CN105368944A - 可检测疾病的生物标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可检测疾病的生物标志物，其至少包含如下的微生物之一或其组合：嗜黏蛋白阿克曼氏菌、脆弱类拟杆菌、鲍氏梭菌、哈氏梭菌、梭菌属、共生梭菌、淤泥真杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌、扭链瘤胃球菌、咽峡炎链球菌、婴儿链球菌、粪便拟杆菌、单形拟杆菌、沃氏嗜胆菌以及Clostridiales？sp.SS3/4。本发明还公开了其作为生物标志物用于确定炎症性肠病的用途。本发明进一步公开了检测测定对象中生物标志物的方法、系统及试剂盒。本发明通过对肠道菌群的研究，通过高通量基因测序，筛选出与炎症性肠病相关性高的生物标志物，再利用该标志物准确高效地检测、诊断炎症性肠病，并且进一步用于该疾病的监测治疗效果。

Description

可检测疾病的生物标志物及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及可检测炎症性肠病的生物标志物及其用途。
背景技术
炎症性肠病(IBD)为累及回肠、直肠、结肠的一种特发性肠道炎症性疾病。临床表现腹泻、腹痛，甚至可有血便。本病包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。溃疡性结肠炎是结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症，疾病通常先累及直肠，逐渐向全结肠蔓延,克罗恩病可累及全消化道，为非连续性全层炎症，最常累及部位为末端回肠、结肠和肛周。
该病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用，认为是由多因素相互作用所致，主要包括环境、遗传、感染和免疫因素。
IBD的发病率正在全世界范围内明显上升，IBD已成为一种全球性疾病。传统观点认为，IBD发病率不仅在人种和地域分布上存在明显差异，而且随时间迁移而产生变化。流行病学研究对深入了解全球范围内IBD的发病率、发病机制与早期诊断等，具有重要推动作用。因此，研究导致炎症性肠病主要病因，并建立强有力和易推广的干预措施，遏制人群中炎症性肠病发病率的上升趋势，已成为中国生物医学、营养学领域中亟待解决的科学问题。
由于炎症性肠病的病理成因较多样化，一般认为是由于先天的遗传因素和后天的环境因素共同作用的。对于这些方面的研究有很多，但都不能很好的解释炎症性肠病的发生以及致病机理。目前，对于炎症性肠病的研究仍在进行中，在实际诊断中，医疗人员往往需要采用多种检测手段、数据，以及专业经验，才能较好的确定病因，耗时长、对医务人员和检测设备资源的占用较多。虽然，部分医务人员或学者提出了一些设想，或进行了一些有益的探索，但是截至到目前，依然尚未有一种较为准确、高效的方法，能够实现快速识别、诊断进而有效地治疗炎症性肠病的目的。
现有文献及技术中，均未有记载通过对肠道菌群的研究，筛选出与炎症性肠病相关性高的生物标志物，利用该标志物正确地诊断炎症性肠病，并且进一步用于监测治疗效果的技术方案。
发明内容
针对现有技术的上述不足，提供一种可检测疾病的生物标志物及其应用，以及检测方法、系统和试剂盒，整体上是通过对被检测对象肠道菌群的研究、并进行基因分离测序，筛选出与炎症性肠病相关性高的生物标志物，利用该标志物正确地诊断炎症性肠病，并且进一步用于监测治疗效果的技术方案。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：先天的遗传因素只能解释不到5％的炎症性肠病患者。现有研究所忽视的一个重要的问题就是肠道微生物。肠道微生物是存在于人体肠道中的微生物群落，是人体的“第二基因组”。人肠道菌群和宿主构成一个相互关联的整体，肠道微生物不仅能降解食物中消化的营养成分、宿主维生素以及其他的一些营养物质，还能促进肠上皮细胞的分化与成熟从而激活肠道免疫系统以及调节宿主能量存储与代谢，这些在人体的消化吸收、免疫反应、代谢活性等方面都发挥着重要的作用。肠道菌群还可以控制动物的脂肪代谢、引发全身性的低度慢性炎症，从而导致炎症性肠病的发生，而且这种致病作用远远大于动物自身基因缺陷对发病的贡献。发明人通过对肠道菌群的研究筛选出与炎症性肠病相关性高的生物标志物，并且利用该标志物能够正确地诊断炎症性肠病，并且可以用于监测治疗效果。
为实现上述目的，本发明提出了含有一组可分离的微生物的标志物，具体提供了如下技术方案：
一种可检测疾病的生物标志物，所述生物标志物至少包含如下的微生物之一或其组合：嗜黏蛋白阿克曼氏菌、脆弱类拟杆菌、鲍氏梭菌、哈氏梭菌、Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌、淤泥真杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌、扭链瘤胃球菌、咽峡炎链球菌、婴儿链球菌、粪便拟杆菌、单形拟杆菌、沃氏嗜胆菌、以及Clostridialessp.SS3/4。
本发明提供了所述的可检测疾病的生物标志物作为生物标志物用于确定炎症性肠病中的用途。
所述的可检测疾病的生物标志物，是通过从测定对象中分离出的肠道菌群核酸样本进行基因测序，将所获得的相对丰度值与预定的临界值进行比较，当该相对丰度值大于预定的临界值时，即可确定检测样本足以导致提供者患有炎症性肠病，反之则不能足以导致患有炎症性肠病。
所述的测定对象是被检测者的肠道排泄物。
本发明提供了所述的可检测疾病的生物标志物作为靶点用于筛选治疗或者预防炎症性肠病的药物中的用途。
本发明提供了一种测定对象中生物标志物的方法，包括如下步骤：
