, S, SXT, TIC, TE(9)	14
쉬겔라 손네이 2497	AM, CF, GM, NA, S, SXT, TIC, TE(8)	14
쉬겔라 손네이 6087	AM, SAM, DF, FOX, NA, S, SXT, AMC(8)	13
쉬겔라 플레스네리 (S. flexneri) 15175	AM, C, S, SXT, TIC, TE(6)	14
쉬겔라 플레스네리 20760	AM, SAM, C, S, SXT, TIC, TE(7)	13
쉬겔라 플레스네리15176	AM, SAM, C, S, SXT, TIC, TE(7)	13
쉬겔라 디센테리아 (S. dysenteriae) 5177	S, SXT, TE(3)	12
쉬겔라 디센테리아 5178	S, SXT, TE(3)	12

또한 여름철에 익히지 않은 어패류를 섭취함으로서 주요한 설사 원인균으로 많이 분리되고 있는 장염비브리오균과 패혈증을 유발하는 비브리오 패혈증균에 대해 페니바실러스 폴리믹사 DY1이 생산하는 항균활성물질로 항균력을 시험한 결과는 표 7와 도 12과 같다. 페니바실러스 폴리믹사 DY1이 생성한 항균활성물질이 비브리오 균의 생장을 억제시킨 생장억제대 크기는 작게는 10㎜에서 크게는 14㎜로 장염비브리오 균에도 탁월한 억제효과를 나타내 (도 12), 장염비브리오와 비브리오 패혈증의 치료제로 사용될 수 있다.

비브리오의 7 균주에 대한 항세균 디스크 테스트의 결과

균주	생장억제대 직경(㎜)
비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus)	14
비브리오 파라해몰리티쿠스 (V. parahaemolyticus) 18853 (1)	11
비브리오 파라해몰리티쿠스 18854 (2)	11
비브리오 파라해몰리티쿠스 18855 (8)	10
비브리오 파라해몰리티쿠스 18857 (12)	11
비브리오 파라해몰리티쿠스 19249	12
비브리오 파라해몰리티쿠스 19342	10

실시예 5. 성장시간과 조건에 따른 항균활성물질의 생성

성장조건 (진탕배양, 정치배양)에 따른 균의 성장과 항균물질 생산력을 시험한 결과 균의 성장은 진탕배양 시 12시간 배양했을 때 증식감속기에 들어갔고, 18 시간 배양했을 때 정지기에 도달했으며, 24시간 배양했을 때 사멸기로 들어섰다가, 30시간 배양했을 때에 다시 작은 성장 패턴을 보였다. 정치배양시에는 18시간 배양했을 때 정지기에 도달했으며, 24시간 배양 후 사멸기로 들어갔다가 30시간 배양했을 때 소폭의 성장패턴을 보였다. 성장조건 (진탕배양, 정치배양)에 따른 균의 성장곡선은 진탕배양이나 정치배양시 접종 후 18시간 까지는 계속 성장하다가 이후 정지기, 쇠퇴기 패턴을 보이다가 30시간이 지나서 다시 작은 성장 패턴을 보여주는 유사한 패턴을 나타냈다. 성장조건에 따른 항균물질의 생성 및 활성을 조사한 결과, 생성된 항균물질은 진탕배양에서 18시간부터 12mm 크기의 억제력을 타나나기 시작하였고, 30시간 배양했을때 14mm 크기의 억제대를 나타냈다. 정치배양에서는 36시간부터 나타나기 시작하여 48시간까지 측정했을 때 10mm 크기의 활성을 나타내었다. 따라서 토양에서 분리한 페니바실러스 폴리믹사 DY1의 항균활성물질 생성 배양조건은 진탕배양으로 48시간 이상 배양했을 때 항균활성물질 생성이 좋은 것으로 판단된다 (도 13).

배양시간에 따른 항균활성물질의 생산을 비교했을 때, 카수가마이신(kasugamycine)을 생산하는 스트렙토마이세스 카수가엔시스(Streptomyces kasugaensis)는 64시간 배양시 최고의 생산성을 나타내며 (오영준. 1992. Streptomyces kasugaensis의 kasugamycin 생산배지 조성 및 배양조건의 검토. Kor . J. Appl . Microbiol Biotechnol. 20(5): 583-587), KG-1667 A와 B를 생산하는 클라스트리디움 종은 96시간 배양시 (홍수형, 남재성, 박용복, 하지홍. 1990. Clostridium sp.가 생산하는 항생물질 KG-1167 A와 KG-1167 B의 최적생산조건. Kor . J. Appl . Microbiol . Biotechnol . 18(3): 292-295), 비 메가테리움(B. megaterium) KL-39 (정희경, 김상달. 2003. 고추역병균 Phytophthora capsici를 방제하는 길항균주 Bacillus megaterium KL 39의 선발과 길항물질. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 31(3): 235-241) 균주는 40시간 배양시, 카뎁신 B를 생산하는 스트렙토마이세스 레테오그리세우스(Streptomyces leteogriseus) KT-10 (한길환, 김상달. 1999. Streptomyces luteogriseus KT-10에 의한 cathepsin B 저해물질의 발효생산. Kor. J. Appl . Microbiol . Biotechnol. 27(6): 458-465) 균주는 96시간 배양시, 클라스트리디움 종 KH-431 (홍수형, 김미정, 박용복, 이재근, 하지홍. 1993. 항생물질을 생산하는 Clostridium sp. KH-431의 동정 및 항생물질의 정제. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 21(1): 41-46) 균주는 108시간 배양시, 바실러스 폴리믹사(B. polymyxa) 균주가 폴리믹신 생산시 60시간 배양시 최대 생산량을 나타냈다는 보고 (Paulus. H. and Gray, E. 1964. The biosynthesis of polymyxin B by growing cultures of B. polymyxa. J. Biol . Chem. 239: 865-871)와는 상이한 결과를 나타내, 각 균주마다 배양시간에 따른 항균활성물질의 생산은 차이가 있는 것으로 판단된다.

