CN110079587A - 一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的菌群数量变化，为生物饲料发酵过程中厌氧益生菌菌量的测定提供了一种特异、敏感和成本较低的检测方法，能够实现五种厌氧益生菌同时检测并能了解五种厌氧益生菌在发酵过程中菌群的变化规律，为进一步优化发酵饲料提供技术方案。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法。
背景技术
微生物发酵饲料指在人为可控的情况下，将乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等微生物添加到一种或多种饲料原料中，进行好氧发酵或厌氧发酵，在发酵过程中，通过微生物代谢作用，消除饲料原料中的抗营养因子，使原料中的营养物质得到充分利用，从而获得一种新型的、安全的、营养丰富的、利于消化吸收的生物饲料。
乳酸菌发酵固态饲料可将一些大分子营养物质(如蛋白质、多糖、脂肪等)不断降解，产生有利于动物消化吸收的物质；饲料经乳酸菌发酵，还可产生一些有机酸、多肽、游离氨基酸、维生素及未知生长因子等，从而提高饲料的营养价值。发酵饲料的特殊酸香味还可以提高适口性，增进动物食欲，有利于采食量等生长指标提升。双歧杆菌专性厌氧，它可以通过自身及产生的代谢物排斥致病菌，在发酵过程中保持其自身的菌种优势，并与其他菌种相互作用，调整整个菌群之间的关系，从而达到维持菌群平衡的目的。
目前对发酵饲料的研究多集中在饲料营养成分的改变和应用效果等方面，而对发酵饲料中有关菌群变化报道较少，对菌落和长势相近的菌的鉴定缺少有效的方法。为快速定量监控生物饲料发酵过程中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌数量的动态变化，有必要建立一种快速、简便、准确的菌量检测方法。
发明内容
鉴于以上需要，本发明提出了一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，以提供一种特异、敏感并且成本较低的检测方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下。
一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：生物饲料中基因组DNA的提取：提取生物饲料中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的基因组DNA；
S2：特异性引物的设计：设计植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的特异性引物；
S3：以步骤S1提取的DNA为模板，用步骤S2设计的特异性引物作为扩增引物进行荧光定量PCR反应，反应结束后，计算所测样品中五种乳酸菌的数量；
其中S2中所设计的特异性引物为：
植物乳杆菌：上游引物CAGCACTAGATACCGCCCTG，下游引物ATGTAGTGCCACGGTCGTTT，扩增长度211bp；
嗜酸乳杆菌：上游引物AGACACGGCCCAAACTCC，下游引物GACAACGCTTGCCACCTA，扩增长度231bp；
长双歧杆菌：上游引物GATTCTGGCTCAGGATGAACGC，下游引物CTGATAGGACGCGACCCCAT，扩增长度231bp；
干酪乳杆菌：上游引物CTATAAGTAAGCTTTGATCCGGAGATT T，下游引物CTTCCTGCGGGTACTGAGATGT，扩增长度：133bp；
鼠李糖乳杆菌：上游引物TGCTTGCATCTTGATTTAATTTTG，下游引物GTCCATTGTGGAAGATTCCC，扩增长度317bp。
其中，上述方法步骤中的荧光定量PCR扩增体系为20μL，包含SYBR(R)GreenRealtime PCR Master10μL，ROX 0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，DNA模板2μL，去离子水补足至20μL。
另外，上述方法步骤S3中的荧光定量PCR扩增的程序为：先经过95℃预变性30s，之后95℃ 5s，60℃ 31s，共40个循环。