1)使用一核酸样本分离装置，从测定对象中分离出上述所述生物标志物的核酸样本；
2)使用一基因测序装置，对所述核酸样本进行测序，获得测序结果；
3)使用一比对装置，将所述测序结果与已知正常水平的基因特征进行比对，同时将所获得的相对丰度值与预定的临界值进行比较，以确定其中是否存在足以导致患有炎症性肠病的可检测生物标志物。
所述步骤(2)中测序装置用于选自Hiseq2000、SOLID、454、和单分子测序装置中的一种。
所述步骤(3)中比对装置为SOAP2和MAQ中的一种。
本发明提供了一种检测炎症性肠病的系统，所述系统包括：
一核酸样本分离装置，所述核酸样本分离装置用于从检测对象中分离核酸样本；
一测序装置，所述测序装置与所述核酸样本分离装置相连，并且用于对所述核酸样本进行测序，以便获得测序结果；
以及一比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连，所述比对装置将所述测序结果与上述所述的生物标志物进行比对，基于比对结果能够确定检测对象中是否存在如权利要求1所述的生物标志物。
本发明提供了一种检测前述生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包含能够结合或基因测序识别样本中上述生物标志的配体。
首先，本发明的第一方面，提出了含有一组可分离的微生物的标志物，根据本发明的实施例，该一组微生物包含嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4中之一或其组合。
本发明具体是通过确定对象肠道菌群中是否存在这些微生物的至少一种，来有效地确定对象是否患有或者易感炎症性肠病，并且可以用于监控炎症性肠病患者的治疗效果。另外，根据本发明的实施例，还可以通过对这些微生物的至少一种在肠道菌群中的相对丰度进行检测，由此，可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值(cutoff)进行比较，从而提高确定对象是否患有或者易感炎症性肠病，以及用于监控炎症性肠病患者的治疗效果的效率。
根据本发明的第二方面，本发明提出了一种检测对象中炎症性肠病的系统。根据本发明的实施例，该检测对象中炎症性肠病的系统包括：核酸样本分离装置，所述核酸样本分离装置用于从所述对象分离肠道菌群核酸样本；测序装置，所述测序装置与所述核酸样本分离装置相连，并且用于对所述核酸样本进行测序，以便获得测序结果；以及比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连，并且用于以这样的方式将所述测序结果与参照基因组进行比对，以便确定所述测序结果中是否存在嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4。利用该方法，可以确定这些微生物在肠道菌群中的相对丰度，由此，可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较，从而提高确定对象是否患有或者易感炎症性肠病，以及用于监控炎症性肠病患者的治疗效果的效率。
根据本发明的第三方面，本发明提出了一种用于确定对象炎症性肠病的试剂盒，用于确定嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4。利用上述试剂盒，可以确定这些微生物在肠道菌群中的相对丰度，由此，可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较，从而提高确定对象是否患有或者易感炎症性肠病，以及用于监控炎症性肠病患者的治疗效果的效率。
根据本发明的第四方面，本发明提出了一种生物标志物作为靶点用于筛选治疗或者预防炎症性肠病的用途。根据本发明的实施例，所述生物标志物包含嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4。根据本发明的实施例，可以利用候选药物使用前和使用后对这些微生物生命力的影响，从而确定候选药物是否可以用于治疗或者预防炎症性肠病。
本发明通过对肠道菌群的研究，通过高通量基因测序，筛选出与炎症性肠病相关性高的生物标志物，再利用该标志物准确高效地检测、诊断炎症性肠病，并且进一步提供了试剂盒，用于该疾病的监测治疗效果。本发明相对于传统的检测、判断方法，速度、效率、准确性均有大幅度的提升，对医生经验的依赖性大幅下降。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图1示出了根据本发明的一个实施例中确定检测对象疾病的系统及方法的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的系统及方法示例在附图1中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
一种可检测疾病的生物标志物，其至少包含如下的微生物之一或其组合：嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4。
所述的可检测疾病的生物标志物，其作为生物标志物用于确定炎症性肠病的用途。
所述的可检测疾病的生物标志物，是通过从测定对象中分离出的肠道菌群核酸样本进行基因测序，将所获得的相对丰度值与预定的临界值进行比较，当该相对丰度值大于预定的临界值时，即可确定检测样本足以导致提供者患有炎症性肠病，反之则不能足以导致患有炎症性肠病。
所述的可检测疾病的生物标志物，所述的测定对象是被检测者的肠道排泄物。
所述的可检测疾病的生物标志物，其作为靶点用于筛选治疗或者预防炎症性肠病的药物的用途。