실시예 6. 배양학적 특성

1) 최적탄소원 선발 및 최적농도

탄소원은 미생물에 있어서 탄수화물, 단백질, 지질, 핵산 등의 합성과 에너지 공급원으로 세균의 생장에 필수적인 영양원이다. 페니바실러스 폴리믹사 DY1의 균체생장에 영향을 미치는 탄소원 및 탄소원의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여 기본배지에 과당을 포함한 18 종류의 탄소원을 각각 1% 첨가한 배지에서 35℃로 48시간 진탕배양한 다음 600㎚에서 흡광도를 측정하여 균체의 생장을 조사한 결과 도 14, 에서와 같이 단당류로는 덱스트로오스, 이당류로는 말토오스, 사카로스, 다당류로는 가용성 전분, 덱스트린, 글리세롤 첨가 시 생장이 양호하였으나 이노시톨, Na-CMC, 에탄올, 아도니톨 첨가 시 균의 생장은 저조하였다.

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장에 최적탄소원인 덱스트로오스의 농도가 균체의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 덱스트로오스의 농도를 0.1%에서 2.0%까지 각각 달리하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과 도 15에서와 같이 0.6% 첨가시 균주의 생육이 가장 좋은 것으로 나타났다.

2) 최적무기질소원 선발 및 최적농도

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장에 미치는 무기질소원 및 무기질소원의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여 0.6% 덱스트로오스가 포함된 기본배지에 NH₄Cl을 포함한 7 종류의 무기질소원을 각각 1% 첨가한 배지에서 35℃로 48시간 진탕배양한 다음 600㎚에서 흡광도를 측정하여 균체의 생장을 조사한 결과 도 16에서와 같이 (NH₄)₂HPO₄와 NH₄NO₃ 첨가시 균의 생장은 양호하였으나, NaNO₃ 첨가시 균의 생장은 저조하였다.

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장에 최적무기질소원인 (NH₄)₂HPO₄ 의 농도가 균체의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 (NH₄)₂HPO₄의 농도를 0.1에서 2.0%까지 각각 달리하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과 도 17에서와 같이 1.4% 첨가시 균주의 생육이 가장 좋은 것으로 나타났다. 항생물질을 생산하는 세균들이 생육하기 위해 요구하는 무기질소원은 NH₄Cl (홍수형, 남재성, 박용복, 하지홍. 1990. Clostridium sp.가 생산하는 항생물질 KG-1167 A와 KG-1167 B의 최적생산조건. Kor . J. Appl . Microbiol . Biotechnol . 18(3): 292-295), (NH₄)₂S₂O₈ (한옥경, 이은탁, 김상달. 2001. 식물병원진균을 길항하는 chitinase 생산성 생물 방제균 Bacillus amyloliquefaciens 7079의 선발과 chitinase 생산조건. Kor . J. Appl . Microbiol . Biotechnol. 29(3): 142-148) 첨가시 양호하다는 보고와는 상이하였다.

3) 최적 유기질소원 선발 및 최적농도

질소원은 세포질을 구성하고 있는 주요 성분의 합성에 필수적인 영양원이다. 페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장에 미치는 유기질소원 및 유기질소원의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여 0.6% 덱스트로오스와 1.4% (NH₄)₂HPO₄가 포함된 기본배지에 펩톤을 포함한 7종류의 유기질소원을 각각 1% 첨가한 배지에서 35℃로 48시간 진탕배양한 다음 600㎚에서 흡광도를 측정하여 균체의 생장을 조사한 결과 도 18에서와 같이 펩톤 첨가시 균의 생장이 가장 양호하였으며, 맥아 추출물(malt extract) 첨가시 균의 생장이 저조한 것으로 나타났다.

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장에 최적유기질소원인 펩톤의 농도가 균체의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 펩톤의 농도를 0.1%에서 2.0%까지 각각 달리하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과 도 19에서와 같이 0.9% 첨가시 균주의 생육이 가장 좋은 것으로 나타났다. 정 등 이 바실러스 메가테리움(B. megaterium) KL-39 균주가 0.3% 효모 추출물 첨가시 생장이 양호하였다는 보고(정희경 등, op. cit.)와 상이한 결과를 나타냈지만, 카텝신 B를 생산하는 스트렙토마이세스 종 KT-10 (한 등, 1999, op. cit.) 배양시 0.3% 펩톤 첨가시 생장이 양호하였다는 보고와는 농도에서 차이는 있었지만 일치하는 면을 나타냈다.