优选地，所述生物饲料中五种乳酸菌基因组DNA的提取方法为：称取1g生物饲料加入9mL的无菌水，摇床振荡10min，使微生物细胞分散，然后静置2-3min；取1mL上清液，10000×g离心2min（重复步骤一次），取1g沉淀放入研钵中，加入液氮充分研磨，加入1mL PBS（pH值7.4，0.1mol/L磷酸钠缓冲液）和20μL 20% PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮），充分均质化后200×g离心5-8min，取上清；沉淀中再加入1mL PBS，离心，取上清；合并两次上清，300×g离心5-8min，取上清；再将上清以10000×g离心5-10min，收集菌体，并用PBS洗涤，在得到的菌体中加入300μL裂解液A（150mM NaCl，100mM乙二胺四乙酸二钠，pH 8.0）、10%溶菌酶100μL和1% RNase A 20μL,混匀后37℃保温30min，再加入300μL裂解液B（100mM NaCl，500mM Tris-HCl, pH 8.0）及50μL 20% SDS（十二烷基硫酸钠）和50μL 20% PVPP，混匀后冰浴5min，加入等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（2：24:1）,10000×g离心10min，取上清（重复操作一次）；加入上清1/10体积3M醋酸钠及2倍体积乙醇，-20℃沉淀1.5-2h，10000×g离心15-20min，75%乙醇洗涤一次，超净工作台下干燥沉淀，沉淀用50-100μL TE（100mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0）溶解，提取的DNA可立即使用也可-20℃冷冻保存备用。
其中，所述生物饲料其含水量为30%-55%，发酵温度为28-37℃，发酵时间为0-30d。
另外，所述生物饲料中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在发酵前的添加量为0.1%-10%。
相对于现有技术，本发明的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法具有以下优势：
本发明根据五种乳酸菌设计它们的特异性引物，建立五种乳酸菌的荧光定量PCR检测方法，并对其特异性进行了评价。因荧光定量PCR操作简便、检测周期短、灵敏度高及重复性好等优点而被广泛应用。本发明基于五种乳酸菌设计它们的特异性引物，建立了更优秀的体系，建立了荧光定量PCR检测方法。本发明的方法检测周期短、灵敏度高、重复性好，可以检测不同的生物饲料原料中同属不同种的细菌，以及不同菌种但长势及菌落相似的菌类，为了解生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化规律，提供了一种特异、敏感和成本较低的检测方法。
附图说明
图1为实施例1中生物饲料分步发酵过程中植物乳杆菌数量变化图，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示植物乳杆菌数量的对数值；
图2为实施例１中生物饲料分步发酵过程中嗜酸乳杆菌数量变化，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示嗜酸乳杆菌数量的对数值；
图3为实施例１中生物饲料分步发酵过程中长双歧杆菌数量变化，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示长双歧杆菌数量的对数值；
图4为实施例１中生物饲料分步发酵过程中干酪乳杆菌数量变化，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示干酪乳杆菌数量的对数值；
图5为实施例１中生物饲料分步发酵过程中鼠李糖乳杆菌数量变化，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示鼠李糖乳杆菌数量的对数值；
图6为实施例2中生物饲料同步发酵过程中植物乳杆菌数量变化图，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示植物乳杆菌数量的对数值；
图7为实施例2中生物饲料同步发酵过程中嗜酸乳杆菌数量变化，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示嗜酸乳杆菌数量的对数值；
图8为实施例2中生物饲料分同步发酵过程中长双歧杆菌数量变化，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示长双歧杆菌数量的对数值；
图9为实施例2中生物饲料同步发酵过程中干酪乳杆菌数量变化，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示干酪乳杆菌数量的对数值；
图10为实施例2中生物饲料同步发酵过程中鼠李糖乳杆菌数量变化，横坐标表示发酵天数，纵坐标表示鼠李糖乳杆菌数量的对数值；