关于生物标志物。根据本发明的第一方面，本发明提出了炎症性肠病的生物标志物。在本文中，术语“生物标志物”应做广义理解，其包括任何能够反映炎症性肠病的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物，物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物(KO/OG标志物)。其中，基因标志物的含义并不局限于现有可以表达为具有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为DNA，也可以为RNA，可以是经修饰的DNA或者RNA，也可以为未经修饰的DNA或者RNA。
一种测定对象中生物标志物的方法，其包括如下步骤：
1)使用一核酸样本分离装置100，从测定对象中分离出生物标志物的核酸样本；
2)使用一基因测序装置200，对所述核酸样本进行测序，获得测序结果；
3)使用一比对装置300，将所述测序结果与已知正常水平的基因特征进行比对，同时将所获得的相对丰度值与预定的临界值进行比较，以确定其中是否存在足以导致患有炎症性肠病的可检测生物标志物。
所述测定对象中生物标志物的方法，所述测序装置用于选自Hiseq2000、SOLID、454、和单分子测序装置中的一种。
所述测定对象中生物标志物的方法，所述比对装置为SOAP2和MAQ中的一种。
一种检测炎症性肠病的系统，所述系统包括：
一核酸样本分离装置100，所述核酸样本分离装置100用于从检测对象中分离核酸样本；
一测序装置200，所述测序装置200与所述核酸样本分离装置100相连，并且用于对所述核酸样本进行测序，以便获得测序结果；
以及一比对装置300，所述比对装置200与所述测序装置300相连，所述比对装置300将所述测序结果与所述的生物标志物进行比对，基于比对结果能够确定检测对象中是否存在所述的生物标志物。
在本文中基因标志物有时也可以称为特征片段。根据本发明的实施例，运用高通量测序，批量分析健康人群和炎症性肠病患者群的粪便样本。基于高通量测序数据，对健康人群与炎症性肠病患者群进行统计检验，从而确定与炎症性肠病患者群相关的特异性核酸序列。简言之，其步骤如下：样品的收集与处理：收集健康人群与炎症性肠病患者群的粪便样本，使用试剂盒进行DNA提取，得到核酸样本；文库构建和测序：DNA文库构建和测序是利用高通量测序进行，以便得到粪便样品中所包含肠道微生物的核酸序列；通过生物信息学的分析方法，确定与炎症性肠病患者相关的特异性肠道微生物核酸序列。首先，将测序序列(reads)与参照基因集(可以为新构建的基因集或任何已知序列的数据库，例如，采用已知的人肠道微生物群落非冗余基因集)进行比对。接下来，基于比对结果，分别确定来自健康人群和炎症性肠病患者群粪便样品的核酸样本中各基因的相对丰度。通过将测序序列与参照基因集进行比对，可以将测序序列与参照基因集中的基因建立对应关系，从而针对核酸样本中的特定基因，与其相对应的测序序列的数目可以有效地反映该基因的相对丰度。由此，可以通过比对结果，按照常规的统计分析，确定在核酸样本中基因的相对丰度。
最后，在确定核酸样本中各基因的相对丰度后，对来自健康人群和炎症性肠病患者群粪便的核酸样本中各基因的相对丰度进行统计检验，由此，可以判断在健康人群和炎症性肠病人群中是否存在相对丰度有显著差异的基因，如果存在基因是显著差异的，则该基因被当作是炎症性肠病的生物标志物，即基因标志物。
另外，对于已知或新构建的的参照基因集，其通常包含基因物种信息和功能注释，由此，在确定基因相对丰度的基础上，可以进一步通过将基因的物种信息和功能注释进行分类，从而确定肠道菌群中各微生物的物种相对丰度和功能相对丰度，也就可以进一步确定炎症性肠病的物种标志物和功能标志物。
简言之，确定物种标志物和功能标志物的方法进一步包括：将健康人群和的炎症性肠病患者群的测序序列与参照基因集进行比对；基于比对结果，分别确定健康人群和的炎症性肠病患者群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度；对来自健康人群和的炎症性肠病人群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度进行统计学检验；以及分别确定在健康人群和的炎症性肠病患者群的核酸样本之间相对丰度存在显著差异的物种标志物和功能标志物。根据本发明的实施例，可以采用对来自相同物种的基因的基因相对丰度和具有相同功能注释的基因相对丰度进行统计检验，例如加和、取平均值、中位数值等，来确定功能相对丰度和物种相对丰度。最后，确定了在健康人群和炎症性肠病患者群的粪便样品之间相对丰度存在显著差异的微生物，即：嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4其中之一或其组合。由此，通过检测上述微生物中的至少一种或其组合是否存在，来有效地确定对象是否患有或者易感炎症性肠病，并且可以用于监控炎症性肠病患者的治疗效果。
在本文中所使用的术语“存在”应做广义理解，既可以指的是定性分析样本中是否含有相应的目标物，也可以指对样本中的目标物进行定量分析，并且还可以进一步将所得到的定量分析结果与参照(例如通过对具有已知状态的样本进行平行试验所得到的定量分析结果)进行统计学分析或者任何已知数学运算所得到的结果。本领域技术人员可以根据需要和试验条件进行容易的选择。根据本发明的实施例，还可以通过确定这些微生物在肠道菌群中的相对丰度，从而可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较，从而提高确定对象是否患有或者易感炎症性肠病，以及用于监控炎症性肠病患者的治疗效果的效率。