4) 최적 아미노산 선발 및 최적농도

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장에 미치는 아미노산 및 아미노산의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여 0.6% 덱스트로오스, 1.4% (NH₄)₂HPO₄, 0.9% 펩톤이 포함된 기본배지에 아스파라긴을 포함한 12 종류의 아미노산을 각각 1% 첨가한 배지에서 35℃로 48시간 진탕배양한 다음 600㎚에서 흡광도를 측정하여 균체의 생장을 조사한 결과 도 20에서와 같이 글루타민과 아스파라긴 첨가시 균의 생장은 양호하였으나, 발린과 루이신 첨가시 균의 생장은 저조하였다.

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장에 최적아미노산인 글루타민의 농도가 균체의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 글루타민의 농도를 0.1%에서 2.7%까지 각각 달리하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과 도 21에서와 같이 2.4% 첨가시 균주의 생장이 가장 좋은 것으로 나타났다. 한 등 (한길환 등, 1999, op. cit.)이 카뎁신 B를 생산하는 스트렙토마이세스 루테오그리세우스(Streptomyces luteogriseus) KT-10 균주의 생장은 아스파라긴 첨가시 균의 생장이 양호했다는 보고와는 상이하였다.

5) 최적무기염류 선발 및 최적농도

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장에 미치는 무기염류 및 무기염류의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여 0.6% 덱스트로오스, 1.4% (NH₄)₂HPO₄, 0.9% 펩톤, 2.4% 글루타민이 포함된 기본배지에 KCl을 포함한 13 종류의 무기염류를 각각 1% 첨가된 배지에서 35℃로 48시간 진탕배양한 다음 600㎚에서 흡광도를 측정하여 균체의 생장을 조사한 결과 도 22에서와 같이 Na₂MoO₄, MgSO₄, CaCl₂, KCl 첨가시 균의 생장은 양호하였으나, AgNO₃, MnSO₄, ZnSO₄, FeSO₄ 첨가시 균의 생장은 저조하였다.

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장에 최적무기염류인 Na₂MoO₄의 농도가 균체의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Na₂MoO₄의 농도를 0.1%에서 2.5%까지 각각 달리하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과 도 23에서와 같이 1.9% 첨가시 균주의 생장이 가장 좋은 것으로 나타났다. 항균물질을 생산하는 미생물들이 0.4% CaCl₂ 첨가시 생장이 좋았다는 보고 (홍 등, 1990, op. cit.)와, Mg⁺⁺이온이 첨가되었을 때 생장이 양호하였다는 보고 (한 등, 1999, op. cit.)와는 상이하였다.

6) 초발 pH에 대한 영향

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생육에 적합한 pH를 조사하기 위하여 배지의 pH를 3.0에서 11.0까지 각각 달리한 배지에 균을 접종한 후 35℃에서 24시간 배양한 다음 600nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 생장을 조사한 결과 도 24에서와 같이 pH 8.0에서 최적의 생장을 나타냈다. 폴리믹신을 생산하는 페니바실러스 폴리믹사 (Paulus et al., op. cit.) 균주와, 세레인(cerein)을 생산하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) (Naclerio, G., E. Ricca, M. Sacco and M. de Felice. 1993. Antimicrobial activity of a newly identified bacteriocin of Bacillus cereus. Appl . Environ. Microbiol. 59(12): 4313-4316)의 최적 pH는 6.0 이었으며, 카수가마이신(kasugamycine)을 생산하는 스트렙토마이세스 카수가엔시스(Streptomyces kasugaensis) IFO 13851 (오영준, op. cit.)의 배양 최적 pH가 6.3~6.6 사이였다는 보고와는 차이가 있었으나, 항생물질을 생산하는 바실러스 메가테리움(B. megaterium ) KL 39 (정 등, 2003, op. cit.)의 최적 pH가 8.0이라는 보고와는 일치하였다.

7) 배양온도에 대한 영향

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생육에 대한 최적온도를 조사하기 위하여 15℃에서 50℃까지 각각 온도를 달리하여 24시간 배양한 다음 600㎚에서 흡광도를 측정하여 균주의 생장을 조사한 결과 도 25에서와 같이 35℃에서 균주의 생장이 가장 좋은 것으로 나타났다. 세레인(cerein)을 생산하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) (Naclerio et. al., op. cit.)의 최적배양온도는 30℃이었으며, 카수가마이신(kasugamycine)을 생산하는 스트렙토마이세스 카수가엔시스(Streptomyces kasugaensis) IFO 13851 (오, 1992, op. cit.)의 최적배양온도가 28℃ 이었고 항생물질을 생산하는 바실러스 메가테리움(B. megaterium ) KL 39(정 등, 2003, op. cit.)의 최적배양온도가 25℃ 이었다는 보고와는 차이가 있었다.