图11为实施例3.5中的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为DNA Marker,从上到下依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp,1、2号泳道为植物乳杆菌,3、4号泳道为嗜酸乳杆菌,5、6号泳道为长双歧杆菌,7、8号泳道为干酪乳杆菌,9、10号泳道为鼠李糖乳杆菌,11号泳道为阴性对照。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验设计，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明提供了一种检测生物饲料发酵过程中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌共五种厌氧益生菌的特异性引物以及荧光定量PCR检测方法。本发明为生物饲料发酵过程中厌氧益生菌菌量的测定提供了一种特异、敏感和成本较低的检测方法，能够实现五种厌氧益生菌同时检测并能了解五种厌氧益生菌在发酵过程中菌群的变化规律，为进一步优化发酵饲料提供技术方案。
本发明首先建立了用于生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法的特异性引物，所述特异性引物的序列如下所示：
植物乳杆菌：上游引物CAGCACTAGATACCGCCCTG，下游引物ATGTAGTGCCACGGTCGTTT，扩增长度211bp；
嗜酸乳杆菌：上游引物AGACACGGCCCAAACTCC，下游引物GACAACGCTTGCCACCTA，扩增长度231bp；
长双歧杆菌：上游引物GATTCTGGCTCAGGATGAACGC，下游引物CTGATAGGACGCGACCCCAT，扩增长度231bp；
干酪乳杆菌：上游引物CTATAAGTAAGCTTTGATCCGGAGATT T，下游引物CTTCCTGCGGGTACTGAGATGT，扩增长度：133bp；
鼠李糖乳杆菌：上游引物TGCTTGCATCTTGATTTAATTTTG，下游引物GTCCATTGTGGAAGATTCCC，扩增长度317bp。
所建立的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法包括如下步骤：
S1生物饲料中基因组DNA的提取：提取生物饲料中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的基因组DNA；
S2特异性引物的设计：设计植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的特异性引物；
S3荧光定量PCR反应：进行荧光定量PCR反应，反应结束后，计算所测样品中五种乳酸菌的数量。
作为本发明方法所检测的对象，所述生物饲料其含水量为30%-55%，发酵温度为28-37℃，发酵时间为0-30d。所述生物饲料中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌再发酵前的添加量为0.1%-10%。
其中所述生物饲料中五种乳酸菌基因组DNA的提取方法为：称取1g生物饲料加入9mL的无菌水，摇床振荡10min，使微生物细胞分散，然后静置2-3min；取1mL上清液，10000×g离心2min（重复步骤一次），取1g沉淀放入研钵中，加入液氮充分研磨，加入1mL PBS（pH值7.4，0.1mol/L磷酸钠缓冲液）和20μL 20% PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮），充分均质化后200×g离心5-8min，取上清；沉淀中再加入1mL PBS，离心，取上清；合并两次上清，300×g离心5-8min，取上清；再将上清以10000×g离心5-10min，收集菌体，并用PBS洗涤，在得到的菌体中加入300μL裂解液A（150mM NaCl，100mM乙二胺四乙酸二钠，pH 8.0）、10%溶菌酶100μL和1%RNase A 20μL,混匀后37℃保温30min，再加入300μL裂解液B（100mM NaCl，500mM Tris-HCl, pH 8.0）及50μL 20% SDS（十二烷基硫酸钠）和50μL 20% PVPP，混匀后冰浴5min，加入等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（2：24:1）,10000×g离心10min，取上清（重复操作一次）；加入上清1/10体积3M醋酸钠及2倍体积乙醇，-20℃沉淀1.5-2h，10000×g离心15-20min，75%乙醇洗涤一次，超净工作台下干燥沉淀，沉淀用50-100μL TE（100mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0）溶解，提取的DNA可立即使用也可-20℃冷冻保存备用。
所用的荧光定量PCR扩增体系为20μL，包含SYBR(R)Green Realtime PCR Master10μL，ROX 0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，DNA模板2μL，去离子水补足至20μL。并且，荧光定量PCR扩增的程序为：先经过95℃预变性30s，之后95℃5s，60℃31s，共40个循环。