根据本发明的实施例，嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus在健康人(对照组)中被富集，因而在本文中可以统称为有益生物标志物。可以通过检测对象肠道菌群中是否存在上述微生物物种的至少一种来有效地确定对象是否患有或者易感炎症性肠病，并且可以用于监控炎症性肠病患者的治疗效果。
检测对象中炎症性肠病的系统
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种检测对象中炎症性肠病的系统。根据本发明的实施例，该系统包括肠道菌群核酸样品分离装置和生物标志物确定装置。针对不同类型的生物标志物，可以采用相应的肠道菌群核酸样品分离装置和生物标志物确定装置。针对基因标记物，参考图1，根据本发明的实施例，确定对象中炎症性肠病的系统包括：核酸样本分离装置(100)、测序装置(200)以及比对装置(300)。根据本发明的实施例，核酸样本分离装置(100)用于从对象分离肠道菌群核酸样本，测序装置(200)与核酸样本分离装置(100)相连，并且用于对核酸样本进行测序，以便获得测序结果，比对装置(300)与测序装置(200)相连，并且用于以这样的方式将所述测序结果与参照基因组进行比对，以便确定所述对象肠道菌群中是否存在嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4中的至少一种或其组合。
所述参照基因组包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4。利用该系统，能够有效地实施上述确定对象炎症性肠病的方法，从而有效地通过对象中是否存在如下微生物中的一种、或其组合：嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4，从而通过检测对象肠道菌群中是否存在所述标志物来确定对象是否患有或者易感炎症性肠病，并且可以用于监控炎症性肠病患者的治疗效果。
根据本发明的一个实施例，所述核酸样本分离装置用于从所述对象的粪便中分离所述对象的肠道菌群核酸样本。根据本发明的实施例，测序装置并不受特别限制。优选地，所述测序步骤利用第二代测序方法或第三代测序方法进行。优选地，所述测序装置为选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种。由此，能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，从而有利于对后续测序数据进行分析，尤其是进行统计学检验时的精确性和准确度。
根据本发明的一个实施例，所述比对装置利用选自SOAP2和MAQ的至少一种进行所述比对。由此，可以提高比对的效率，进而可以提高检测炎症性肠病例如炎症性肠病的效率。对于物种标志物和功能标志物，本领域技术人员还可以通过常规的菌种鉴别手段和生物活性检验手段来确定在肠道菌群中存或者消失所述物种和功能。例如，菌种鉴别可以通过进行16srRNA进行。
其他
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种用于确定对象炎症性肠病的试剂盒。一种检测前述生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包含能够结合或基因测序识别在样本中可检出炎症性肠病生物标志的配体和报告手段。根据本发明的实施例，该试剂盒包含用于检测前述生物标志物的至少一种的试剂、配体，并设有报告手段。例如对于基因标志物，该试剂盒包含用于检测嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4的至少一种的试剂。利用该试剂盒，能够有效地确定通过对象中是否存在嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/4中的至少一种或其组合而确定对象的炎症性肠病。
另外，根据本发明的实施例，本发明还提出了一种药物筛选方法。由此，根据本发明实施例，炎症性肠病密切相关的标志物作为药物设计靶点来进行药物的筛选，促进新的炎症性肠病药物的发现。例如，可以通过检测与候选药物接触前后，生物标志物水平的变化，来确定候选药物是否可以作为治疗或预防炎症性肠病的药物。例如，检测有害生物标志物水平在接触药物候选物之后是否有所降低，有益生物标志物水平在接触药物候选物之后是否有所升高。另外，还可以通过确定药物对嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansiamuciniphila、脆弱类拟杆菌Bacteroidesfragilis、鲍氏梭菌Clostridiumbolteae、哈氏梭菌Clostridiumhathewayi、梭菌属Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌Clostridiumsymbiosum、淤泥真杆菌Eubacteriumlimosum、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius、扭链瘤胃球菌Ruminococcustorques、咽峡炎链球菌Streptococcusanginosus、婴儿链球菌Streptococcusinfantis、粪便拟杆菌Bacteroidesstercoris、单形拟杆菌Bacteroidesuniformis、沃氏嗜胆菌Bilophilawadsworthia、以及梭菌目Clostridialessp.SS3/中4的至少一种或其组合的生物活性的直接影响或间接影响来对候选化合物是否可以作为治疗或预防II炎症性肠病的药物来进行筛选。由此，根据本发明的实施例，本发明还提出了根据炎症性肠病生物标志物在筛选治疗或预防炎症性肠病的药物中的用途。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1：