실시예 7. 항균활성물질 생산조건

1) 탄소원의 영향 및 최적농도

항균활성물질에 중요한 영향을 미치는 탄소원은 미생물의 에너지원 및 항균활성물질 생합성의 기전에 중요한 요소로 작용한다. 항균물질을 생산하는 페니바실러스 폴리믹사 DY1의 항균활성물질 생산에 영향을 미치는, 탄소원 및 탄소원의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여 기본배지에 과당을 포함한 18 종류의 탄소원을 각각 1% 첨가한 배지에 균주를 접종한 후, 35℃에서 48 시간 진탕배양한 다음 배양액을 표준균주가 도말된 평판배지에 50㎕ 떨어뜨리고, 40℃에서 24시간 반응시켜 생장억제대를 측정한 결과 도 26에서와 같이 덱스트로오스 첨가시 가장 양호하였고, 맥아당, 젖당 첨가시에도 양호하였으나 과당, 가용성 전분, 덱스트린, 글리세롤 첨가시에는 저조한 것으로 나타났다.

항균활성물질의 생산에 최적탄소원인 덱스트로오스의 농도가 항균활성물질 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 덱스트로오스의 농도를 0.1%에서 2.0%까지 각각 조정하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과 도 27에서와 같이 1.0% 첨가시 항균활성물질의 생산이 가장 양호한 것으로 나타났으며, 농도가 증가함에 따라 활성이 점점 감소되는 점으로 미루어볼 때 포도당에 의한 카타볼라이트 억제(catabolite repression) 현상이 나타나는 것으로 사료된다. 본 연구의 결과는 한 등 (한길환 등, op. cit.)이 카뎁신 B를 생산하는 스트렙토마이세스 KT-10 균주는 2% 포도당 첨가시 생산이 양호하였으며, 스트렙토마이세스 카수가엔시스(Streptomyces kasugaensis) (오영준. 1992. Streptomyces kasugaensis의 kasugamycin 생산배지 조성 및 배양조건의 검토. Kor . J. Appl . Microbiol Biotechnol. 20(5): 583-587)에서 생산되는 카수가마이신은 포도당 첨가시 생산량이 증가되었고, 클로스트리디움 종 균주(홍수형 등, 1990, op. cit.)에서 생산되는 항생물질은 1% 포도당 첨가시 양호하였다는 보고와 일치하였지만, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(박선옥, 송성기, 윤권상, 정연호, 이상종, 정용섭, 전계택. 2000. Pseudomonas aeruginosa에 의해 생합성되는 항진균성물질 (PAFS)의 생산성 증가 및 생산균주의 배양 생리학적 특성 연구. Kor . J. Appl . Microbial. Biotechnol. 28 (6): 341-348)에서 합성되는 PAFS의 생산에는 3% 과당 첨가시, 바실러스 메가테리움(B. megaterium ) KL 39 (정희경 등, op. cit.)에서 생성되는 항생물질 생산은 0.4% 과당 첨가했을 때 항생물질 생산이 양호하였다는 보고와 항생물질을 생산하는 클로스트리디움 종 KH-431 균주는 소르비톨 첨가시 항생물질 생산이 양호하였다는 보고(홍수형 등, 1993. op. cit.)와는 상이한 결과를 나타냈다. 이러한 결과를 볼 때 항생물질을 생산하는 균주들이 요구하는 탄소원은 서로 다른 다양한 탄소원을 필요로하는 것으로 판단된다.

2) 무기질소원의 영향 및 최적농도

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 항균활성물질 생산에 미치는 무기질소원 및 무기질소원의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여, 덱스트로오스 1.0%를 함유한 기본배지에 NH₄Cl을 포함한 7 종류의 무기질소원을 각각 1% 첨가한 배지에 균주를 접종한 후, 35℃에서 48시간 진탕배양한 다음 배양액을 표준균주가 도말된 평판배지에 50㎕ 떨어뜨리고, 40℃에서 24시간 반응시켜 생장억제대를 측정한 결과 도 28에서와 같이 (NH₄)₂SO₄ 첨가시 가장 양호하였으며, 대부분의 무기염류는 모두 항균활성물질 생산에 양호한 결과를 나타냈다. 이 결과는 바실러스 종이 생산하는 항생물질은 무기질소원보다는 유기질소원이 대체로 양호하다는 보고 (Kim, H. R. 1994. Antifungal antibiotic of antiagonistic bacterium Bacillus sp. YH-16 against Fusarium solani causing plant root rod. Department of applied microbiology, Graduate school, Youngnam university; Kim, Y. S. 1992. Biocontrol bacteria, Bacillus subtilis YB-70 producing the antifungal antibiotics and genetic improvement. Department of applied microbiology, Graduate school, Youngnam University; Shin, Y. J. 2000. Isolation, characteristics and structural analysis of antifungal antibiotic from Bacillus sp. YJ-63. Department of microbiology, Graduate school, Dongeui University)와는 상이하였다.