下面将结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1：生物饲料分步发酵过程中乳酸菌菌群数量变化的定量分析
原料为玉米秸秆80g和麸皮20g共100g，含水量为40%，添加的需氧菌为枯草芽孢杆菌、酿酒酵母，添加的乳酸菌为等量的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，需氧菌与乳酸菌的添加量均为原料的5%。采取的发酵方式为分步发酵，即加入需氧菌好氧发酵12h后再添加乳酸菌，立即封包，进行厌氧发酵。共设6个样品，每个样品3个重复，分别提取第0d、1d、2d、3d、5d、7d、10d、15d、20d、25d和30d的样品的DNA，然后根据五种菌各自的特异性引物进行荧光定量PCR反应，反应结束后，计算生物饲料中五种乳酸菌的数量。具体实验设计见表1。
表1实验设计
| 样品 | 原料 | 含水量 | 乳酸菌菌种 |
| A | 玉米秸秆80g+麸皮20g | 40% | 植物乳杆菌 |
| B | 玉米秸秆80g+麸皮20g | 40% | 嗜酸乳杆菌 |
| C | 玉米秸秆80g+麸皮20g | 40% | 长双歧杆菌 |
| D | 玉米秸秆80g+麸皮20g | 40% | 干酪乳杆菌 |
| E | 玉米秸秆80g+麸皮20g | 40% | 鼠李糖乳杆菌 |
| F | 玉米秸秆80g+麸皮20g | 40% | 植物乳杆菌+嗜酸乳杆菌+长双歧杆菌+干酪乳杆菌+鼠李糖乳杆菌 |
具体结果见图1、2、3、4、5。通过检测结果可知，5种厌氧菌同时加入进行发酵可以明显提高发酵饲料中的总菌量，而且混合培养各菌的数量和单独培养各菌的数量接近，表明多菌种共同培养更有应用价值。荧光定量PCR能够快速、准确的定量生物饲料中五种厌氧益生菌的数量，并能清楚反映它们在发酵过程中的变化规律，为生物饲料中乳酸菌菌群的相关研究提供了一种有效检测手段，同时也为优化生物饲料的发酵工艺提供参考。
实施例2：生物饲料同步发酵过程中乳酸菌菌群数量变化的定量分析
采用与实施例1相同的条件，但分步发酵改为同步发酵，即需氧菌和厌氧菌同时加入后直接封包进行发酵。
具体结果见图6、7、8、9和10。通过检测结果可知，需氧菌和厌氧益生菌分步发酵与需氧菌和厌氧益生菌同时加入后同步发酵相对比，从混合添加五种菌的样品F来看，同步发酵测得的五种菌的菌量都比分步发酵测得的菌量大，例如，同步发酵中样品F的植物乳杆菌是分步发酵的2.45倍，嗜酸乳杆菌数量是分步发酵的5.62倍，长双歧杆菌数量是分步发酵的2.24倍，干酪乳杆菌数量是分步发酵的1.91倍，鼠李糖乳杆菌的数量是分步发酵的2.82倍。所以为了简化发酵工艺，如果仅仅考虑厌氧益生菌的菌量，可以考虑将需氧菌和厌氧菌同时加入进行同步发酵。
实施例3：分子生物学实验
3.1细菌的培养与基因组DNA的提取
将标准菌株冻干粉与适量无菌生理盐水充分混合，接种于PDA固体培养基中，然后放置于37℃恒温培养箱内培养48h，然后用无菌的接种环挑取单菌落，接种到MRS培养基中，37℃厌氧培养，活化菌种，直至菌种的OD600值为0.8。
收集培养好的标准菌株新鲜菌体，使用细菌基因组提取试剂盒(上海生工)提取细菌DNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。
3.2引物的设计与合成
运用Primer5.0引物设计软件设计五种乳酸菌的特异性引物，所得引物如表1所示，获得的引物用超纯水稀释到100μM作为储存液，-20℃保存。
表2五种乳酸菌的特异性引物序列及退火温度
3.3普通PCR扩增
将提取得到的基因组DNA进行普通PCR反应，体系为10μL。对普通PCR扩增产物进行电泳，将得到的目的条带进行胶回收，作为荧光定量PCR的模板。
具体的PCR反应体系为10μL：包括PremixTaq5μL，上下游引物各0.4μL，基因组DNA0.3μL，去离子水补足至10μL。
扩增程序为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后以72℃后延伸10min结束。
3.4建立荧光定量PCR扩增体系
定量PCR反应体系为20μL：包含SYBR(R)Green Realtime PCR Master10μL，ROX0.4μL，上下游引物各0.8μL，DNA模板2μL，去离子水补足至20μL。
定量PCR扩增的程序为：先经过95℃预变性30s，之后扩增95℃5s，60℃31s共40个循环。退火时设置荧光信号采集。
将胶回收后的DNA模板进行10倍梯度稀释，绘制标准曲线。由标准曲线可以看出，五种乳酸菌的扩增效率均在90%-110%之间，相关系数R2均大于0.99；，扩增曲线较好，各梯度间的初始循环数差值接近，说明此次荧光定量PCR数据可靠。
3.5特异性试验
以标准菌株基因组DNA为模板，利用五种乳酸菌的特异性引物作引物交叉后进行PCR扩增，用3%琼脂凝胶电泳分析PCR扩增产物，验证引物特异性。