样品收集
所有411个粪便样品分别采自411个志愿者，由中国深圳罗湖医院进行粪便样品的采集。以WHO发布的标准进行炎症性肠病诊断，诊断出的炎症性肠病患者作为病例组，其他非炎症性肠病个体作为对照组(见表1)。炎症性肠病患者和正常人需要提供冷冻的粪便样本。志愿者在采样前3天需注意饮食，宜饮食清淡，不宜食用高油脂类食物；且在取样前5天不要食用酸奶等乳酸制品及益生元，在采集粪便样品时需注意不要混入尿样，并注意取样时尽量隔绝人体污染及空气。
实施例2：DNA提取及测序
2.1粪便样品的存储
将取好的粪便样品放入灭菌后的粪便收集管，立即存储于冷冻室将粪便样本冷冻。冷冻的样本被送到保存点后，保存于-80℃直至使用。
2.2DNA提取
每份分别取200mg冷冻粪便样品，悬浮于含250μL硫氰酸胍、0.1MTris(pH7.5)和40μL10％月桂酰肌氨酸的溶液中。DNA提取方法与前述相同(Manichanh,C.etal.ReduceddiversityoffecalmicrobiotainCrohn'sdiseaserevealedbyametagenomicapproach.Gut55,205-211,doi:gut.2005.073817[pii]10.1136/gut.2005.073817(2006)，通过参照将其并入本文)。DNA浓度及分子量大小分别采用Nanodrop仪器(ThermoScientific)和琼脂糖凝胶电泳进行测定。
2.3DNA文库构建及测序：
按照测序仪器(IlluminaGenomeAnalyzerIIx测序平台)制造商Illumina公司提供的操作指南构建DNA文库。利用与其他地方描述的相同的流程进行簇生成、模板杂交、等温扩增、线性化、阻断变性以及与测序引物杂交等过程。
对于每个样品，构建插入长度为350bp的双末端(paired-end,PE)测序文库，通过高通量测序获得2000万对PE测序序列。这些测序序列的长度为75～90bp(第一期样品测序序列长度为75bp和90bp；第二期样品测序序列长度为90bp)。
实施例3：生物标志物的鉴定
3.1测序数据的基本处理
获得第一期145个样品的测序数据以后，对其进行过滤，即去除含‘N’的低质量序列、接头污染序列和宿主基因组污染序列，最终获得378.4Gb高质量数据。平均来说，高质量数据占全部数据的98.1％。另外，PE文库的实际插入长度介于313bp和381bp之间。
3.2更新基因集
使用与MetaHIT基因集相同的参数(JunjieQin,RuiqiangLi,JeroenRaes,etal.(2010)Ahumangutmicrobialgenecatalogueestablishedbymetagenomicsequencing.Nature,464:59-65，通过参照将其并入本文)，在第一期分别利用SOAPdenovov1.0642和GeneMarkv2.743对测序序列进行从头组装和基因预测；然后用BLAT软件将所有预测的基因进行比对，如果一条序列与另一条序列超过90％的长度相似性高于95％(不允许空隙)，即可认为是冗余序列，需要去除。去冗余后，构建出一个含有2,088.328个基因的非冗余参考基因集，也即非冗余参照基因集。样本采自中国人，需要在样品中构建新的基因集并补充到原来的3.3M欧洲人肠道基因集上(MetaHIT)。更新后的基因集包含4,267,985个预测的基因，其中1,090,889个基因为新补充的基因集。
3.3基因的物种分类
通过将420万个基因中的每个基因与IMG(v3.4)数据库中的参考微生物基因组进行BLASTP比对，得到从比对得到属水平的物种分类，比对相似度85％作为属水平的物种分类的临界值，比对覆盖度(即丰度)80％作为属水平的物种分类的临界值(Arumugam,M.etal.Enterotypesofthehumangutmicrobiome.Nature473,174-180,doi:10.1038/nature09944(2011)，通过参照将其并入本文)。对于每个基因，其比对相似度和比对覆盖度大于上述两个临界值后，就进行属水平的物种分类。对于门水平的物种分类，比对的相似度65％作为门水平的物种分类的临界值。更新后的基因集中21.3％的基因被分类到属水平，覆盖26.490.6％(平均61.2％)的样品测序数据，其余的基因来自目前仍没被鉴定出来的未知物种。
3.5宏基因组定量分析
3.5.1计算基因的相对丰度
使用SOAP2将来自每个样本高质量的测序序列与非冗余参考基因集进行比对，比对标准为“相似性>90％”。在基于测序的图谱分析中，只有两种比对情况被接受：i).插入长度正确的双末端测序序列都可以完整地匹配到某个基因上；ii)双末端测序序列中的其中一条匹配到某个基因的尾部，另一个匹配到基因外部。在这两种情况下，匹配上的测序序列都算做一个拷贝。
3.5.2图谱准确性评估
采用Audic和Claverie(1997)的方法(Audic,S.&Claverie,J.M.Thesignificanceofdigitalgeneexpressionprofiles.GenomeRes7,986-995(1997)，通过参照将其并入本文)对相对丰度估计(relativeabundanceestimate)的理论精确性进行评估。假设从基因i获得了xi个测序数据，其只占据了样品全部测序数据中的一小部分，通过泊松分布(Poissondistribution)对xi的分布进行估计。将样品中全部测序数据(reads)的数目记录为N，则N＝Σtxt。假设所有的基因都是相同长度的，则基因i的相对丰度值ai可以简单地表示为xt＝xt/N。进而，发明人可以按照下列公式评估从相同的基因i获得yi个测序数据的期望概率，其中，a′t＝yt/N表示由yt个测序数据计算得到的相对丰度。根据该公式，发明人通过设定at为0.0～1e-5，设定N为0～4000万，以便计算a′i的99％置信区间，并且进一步评估检测误差率。