항균활성물질의 생산에 최적무기질소원인 (NH₄)₂SO₄의 농도가 항균활성물질 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 (NH₄)₂SO₄의 농도를 0.1%에서 2.0%까지 각각 달리하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과 도 29에서와 같이 1.5% 첨가시 항균활성물질의 생산이 가장 좋은 것으로 나타났다. 미생물에서 항생물질 생산시에 무기질소원으로 (NH₄)₂SO₄ (박 등, op. cit.) 첨가시 생산이 증가한다는 보고와는 일치하였지만 NH₄Cl (홍 등, 1990, op. cit.) 첨가시 생산이 증가한다는 보고와 바실러스 폴리믹사(Paulus et. al., op. cit.) 균주가 폴리믹신 B 생산시 4% (NH₄)₂SO₄ 첨가시 최적 조건이었다는 보고와는 상이하였다.

3) 유기질소원의 영향 및 최적농도

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 항균활성물질 생산에 미치는 유기질소원 및 유기질소원의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여, 1% 덱스트로오스와 1.5% (NH₄)₂SO₄를 함유한 기본배지에 펩톤을 포함한 7 종류의 유기질소원을 각각 1% 첨가한 배지에 균주를 접종한 후, 35℃에서 48 시간 진탕배양한 다음 배양액을 표준균주가 도말된 평판배지에 50㎕ 떨어뜨리고, 40℃에서 24시간 반응시켜 생장억제대를 측정한 결과 도 28에서와 같이 카사미노산 첨가시 항균활성물질의 생산은 양호하였으나, 펩톤을 포함한 6종류의 유기질소원을 첨가했을 때는 항균활성물질의 생산이 매우 저조하였다. 대부분 항생물질 생산시 무기질소보다는 유기질소원이 양호하다는 보고 (Shin, op. cit.)와는 상이하였다.

항균활성물질의 생산에 최적유기질소원인 카사미노산의 농도가 항균활성물질 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 카사미노산의 농도를 0.1%에서 2.0%까지 각각 달리하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과 도 30에서와 같이 1.1% 첨가시 항균활성물질의 생산이 가장 좋은 것으로 나타났다.

질소원의 경우 무기질소원은 항균활성물질 생산에 좋은 영향을 미치는 것으로 나타났으나, 유기질소원은 카사미노산을 제외한 유기질소원은 항균활성물질 생산에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 홍 등 (홍 등, 1990, op. cit.)이 클로스트리디움 종이 항생물질 생산시 카사미노산 첨가시 양호하였다는 보고와는 일치하였지만, 바실러스 메가테리움(B. megaterium)(정 등, 2003, op. cit.)은 0.3% 효모 추출물(yeast extract) 첨가시에, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (박 등, 2000, op. cit.)는 3.5% 목하씨 가루를 첨가했을 때, 스트렙토마이세스 KT-10 (한 등, 1999, op. cit.) 균주는 0.3% 펩톤 첨가시 항생물질 생산이 좋다는 보고와는 상이하였다. 이 결과를 볼 때 항균활성물질을 생산하는 균주 또한 다양한 질소원을 요구하는 것으로 판단된다.

4) 아미노산의 영향 및 최적농도

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 항균활성물질 생산에 미치는 아미노산 및 아미노산의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여 1% 덱스트로오스와 1.5% (NH₄)₂SO₄, 1.1% 카사미노산이 포함된 기본배지에 L-아스파라긴을 포함한 12 종류의 아미노산을 각각 1% 첨가한 배지에 균주를 접종한 후 35℃에서 48 시간 진탕배양한 다음 배양액을 표준균주가 도말된 평판배지에 50㎕ 떨어뜨리고 40℃에서 24시간 반응시켜 생장억제대를 측정한 결과 도 31에서와 같이 대부분의 아미노산 첨가시 항균활성물질의 생산은 좋았으나, 그 중 아스파르트산 첨가시 가장 좋은 것으로 나타났다.

항균활성물질의 생산에 최적아미노산인 아스파르트산의 농도가 항균활성물질 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 카사미노산의 농도를 0.1%에서 2.5%까지 각각 달리하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과 도 32에서와 같이 1.9% 첨가시 항균활성물질의 생산이 가장 좋은 것으로 나타났다. 항생물질 생산시 아스파라긴 첨가시 항생물질 생산이 증가한다는 보고 (한 등, 1999, op. cit.)와는 상이하였다.

5) 무기염류의 영향 및 최적농도

페니바실러스 폴리믹사 DY1의 항균활성물질 생산에 미치는 무기염류 및 무기염류의 최적농도에 대한 영향을 조사하기 위하여 1% 덱스트로오스, 1.5% (NH₄)₂SO₄, 1.1% 카사미노산, 1.9% 아스파르트산이 포함된 기본배지에 KCl을 포함한 13 종류의 무기염류를 각각 1% 첨가한 배지에 균주를 접종한 후 35℃에서 48시간 진탕배양한 다음 배양액을 표준 균주가 도말된 평판배지에 50㎕ 떨어뜨리고 40℃에서 24시간 반응시켜 생장 억제대를 측정한 결과 도 33에서와 같이 모든 무기염류 첨가시 항균활성물질을 생산하였으나 FeSO₄ 첨가시 가장 좋은 것으로 나타났다.

