CN108078540B - 一套可筛检疾病相关菌群的菌群互作网络标志物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一套可筛检疾病相关菌群的菌群互作网络标志物及其用途，所述标志物由15种特殊的三角形互作网络基序构成。本发明以菌群细菌物种组成及各细菌物种相对丰度为输入，基于菌群互作网络和15种特殊的三角形互作网络基序，根据统计得到的目标标记物数量和待测菌群与正常菌群剩余目标标记物的数值比值(RDHT)，对待测菌群是否异常做出判断。本发明经多组人体包括肠道、阴道、肺、口腔、精液及皮肤6个部位的微生物菌群数据验证，发现菌群互作网络中特殊的三角形互作网络基序数量在实验组/疾病组与健康对照间存在显著差异，利用本发明能有效快速地对健康和疾病菌群进行筛检。

Description

一套可筛检疾病相关菌群的菌群互作网络标志物及其用途

技术领域

本发明涉及生物信息技术和医疗健康领域，具体地涉及一套可筛检疾病相关菌群的菌群互作网络标志物以及以此为基础筛检疾病相关菌群装置。

背景技术

人体共生菌是人体的正常菌群，皮肤、口腔、肠道、呼吸道及泌尿生殖道等部位都生存着大量的微生物。人体微生物菌群与宿主的健康和疾病有着密切的关系，与此同时人体的健康状况也影响着机体微生物菌群的组成和稳定。随着人体微生物宏基因组计划(Human Microbiome Project，HMP)的开展实施，越来越多的研究表明微生物菌群与人体多种疾病，如结肠癌、肺纤维化、牙周炎、乳腺炎、细菌性阴道病及皮炎等疾病的发生发展有着紧密联系，这些疾病也被称为“微生物菌群相关疾病”。这些疾病多面临着缺乏早期诊断指标和更为方便可靠的个性化诊断方法等问题，因此寻找一种可以同时运用于多种疾病的个性化诊断方法是十分重要的。

通过人体微生物菌群不仅能够更进一步寻找微生物相关疾病发生发展的根源，还可以用于疾病的个性化诊断和防治。人体微生物菌群作为一个微观生态系统，现有研究多从生态学角度利用生态学理论和方法对其加以研究，其中物种多样性是最常用的研究手段。然而大量研究显示健康个体与疾病个体间微生物物种的多样性指数，如物种丰度、Shannon指数等多无显著差异，因此无法广泛的用于多种疾病的诊断机体健康状况的评估。基于多样性的生态学方法多着眼于物种数量本身，却忽略了物种间的相互作用，而物种间的相互作用对外界环境或宿主环境的改变会有更为灵敏的应变能力。

网络分析虽已广泛应用于计算生物学和生物信息学中，如基因网络、蛋白质网络、代谢网络等，但在微生物菌群研究中应用仍比较局限。网络分析基于物种的个体数量或丰度寻找物种间的相互作用关系，不但包括了传统生态分析中的物种丰度还加入了菌群中的互作关系，可弥补微生物生态中多样性分析等传统生态分析的不足。现已有研究成功地将网络分析应用于人体微生物菌群当中。传统的网络属性如网络密度等多忽略了网络中顶点的信息，在微生物菌群网络中每个顶点代表一个物种，疾病和健康机体的菌群互作网络即使结构相同，物种间的相互作用关系却有可能不同。在基本网络的分析上，包含物种信息在内的网络属性可以提高诊断指标和检测方法的准确率和灵敏度。

本发明的目的在于针对机体健康评估及微生物菌群相关疾病的个性化诊断，提出并验证了一种基于人体菌群互作网络分析评估机体健康状况和诊断疾病的方法，通过对已有文献的分析和大量实验的结果，找出了15种特殊的网络基序作为微生物菌群互作网络的一种新属性。通过监控机体菌群网络中该属性的变化情况可以为评估机体健康状况和疾病发生风险提供更为有效的微生物方法，也为个性化诊断微生物菌群相关疾病提供可靠的技术支持。

发明内容

本发明的目的在于针对机体健康评估及包括肥胖等疾病在内的微生物菌群相关疾病的个性化诊断，提出并验证一种基于人体菌群互作网络分析评估机体健康和诊断疾病的方法，为利用人体微生物对人体健康状况进行评估和对微生物相关疾病进行诊断提供有效的方法和可靠的指标。