3.5.3构建基因、KO和OG图谱
更新后的基因集含有4,267,985个非冗余基因，其可以被分入6,313个KOs(KEGG同源群)和45,683个OGs(eggNOG同源群，包括7,042个新的基因家族)中。首先去除在第一期的所有145个样品中仅在少于6个样品中出现的基因、KOs或OGs。为了减少MGWAS统计分析的维数，在构建基因图谱时，鉴定高度相关的基因对，并随后，使用分层聚类算法(straightforwardhierarchicalclusteringalgorithm)对这些基因进行聚类分析。如果在任意两个基因之间的Pearson相关系数为>0.9，则为这两个基因分配边界。这样，A集群和B集群就不会被聚类在一起，如果A和B之间边界(edge)的总长度小于|A|*|B|/3，其中|A|和|B|分别是A和B所包含基因的长度(size)。在基因连锁群中仅选择最长的基因代表该群，由此产生了总计1,138,151个基因。这1,138,151个基因以及他们在第一期的145个样品中的相对丰度的相关测量值用于建立基因图谱(geneprofile)，进而用于关联分析。对于KO图谱(KOprofile)，利用最初4,267,985个基因的基因注释信息，把来自相同KO的基因的相对丰度求和，得到的总的相对丰度作为该KO在样品中的含量，以便产生145个样品的KO图谱。利用与KO图谱相同的方法，构建OG图谱(OGprofile)。
3.6肠型划分
评价属水平的相对丰度的方法与构建KO图谱的方法一样，然后利用属水平的相对丰度来对中国样本进行肠型划分。发明人利用肠型划分原始文本中记载的相同的鉴定方法(Arumugam,M.etal.Enterotypesofthehumangutmicrobiome.Nature473,174-180,doi:10.1038/nature09944(2011)，通过参照将其并入本文)。在本研究中，样本聚类使用Jensen-Shannon距离。
3.7MGWAS统计学分析
3.7.1置换多元方差分析(PERMANOVA)
通过置换多元方差分析的方法(PermutationalMultivariateAnalysisOfVariance，PERMANOVA，McArdle,B.H.&Anderson,M.J.FittingMultivariateModelstoCommunityData:ACommentonDistance-BasedRedundancyAnalysis.Ecology82,290-297(2001)，通过参照将其并入本文)，用来估计每一个变量(包括年龄，性别，炎症性肠病，BMI和肠型)对4种图谱的影响情况。发明人一共进行10000次置换检验(Zapala,M.A.&Schork,N.J.Multivariateregressionanalysisofdistancematricesfortestingassociationsbetweengeneexpressionpatternsandrelatedvariables.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica103,19430-19435,doi:10.1073/pnas.0609333103(2006)，通过参照将其并入本文)，如果p<0.05，认为该环境因素对肠道微生物有影响。在总体检验显著的情况下，发明人再筛选与炎症性肠病相关的标记物。
3.8筛选生物标志物
在第一期，基于第一期经过种群校准的基因的相对丰度谱和功能的相对丰度谱(KO和OG)，进行双边Wilcox秩和检验，同时根据评估阳性错误率(FDR)，校准多重检验。最终通过检验的基因为生物标志物。最后，发明人采用聚类方法对基因进行聚类，得到物种标志物(MLG)。对基因标志物、功能标志物(KO和OG)和物种标志物进行StudentT检验。为了从结构上整理分析大量的宏基因组数据，减少信息量以便进行分类描述，设计分类学的概念MLG(MetagenomicLinkageGroup，宏基因组连锁群，也称为候选物种)代替宏基因组物种的概念，这里一个MLG指的是在宏基因组的一组遗传物质,可能是作为一个单元链接，而不是独立分布的。这样，在研究中则可不需要完全确定在宏基因组中特定的微生物物种，这些都是重要的大量的未知的生物，细菌之间有频繁的横向基因转移(LGT，frequentlateralgenetransfer)。使用基因图谱，一个MLG定义为一组共同存在于不同个体样品的基因，并且具有一致的丰度和物种分类水平。
3.9鉴定宏基因组连锁群(MLG)
3.9.1用于鉴定MLG的聚类方法
在本发明中，发明人设计了宏基因组连锁群(MLG)的概念，有利于对来自全基因组鸟枪法测序获得的宏基因组测序数据进行分类描述。从炎症性肠病相关基因标记物中鉴定MLG包括以下三个步骤：
步骤1:选择炎症性肠病相关基因标记物的原始组作为基因的起始子聚类(initialsubcluster)。需要注意的是，在建立基因图谱时，发明人构建了基因连锁群，以减少统计学分析的维数。因此，所有来自基因连锁群(genelinkagegroup)的基因都被认为是子聚类。
步骤2：采用Chameleon算法(Karypis,G.&Kumar,V.Chameleon:hierarchicalclusteringusingdynamicmodeling.Computer32,68-75(1999)，通过参照并入本文)，利用动态建模技术和基于相互关联性(interconnectivity)以及相近性(closeness)，对展现出最小相似性>0.4的子聚类进行组合。这里的相似性是由相互关联性和相近性的乘积定义的(该定义运用于MLG鉴定的整个分析过程中)。并将这些聚类定义为半-聚类(semi-cluster)。