항균활성물질의 생산에 최적무기염류인 FeSO₄의 농도가 항균활성물질 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여, FeSO₄의 농도를 0.1%에서 2.0%까지 각각 달리하여 농도에 따른 영향을 조사한 결과, 도 34에서와 같이 0.1%에서 2% 농도까지 항균활성물질 생산이 생산되었으나, 1.8% 첨가시 생장저해물질의 생산이 가장 좋은 것으로 나타났다. 홍 등 (홍 등, 1990, op. cit.)은 0.4% CaCl₂ 첨가시 항균물질의 생산이 좋았으며, 정 등 (정 등, 2003, op. cit.)은 KCl, MgCl₂, NaCl, BaCl₂ 첨가시 생산이 양호하였고, CaCl₂ 첨가시 (홍 등, 1993, op. cit.; 한 등, 1999, op. cit.) 항균물질 생산이 좋았다는 결과와는 상이한 결과를 나타냈다.

6) 온도에 대한 안정성

10℃에서 100℃까지 10℃ 간격으로 각각의 온도에서 항균활성물질이 들어 있는 여과액을 60분 동안 반응시킨 후 생장억제대의 직경을 측정하여 온도에 대한 안정성을 조사한 결과 모든 온도 (10℃~100℃)에서 활성을 나타냈다 (도 35).

80℃에서 생장억제대가 24 ㎜로 나타난 항균활성물질을 10 분에서 120 분까지 10 분 간격으로 반응시킨 후 (도 36) 생장억제대의 직경을 측정한 결과 도 37에서와 같이 80℃에서 120분간 처리했을 때에는 생장억제대가 25 ㎜이상 형성된 것으로 보아 페니바실러스 폴리믹사 DY1이 생산하는 항균활성물질은 고온성 물질인 것으로 판단된다. Piuri 등 (Piuri et al., op. cit.)이 쏘세지에서 분리한 페니바실러스 폴리믹사 P 13 균주가 생산하는 폴릭신(polyxin)이 90℃에서 10분이상 가열시에도 안정성이 있다는 결과와 이 등 이 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 썰모필러스(Streptococcus salivarius subs. thermophilus)가 생산하는 박테리오신(bacteriocin)은 100℃에서 30분 처리했을 때에 안정성이 있다는 보고(이장혁, 장효일, 1994, Streptococcus salibarius subsp. thermophilus . Kor . J. Appl . Microbiol. Biotechno . 22(1): 7-12) 및 Naclerio 등 이 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)가 생산하는 세레인 이 90℃에서 15 분 처리했을 때 안정했다는 보고(Naclerio et. al., op. cit.)와 유사하였다. 따라서 본 균주가 생산한 항균활성물질은 열에 매우 안정한 물질로 항균활성물질로 널리 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

7) pH에 대한 안정성

아세테이트 완충액으로 pH 3, 4, 5 용액을, 포스페이트 완충액으로 pH 6, 7, 8 용액을 트리스 완충액으로 pH 9, 10, 11 용액을 각각 제조한 후 (손기남, 홍남주. 2003. 생물유기화학실험. 미학사. P 327-355), 각각의 완충액 50㎕와 항균활성물질이 들어 있는 여과액 50㎕를 혼합한 후, 40℃에서 60 분간 반응시킨 후, 생장억제대를 측정하여 pH에 대한 안정성을 조사한 결과 도 38에서와 같이 pH 3에서 5 사이에서는 18㎜ 이상의 억제환을 나타냈고, pH 6에서 8 사이에서는 15㎜ 이상의 억제환을 나타냈으며, pH 9에서 11 사이에서는 15㎜의 억제환을 나타냈다. 이것으로 보아 페니바실러스 폴리믹사 DY1가 생산하는 항균활성물질은 pH에 안정한 물질로 판단된다.

페니바실러스 폴리믹사 P 13 균주가 생산하는 폴릭신이 산에서는 안정하나 알칼리에서는 불안정하다는 보고(Piuri et al., op. cit.)와는 상이하게 나타났으나, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에서 생산하는 세레인이 pH 3에서 12까지 넓은 범위에서 안정하다는 결과(Naclerio et. al., op. cit.)와는 일치하였다. 따라서 본 균주가 생산한 항균활성물질은 넓은 pH 범위에서 안정성을 나타내어 항균활성물질로 널리 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

페니바실러스 폴리믹사 DY1이 생산하는 항균활성물질의 생산에 영향을 미치는 영양원 및 농도와 이 균주의 생장에 영향을 미치는 영양원 및 농도를 비교한 결과 표 8에서와 같이 탄소원은 생장시에는 0.6% 덱스트로오스가 양호하였으나, 생장저해물질 생산에는 1% 덱스트로오스 첨가시 양호하였으며, 무기질소는 생장시 1.4% (NH₄)HPO₄ 첨가시 양호하였으나, 항균활성물질 생산시에는 1.5% (NH₄)₂SO₄ 첨가시 양호하였다. 유기질소원은 생장시 0.9% 펩톤 첨가시 양호하였으나, 항균활성물질 생산시에는 1.1% 카사미노산 첨가시 양호하였으며, 아미노산은 생장시 2.4% 글루타민 첨가시 양호하였으나, 항균활성물질은 1.9% 아스파르트산 첨가시 양호하였다.