检测结果显示，五种乳酸菌均有特异性扩增，如图11所示。荧光定量PCR的熔解曲线也证实了引物具有特异性，熔解曲线峰值单一，没有其它扩增产物的影响。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (6)
1.一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：生物饲料中基因组DNA的提取：提取生物饲料中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的基因组DNA；
S2：特异性引物的设计：设计植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的特异性引物；
S3：以步骤S1提取的DNA为模板，用步骤S2中设计的特异性引物作为扩增引物进行荧光定量PCR反应，反应结束后，计算所测样品中五种乳酸菌的数量；
其中S2中设计的特异性引物为：
植物乳杆菌：上游引物CAGCACTAGATACCGCCCTG，下游引物ATGTAGTGCCACGGTCGTTT，扩增长度211bp；
嗜酸乳杆菌：上游引物AGACACGGCCCAAACTCC，下游引物GACAACGCTTGCCACCTA，扩增长度231bp；
长双歧杆菌：上游引物GATTCTGGCTCAGGATGAACGC，下游引物CTGATAGGACGCGACCCCAT，扩增长度231bp；
干酪乳杆菌：上游引物CTATAAGTAAGCTTTGATCCGGAGATT T，下游引物CTTCCTGCGGGTACTGAGATGT，扩增长度：133bp；
鼠李糖乳杆菌：上游引物TGCTTGCATCTTGATTTAATTTTG，下游引物GTCCATTGTGGAAGATTCCC，扩增长度317bp。
2. 如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增体系为20μL，包含SYBR(R)Green Realtime PCR Master10μL，ROX 0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，DNA模板2μL，去离子水补足至20μL。
3.如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增的程序为：先经过95℃预变性30s，之后95℃5s，60℃31s，共40个循环。
4. 如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，所述生物饲料中五种乳酸菌基因组DNA的提取方法为：称取1g生物饲料加入9mL的无菌水，摇床振荡10min，使微生物细胞分散，然后静置2-3min；取1mL上清液，10000×g离心2min并重复一次，取1g沉淀放入研钵中，加入液氮充分研磨，加入1mL pH值7.4的0.1mol/L PBS和20μL 20% PVPP，充分均质化后200×g离心5-8min，取上清；沉淀中再加入1mL上述PBS，离心，取上清；合并两次上清，300×g离心5-8min，取上清；再将上清以10000×g离心5-10min，收集菌体，并用PBS洗涤，在得到的菌体中加入300μL裂解液A，其中裂解液A为150mM NaCl，100mM乙二胺四乙酸二钠，pH 8.0、100μL 10%溶菌酶和20μL 1% RNase A,混匀后37℃保温30min，再加入300μL裂解液B及50μL 20% SDS和50μL 20% PVPP，其中裂解液B为100mMNaCl，500mM Tris-HCl, pH 8.0，混匀后冰浴5min，加入等体积的2：24:1体积比的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇,10000×g离心10min，取上清，重复离心取上清；加入上清1/10体积的3M醋酸钠及2倍体积乙醇，-20℃沉淀1.5-2h，10000×g离心15-20min，75%乙醇洗涤一次，超净工作台下干燥沉淀，沉淀用50-100μL TE溶解，其中TE为100mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0，提取的DNA可立即使用也可-20℃冷冻保存备用。
5.如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，所述生物饲料其含水量为30%-55%，发酵温度为28-37℃，发酵时间为0-30d。
6.如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，所述生物饲料中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在发酵前的添加量为0.1%-10%。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190802 |