步骤3：为了将步骤2中所建立的半-聚类进行合并。在步骤3中，首先更新任意两个半-聚类之间的相似性，并随后对每个半-聚类进行物种分类(taxonomicassignment，具体方法见下)。最后，将满足下面两个要求的两个或者更多个半-聚类进行合并为MLG：a)半-聚类之间的相似性>0.2；b)所有这些半-聚类都被分配自相同的分类谱系(taxonomylineage)。
3.9.2MLG的物种分类
将所有来自MLG的基因在核苷酸水平(通过BLASTN)与参考微生物基因组(IMG数据库，v3.4)进行比对，并且，在蛋白质水平(通过BLASTP)上比对至NCBI-nr数据库(2012年12月版本)。利用e-value(核苷酸水平<1×10-10，蛋白质水平<1×10-5)和比对覆盖率(覆盖>70％的检索序列)对比对结果进行过滤。通过与参考微生物基因组的比对，每一个MLG都可以找到一些物种和它对应，将这些物种按照MLG在它中的基因含量比例进行排序，同样可以获得比对的平均相似度。通过下面的原则确定MLG的物种分类：1)如果该MLG中超过90％的基因可以映射至参考基因组，并且在核苷酸水平上阈值为95％，则认为该特定MLG为来自于该已知的细菌物种；2)如果该MLG中超过80％的基因可以映射至参考基因组，并且在核苷酸水平和蛋白质水平上阈值为85％，则认为该特定MLG为来自于该已知的细菌物种的同一个属；3)如果可以从MLG组装结果鉴定16S序列，则通过RDP-Classifier进行多进化树分析(bootstrapvalue>0.80)(Wang,Q.,Garrity,G.M.,Tiedje,J.M.&Cole,J.R.NaiveBayesianclassifierforrapidassignmentofrRNAsequencesintothenewbacterialtaxonomy.ApplEnvironMicrobiol73,5261-5267,doi:AEM.00062-07[pii]10.1128/AEM.00062-07(2007)，通过参照并入本文)，然后如果来自16S序列的种系型(phylotype)与来自基因的一致，则为MLG定义物种分类。
3.9.3对MLG进行深度组装
为了重新构建潜在的细菌基因组，发明人设计了额外的方法对每个MLG进行深入组装，其包括四步：
步骤1:从MLG提取基因作为种子(Seed)，鉴定在所有样品中以最高丰度含有该种子的样品，然后从这些样品选择双末端测序数据，其可以被匹配到种子上(包括仅一端可以被匹配的双末端测序)。这些双末端测序数据覆盖率的下限是在不超过5个样品中为50×，其可以通过将选定的测序数据的总数目除以种子的总长度来计算得到。
步骤2:通过使用SOAPdenovo借助用于构建基因类型所使用的参数，对步骤1中所选中的测序序列进行从头组装。
步骤3:为了鉴定和除去可能由被污染的序列造成的错配重叠群(contig)，采用基于组成特征的聚类方法(composition-basedbinningmethod)。将GC含量和测序深度值与组装结果中其他重叠群(contig)不同的重叠群(contig)从组装结果中除去，因为他们可能是由于各种原因被错误组装的。
步骤4:从步骤3，获得最终组装结果，重复步骤2，直到组装不再有明显改进(具体的，总重叠群(contig)长度的提高低于5％)。
3.10基于MLG的分析
3.10.1MLG方法的有效性通过下列步骤评估MLG鉴定方法的性能：1)在发明人定量的基因结果中，首先过滤很少出现的基因(在小于6个样品中出现)；2)基于在更新的基因集中的物种分类结果，鉴定了一组肠道细菌菌种，其标准为含有1,000～5,000个唯一匹配的基因，其中，相似性阈值为95％。在该步骤，人工去除了一个物种内的冗余菌株，并且丢弃了可以匹配至多个物种的基因。最后，来自50个细菌菌种的130,065个基因被鉴定作为用于评价MLG方法有效性的测试组；3)针对测试组进行上面描述的标准MLG方法。对于每个MLG，发明人计算了并非来自主要物种(majorspecies)的基因的百分比，作为精度。
3.10.2MLG的相对丰度
通过使用来自MLG的基因的相对丰度值，评估该MLG在所有样品中的相对丰度。对于该MLG，首先去除了分别于最高和最低相对丰度差异在5％以内的基因，然后对其他进行与泊松分布的拟合。泊松分布的预计平均值被解释为该MLG的相对丰度。最后，获得了所有样品的MLG图谱(MLGprofile)，用于下列分析。
实施例4：生物标志物的两步验证
4.1数据分析
利用第二期199个样品，重复实施例1和实施例2中的步骤，获得测序数据，并且重复实施例3中的步骤，获得基因相对丰度谱、物种相对丰度谱及功能相对丰度谱。
4.2验证生物标志物
在第一期，发明人基于第一期经过种群校准的基因的相对丰度谱和功能的相对丰度谱(KO和OG)，进行双边Wilcox秩和检验；并且在第二期，发明人基于原始基因和功能(KO和OG)相对丰度谱和第一期基因方向所确定的一边，进行单边Wilcox秩和检验。同时根据评估阳性错误率(FDR)，校准多重检验。最终通过检验的基因为生物标志物。最后，发明人采用聚类方法对基因进行聚类，得到物种标志物(MLG)。对基因标志物、功能标志物(KO和OG)和物种标志物进行StudentT检验。发明人接着在第二期分析中对阳性错误率(FDR)进行控制。从对应FDR为2.5％(P<0.01)的基因中确定出共52,484个炎症性肠病关联基因标记物。应用同样的两步分析法对KO图谱和OG图谱进行分析，从而鉴定出与炎症性肠病相关1,345个KO标记物(P<0.05,FDR4.5％)及与炎症性肠病相关5,612个OG标记物(P<0.05,FDR6.6％)。