무기염류는 생장시 1.9% Na₂MoO₄ 첨가시 양호하였으나 항균활성물질은 1.8% FeSO₄ 첨가시 양호한 것으로 나타났다. 대부분의 미생물이 Fe⁺⁺ 이온의 농도가 높을 때 생장이 거의 이루어지지 않는다. 본 연구에 이용된 페니바실러스 폴리믹사 DY1도 FeSO₄ 첨가시에 생장은 잘 이루어지지 않았으나, 항균활성물질의 생산에는 가장 양호한 무기염류로 나타났다. 이 결과는 앞으로 좀 더 항균활성물질생산 기작에 대해 심층연구가 필요하다고 사료된다.

기초 배지(basal medium)에서 페니바실러스 폴리믹사 DY1에 의해 생산된 항세균 성분 및 성장에 대한 영양 인자의 비교

근원	성장	항세균 성분
탄소	덱스트로오스(0.6%)	덱스트로오스(1%)
무기 질소	(NH4)2HPO4(1.4%)	(NH4)2SO4(1.5%)
유기 질소	펩톤(0.9%)	카사미노산(1.1%)
아미노산	글루타민(2.4%)	아스파르트산(1.9%)
미네랄 염	Na2MoO4(1.9%)	FeSO4(1.8%)

실시예 8. 실험배지에서 균의 생장과 항균활성물질의 생산

페니바실러스 폴리믹사 DY1가 생산하는 항균활성물질이 어떤 배지에서 잘 생성되며, 또한 이 균주가 어느 배지에서 잘 생장하는지를 조사한 결과 도 39, 40과 표 9에서와 같이 페니바실러스 폴리믹사 DY1의 생장은 BHI 배지에서 제일 잘 자랐으며 카사미노산이 첨가된 합성배지, 카사미노산이 없는 합성배지, NB 배지 순으로 잘 생장하였고 (표 9), 항균활성물질 생산은 합성배지에서 항균활성물질의 생산이 좋았으며 (도 39), 특히 카사미노산이 포함된 합성배지 Ⅰ에서 배양했을 때, 항균활성물질 및 활성이 가장 좋은 것으로 나타나 (도 40), 페니바실러스 폴리믹사 DY1이 생산하는 항균활성물질의 생산은 카사미노산이 첨가된 합성배지 I이 최적배지인 것으로 판단되며, 오히려 영양분이 많은 배지에서는 균의 생장은 양호하였으나, 항균활성물질의 생산은 떨어지는 것으로 나타났다.

NB, BHI 및 합성 배지 I, II 에서 페니바실러스 폴리믹사 DY1에 의해 생산된 항세균 성분의 항세균 활성 및 성장의 비교

항목 배지	600 nm OD.	억제대 직경 (mm)
		디스크 방법	드롭 방법
NB	0.427	6	6
BHI	1.729	6	6
합성배지 Ⅰ	0.95	18	22
합성배지 Ⅱ	0.044	15	20

합성배지 Ⅰ; 덱스트로오스 (1%), (NH₄)₂SO₄ (1.5%), 카사미노산 (1.1%), 아스파르트산 (1.9%), FeSO₄ (1.8%).

합성배지 Ⅱ; 덱스트로오스 (1%), (NH₄)₂SO₄ (1.5%), 아스파르트산 (1.9%), FeSO₄ (1.8%).

실시예 9. 항균활성물질의 분리 및 정제

식중독균 및 1군 법정전염병균에 항균력을 나타내는 페니바실러스 폴리믹사 DY1이 생산하는 항균활성물질을 분리하기 위하여 세균 배양액을 원심분리한 후 상층액을 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피하여 에테르, 헥산, CHCl₃ (클로로포름)및 에틸아세테이트로 추출하여 ×1, ×2, ×3, ×4 4개의 분획물을 얻었다. 4 개의 분획물에 대한 항균력을 조사한 결과 도 41에서와 같이 에테르 (도 41 A)로 추출한 분획이 가장 활성이 좋은 것으로 나타나, 활성이 있는 에테르층을 회전 진공 증발기로 감압 농축하여 54mg의 활성물질을 얻었다.