为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

通过查找和筛选获取6组微生物数据，分别代表了肠道、口腔、皮肤、肺、阴道和男性生殖道腺等6个人体部位的微生物，数据来源和信息为：McHardy等人2013年公开发表的HIV阳性和阴性者肠道的微生物数据；Lazarevic等人2010年公开发表的吸烟者和不吸烟者的口腔唾液微生物数据；Kong等人2012年公开发表的特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)患者和健康人的皮肤微生物数据；Fodor等人2012年公开发表的肺纤维化患者急性加重期和接受治疗后呼吸道的微生物数据；Srinivasan等人2012年公开发表的细菌性阴道病(bacterial vaginosis，BV)患者和健康女性的阴道微生物数据；以及Hou等人2013年发表的男性不孕不育患者和健康男性的精液微生物数据。

以微生物物种丰度(即每个物种对应的测序内容)为基础，分别计算6组数据中疾病组和健康组各物种或各操作分类单元(operation taxonomic unit，OTU)间的相关系数，选取p≤0.05相互作用关系，利用标准网络分析软件，如Cytoscape软件或iGraph软件，构建菌群互作网络图。

基于上述步骤构建的菌群互作网络，寻找各组中如表1所示的15种特殊的trios。表中图例代表基序结构模型，每一个网络节点代表一个微生物物种或操作分类单元(operation taxonomic unit，OTU)，实心节点为具有特殊功能OTU，空心节点代表普通OTU。特殊功能节点代表菌群中丰度最高的物种，或在菌群中占主导地位的物种，或在菌群互作网络中拥有最多相互作用关系的物种。边为两个节点所表示的OTU间的相互作用关系，特殊功能节点分支表示特殊功能节点与由普通节点组成的三角形trios相连接的边。表中“+”号表示正相互作用关系，“-”表示负相互作用关系，表1.1中的“+”和“-”表示三角形trios中三条边的互作关系情况，表1.2中的“+”和“-”表示特殊功能节点分支的互作关系情况。15种trios共分为两大类，一类为不含特殊功能节点分支的三点trios，另一类为带有特殊功能节点分支的四点trios。在本发明中，所采用的特殊功能点均为在菌群中丰度最高的OTU(most abundance OTU，MAO)。前者依据点间相互作用的正负关系分为I、II、III和IV四个型，其中I型和II型中又通过2个非MAO节点间的正负关系分为A和B两个亚型；后者根据与MAO直接作用关系或边的条数，分为SLM、DLM和TLM三个子型，又依据与MAO直接作用关系的正负情况分为若干亚型。

表1.1 6种无特殊顶点分支的网络基序的结构信息

表1.2 9种有特殊顶点分支的网络基序的结构信息

通过比较6组数据中疾病组与健康组菌群互作网络中各型trios的数量，发现这些网络结构在疾病患者与健康人间存在显著的差异。通过检测菌群互作网络中trios的数量可以检测一个机体的健康状况，特定机体部位菌群互作网络的trios数量的改变还可以用于诊断微生物相关的疾病。该方法为利用人体微生物评估人体健康状况提供了方法和指标，也为疾病的早期诊断和防治做出了一定贡献。

本发明的有益效果在于提供了一套可筛检疾病相关菌群的菌群互作网络标志物以及应用该套互作网络标志物制备筛检疾病相关菌群装置。利用本发明能有效快速地对健康和疾病菌群进行筛检，为机体健康和疾病发生风险评估提供了有效的参考指标，为个性化诊断微生物菌群相关疾病提供了可靠的技术支持。

附图说明

图1本发明的实施流程。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：比较HIV阳性和阴性者肠道菌群网络中特殊trios数量

本发明的计算流程如附图图1所示

数据来源：

McHardy等人2013年公开发表的HIV阳性和阴性者肠道的微生物数据，样本采自20名未接受过抗逆转录病毒治疗的HIV患者和20名健康人肠道粘膜。利用通用引物从样本DNA中扩增出16S rDNA片段，利用Illumina HiSeq 2000测序平台进行测序，通过后续的生物信息学分析得到97％相似性的微生物操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，其中每个OTU代表代表一个物种，每一个样本中该OTU的测序内容代表该OTU在该样本内的物种丰度。