4.3物种标志物的预测分析
4.3.1物种预测系统
使用物种的相关丰度作为风险值，估计曲线下面积AUC(MichaelJ.Pencina,RalphB.D'AgostinoSr,RalphB.D'AgostinoJr,etal.Evaluatingtheaddedpredictiveabilityofanewmarker:FromareaundertheROCcurvetoreclassificationandbeyond.Statisticsinmedicine,2008,27(2):157-172，通过参照并入本文)，AUC越大，表示诊断能力越高，评价基因对炎症性肠病的诊断能力。对于每一个物种，确定一个诊断的临界值(cutoff)，使得在这个临界值下，诊断的敏感度跟特异度的和最高。临界值的详细确定方法如下：将物种的相对丰度从小到大排序，然后顺序取一个值出来作为候选临界值，在这个候选临界值下算出敏感度和特异度，将敏度度和特异度求和最大的候选临界值作为最终的最优临界值。对于有益物种，相对丰度值小于临界值就被诊断为炎症性肠病；对于有害物种，相对丰度值大于临界值就被诊断为炎症性肠病。
4.3.2全局预测系统
前面，发明人已经构建了对物种的预测系统。接下来，发明人使用所有的物种标志物，构建一个综合指标，对样品疾病进行预测。通过上述所有样品的综合得分，估计ROC(receiver-operatingcharacteristic)曲线下面积AUC(AUC越大，表示诊断能力越高)，评价综合得分对炎症性肠病的诊断能力。确定一个诊断的临界值(cutoff)，使得在这个临界值下，诊断的敏感度跟特异度的和最高。当样品中炎症性肠病人的平均综合得分比非炎症性肠病人的平均综合得分高时(cutoff的方向定义为1)，待预测样品的综合得分大于临界值就被诊断为炎症性肠病，否则为非炎症性肠病；当样品中炎症性肠病人的平均综合得分比非炎症性肠病人的平均综合得分低时(cutoff的方向定义为0)，待预测样品的综合得分小于临界值就被诊断为炎症性肠病，否则为非炎症性肠病。411个样品的综合得分临界值(cutoff)、综合得分以及他们的炎症性肠病预测判别情况。
实施例5：疾病相关微生物基因组的重建
5.1深度组装
利用实施例3中的方法建立MLG深度组装，重建微生物基因组与疾病的关系。
5.2微生物基因组的鉴别
根据获得的微生物的基因组，利用实施例3中的方法构建MLG物种分类(水平)信息。为了验证菌株对喂食不同食物的小鼠的影响，喂食有益菌菌剂的肠炎模型组小鼠的症状相比对照组有明显的改善，见表1。
表1：MLG物种分类(水平)信息(预测结果：1表示诊断为炎症性肠病，0表示诊断为非炎症性肠病。)
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims (8)

1.一种可检测疾病的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物至少包含如下的微生物之一或其组合：嗜黏蛋白阿克曼氏菌、脆弱类拟杆菌、鲍氏梭菌、哈氏梭菌、Clostridiumsp.HGF2、共生梭菌、淤泥真杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌、扭链瘤胃球菌、咽峡炎链球菌、婴儿链球菌、粪便拟杆菌、单形拟杆菌、沃氏嗜胆菌、以及Clostridialessp.SS3/4。
2.如权利要求1所述的可检测疾病的生物标志物作为生物标志物用于确定炎症性肠病中的用途。
3.如权利要求1所述的可检测疾病的生物标志物作为靶点用于筛选治疗或者预防炎症性肠病的药物中的用途。
4.一种测定对象中生物标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使用一核酸样本分离装置，从测定对象中分离出如权利要求1所述生物标志物的核酸样本；
(2)使用一基因测序装置，对所述核酸样本进行测序，获得测序结果；
(3)使用一比对装置，将所述测序结果与已知正常水平的基因特征进行比对，同时将所获得的相对丰度值与预定的临界值进行比较，以确定其中是否存在足以导致患有炎症性肠病的可检测生物标志物。
5.根据权利要求4所述测定对象中生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中测序装置用于选自Hiseq2000、SOLID、454、和单分子测序装置中的一种。
6.根据权利要求4所述测定对象中生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中比对装置为SOAP2和MAQ中的一种。
7.一种检测炎症性肠病的系统，其特征在于，所述系统包括：
一核酸样本分离装置，所述核酸样本分离装置用于从检测对象中分离核酸样本；
一测序装置，所述测序装置与所述核酸样本分离装置相连，并且用于对所述核酸样本进行测序，以便获得测序结果；
以及一比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连，所述比对装置将所述测序结果与如权利要求1所述的生物标志物进行比对，基于比对结果能够确定检测对象中是否存在如权利要求1所述的生物标志物。
8.一种检测如权利要求1所述生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含能够结合或基因测序识别样本中如权利要求1所述生物标志物的配体。
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