활성이 있는 부분을 TLC를 시행한 후 (CHCl₃:MeOH = 1:50) 결과 4개의 분획을 얻은 후 (도 42), 각 분획에 대한 항균력을 조사한 결과 도 43과 같이 A 분획에서 가장 강한 활성을 나타냈다. 강한 활성을 나타낸 항균활성물질을 ¹H NMR (Varian Mercury 300)으로 분석한 결과 도 44와 같이 0.818, 0.843, 0.870, 0.885ppm의 피크에서 탄화수소기(-CH₂)와 1.240, 1.308, 1.378, 1.588ppm의 피크에서 메틸기(-CH₃)를 갖고 있으며, 5,302ppm의 피크에서 하이드록실기(-OH)를 갖고 있는 CH₃ 와 CH₂ 기가 다중으로 연결된 알칸 계열의 물질로 판단된다. 아울러 10℃~100℃까지 모든 온도에 대해 안정성 (도 35, 36, 37)을 나타내며, pH 3에서 11까지에서도 모든 pH 안정성 (도 38)을 나타낸 것으로 보아 분자량이 작은 저분자물질로 판단된다.

상기 설명한 바와 같이 페니바실러스 폴리믹사 DY1에서 생산되는 항균활성물질은 병원성 세균인 살모넬라, 대장균, 쉬겔라, 스태필로코커스, 바실러스, 비브리오 등에 우수한 항균작용을 보였고, 이에 이들 병원성 세균에 의해 유발되는 질병에의 치료제로 쓰일 수 있다.

<110> YOO, Kwan Hee <120> Antibiotics-producing Paenibacillus polymyxa DY1 and the antibiotics <130> HY-06-0080 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1416 <212> DNA <213> Paenibacillus polymyxa <400> 1 ctggctccct tgcgggttac cccaccgact tcgggtgttg taaactctcg tggtgtgacg 60 ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120 caattccgac ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagac cggcttttct 180 aggattggct ccacctcgcg atttcgcttc ccgttgtacc ggccattgta gtacgtgtgt 240 agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300 ccggcagtct gcttagagtg cccagcttga cctgctggca actaagcata agggttgcgc 360 tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420 gtctcctctg tcccgaagga aaggtctatc tctagaccgg tcagagggat gtcaagacct 480 ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatact ccactgcttg tgcgggtccc 540 cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggaat gcttaatgtg 600 ttaacttcgg caccaagggt atcgaaaccc ctaacaccta gcattcatcg tttacggcgt 660 ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gcgtcagtta 720 cagcccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tatctacgca tttcaccgct 780 acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagctcc ccagtttcca gtgcgacccg 840 aagttgagcc tcgggattaa acaccagact taaanagccg cctgcgcgcg ctttacgccc 900 aataattccg gacaacgctt gccccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960 cggggctttc ttctcaggta ccgtcactct tgtagcagtt actctacaag acgttcttcc 1020 ctggcaacag agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag 1080 gctttcgccc attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc 1140 tcagtcccag tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtaggc 1200 ctttacccca ccaactagct aatgcgccgc aggcccatcc acaagtgaca gattgctccg 1260 tctttcctcc ttctcccatg caggaaaagg atgtatcggg tattagctac cgtttccggt 1320 agttatccct gtcttgtggg caggttgcct acgtgttact cacccgtccg ccgctaggtt 1380 aattagaagc aagcttctaa ttaaccccgc tcgact 1416 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 3 gtttaccttg ttacgactt 19

Claims (19)

1. 병원성 세균에 대해 항균활성을 갖는 미생물 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 (수탁번호:KACC 91225P).
2. 청구항 1에 있어서, 병원성 세균은 살모넬라, 대장균, 쉬겔라, 스태필로코커스, 바실러스, 및 비브리오 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 페니바실러스 폴리믹사 DY1.
3. 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1이 생산하는 항균활성물질.
4. 청구항 3에 있어서,

   (i) 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1으로부터 분리되며;

   (ii) 10℃~100℃의 온도에서 안정하고;

   (iii) pH 3에서 11의 범위에서 pH 안정성을 갖는 것,

   을 특징으로 하는 항균활성물질.
5. 청구항 3 또는 청구항 4 기재의 항균활성물질을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
6. 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 을 배양하여 그 배양액으로부터 항균활성물질을 분리하여 청구항 3 또는 청구항 4 기재의 항균활성물질을 제조하는 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 의 배양에 사용되는 배지는 탄소원으로서 덱스트로오스, 맥아당 또는 젖당을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 청구항 7에 있어서 상기 탄소원은 덱스트로오스인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 덱스트로오스의 농도는 1.0%인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 청구항 7에 있어서, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 의 배양에 사용되는 배지는 무기질소원으로서 (NH₄)₂SO₄ 을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 (NH₄)₂SO₄의 농도는 1.5%인 것을 특징으로 하는 방 법.
12. 청구항 6에 있어서, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 의 배양에 사용되는 배지는 유기질소원으로서 카사미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 카사미노산의 농도는 1.1%인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 청구항 6에 있어서, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 의 배양에 사용되는 배지는 아미노산 공급원으로서 아스파르트산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 아스파르트산의 농도는 1.9%인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 청구항 6에 있어서, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 의 배양에 사용되는 배지는 무기염류로서 FeSO₄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 청구항 16에 있어서 상기 FeSO₄은 0.1 내지 2%의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 FeSO₄의 농도는 1.8%인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 청구항 6 에 있어서, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) DY1 배양액을 원심분리한 후 상층액을 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제로 상기 항균활성물질을 제조하는 방법.

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