构建肠道菌群互作网络：

以OTU丰度为基础，分别计算HIV阳性组和HIV阴性对照组肠道菌群内OTU间的Spearman相关系数R，选取p≤0.05相互作用关系，其中相关系数R＜0表示OTU间为负相互作用关系，R＞0表示OTU间为正相互作用关系。

输出HIV阳性和阴性者肠道菌群网络中三角基序的数量及RDHT值：

输出肠道菌群互作网络中15种三角基序的数量，结果如表2所示，除II型外，HIV阳性患者菌群网络中其余各型三角基序的数目均小于HIV阴性对照组。如果一类疾病的产生对机体菌群无任何影响，那么该疾病患者菌群网络中三角基序数量应与健康人相近，此时疾病组tiros数量与健康组三角基序数量的比值(ratio of diseased to healthy三角基序，RDHT)为1。分别计算每型三角基序的RDHT值，结果如表2所示，RDHT值均小于1，其中I、II、SLM、DLM和TLM型的RDHT均远小于1，表明HIV阳性患者与HIV阴性患者相比肠道菌群互作网络三角基序存在显著差别。

表2.HIV阳性组和HIV阴性组微生物菌群互作网络中三角基序的数量

实施例2：比较吸烟者和不吸烟者的口腔菌群互作网络中特殊trios数量

本发明的计算流程如附图图1所示

数据来源：

Lazarevic等人2010年公开发表吸烟者和不吸烟者的口腔唾液微生物数据，在29天内分别在三个时间点采集两名不吸烟个体和3名吸烟个体的口腔唾液样本。利用通用引物从样本DNA中扩增出16S rDNA片段，在Genome Sequencer FLX系统对序列进行测序，通过后续的生物信息学分析得到97％相似性的微生物操作分类单元(operational taxonomicunit，OTU)，其中每个OTU代表代表一个物种，每一个样本中该OTU的测序内容代表该OTU在该样本内的物种丰度。

构建口腔菌群互作网络：

以OTU丰度为基础，分别计算吸烟组和不吸烟组口腔唾液菌群内OTU间的Spearman相关系数R，选取p≤0.05相互作用关系，其中相关系数R＜0表示OTU间为负相互作用关系，R＞0表示OTU间为正相互作用关系。

输出吸烟者和不吸烟者的口腔菌群网络中三角基序的数量及RDHT值：

输出口腔菌群互作网络中15种三角基序的数量，结果如表3所示，除II型和III型外，吸烟者口腔菌群网络中I-A型、IV型、DLM-II型、DLM-III型、TLM-III型和TLM-IV型三角基序的数目明显高于不吸烟者，I-B型和SLM型三角基序数量低于不吸烟者。分别计算每型三角基序的RDHT值，结果如表3所示，所有RDHT值均远远偏离1，表明吸烟者与不吸烟这相比口腔菌群互作网络种这些三角基序数量存在显著差别。

表3.HIV阳性组和HIV阴性组微生物菌群互作网络中三角基序的数量

实施例3：比较AD患者和健康人的皮肤菌群互作网络中特殊trios数量

本发明的计算流程如附图图1所示

数据来源：

Kong等人2012年公开发表的AD患者和健康人的皮肤微生物数据，样本采自12名年龄在2-15岁之间的AD患者和11名健康人的皮肤样本。利用通用引物从样本DNA中扩增出16SrDNA片段，经测序后，通过生物信息学分析得到97％相似性的微生物操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，其中每个OTU代表代表一个物种，每一个样本中该OTU的测序内容代表该OTU在该样本内的物种丰度。

构建皮肤菌群互作网络：

以OTU丰度为基础，分别计算AD组和健康组皮肤菌群内OTU间的Spearman相关系数R，选取p≤0.05相互作用关系，其中相关系数R＜0表示OTU间为负相互作用关系，R＞0表示OTU间为正相互作用关系。

输出AD患者和健康人的皮肤菌群互作网络中三角基序的数量及RDHT值：

输出皮肤菌群互作网络中15种三角基序的数量，结果如表4所示，在AD患者皮肤菌群网络中仅检测出I-B型和TLM-I型两种类型的特殊三角基序，在健康人皮肤菌群未检测出包含有MAO功能顶点的三角基序。从表4每型三角基序的RDHT值中可以更直观的判断出AD患者与健康人皮肤菌群网络间特殊三角基序的数量存在显著差异。

表4.HIV阳性组和HIV阴性组卫生菌群互作网络中三角基序的数量

实施例4：比较肺纤维化患者急性加重期和经过治疗后的呼吸道内菌群互作网络中特殊trios数量

本发明的计算流程如附图图1所示

数据来源：

Fodor等人2012年公开发表的肺纤维化患者急性加重期和经过治疗后呼吸道内的痰液微生物数据，样本采自23名肺纤维化患者病情急性加重期间和经过抗生素治疗后呼吸道内痰液样本。利用通用引物从样本DNA中扩增出16S rDNA片段，通过454-FLX chemistry测序平台进行测序，经后续生物信息学分析得到97％相似性的微生物操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，其中每个OTU代表代表一个物种，每一个样本中该OTU的测序内容代表该OTU在该样本内的物种丰度。

构建呼吸道菌群互作网络：

以OTU丰度为基础，分别计算各组呼吸道痰液菌群内OTU间的Spearman相关系数R，选取p≤0.05相互作用关系，其中相关系数R＜0表示OTU间为负相互作用关系，R＞0表示OTU间为正相互作用关系。

输出肺纤维化患者急性加重期和经过治疗后呼吸道内菌群互作网络中三角基序的数量及RDHT值：

输出呼吸道内痰液菌群互作网络中15种三角基序的数量，结果如表5所示，在急性加重期肺纤维化患者呼吸道内检测到了I-A型、IV型、SLM型、DLM-II和-III型及TLM-III和-IV型三角基序，而经过抗生素治疗后，在患者的痰液内仅发现了SLM-A型三角基序。通过表5中RDHT值更直观的显示肺纤维化患者急性加重期和经抗生素治疗后菌群互作网络特殊三角基序数量间存在明显的差异(RDHT＞＞1)。表明经过抗生素治疗后，患者病情好转，这些三角基序的变化华情况较灵敏的反应出患者病情的恢复和发展情况。

表5.HIV阳性组和HIV阴性组微生物菌群互作网络中三角基序的数量

实施例5：比较BV患者和健康女性的阴道菌群互作网络中特殊trios数量

本发明的计算流程如附图图1所示

数据来源：Srinivasan等人2012年公开发表的BV患者和健康女性的阴道微生物数据，样本采自98名BV患者和121名健康人的阴道样本。利用通用引物从样本DNA中扩增出16SrDNA片段，经454FLX焦磷酸测序后，通过生物信息学分析得到97％相似性的微生物操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，其中每个OTU代表代表一个物种，每一个样本中该OTU的测序内容代表该OTU在该样本内的物种丰度。

构建阴道菌群互作网络：

以OTU丰度为基础，分别计算BV患者和健康人阴道菌群内OTU间的Spearman相关系数R，选取p≤0.05相互作用关系，其中相关系数R＜0表示OTU间为负相互作用关系，R＞0表示OTU间为正相互作用关系。

输出BV患者和健康女性的阴道菌群互作网络中三角基序的数量及RDHT值：

输出阴道菌群互作网络中15种三角基序的数量，结果如表6所示，除II-A型和III型外，在BV患者阴道内菌群互作网络中均检测到其余各类三角基序，其中只有SLM-II型的数量略小于健康组，其余均大于健康组。通过计算各类三角基序的RDHT值，可以明显看出BV组的I型、II-B型、IV型、SLM-I型、DLM-I及TLM型的RDHT值均远远大于1，表明这些三角基序在BV患者和健康女性阴道菌群互作网络存在显著差异。

表6.HIV阳性组和HIV阴性组微生物菌群互作网络中三角基序的数量

实施例6：比较不孕不育患者和健康男性的精液菌群互作网络中特殊trios数量

本发明的计算流程如附图图1所示

数据来源：

Hou等人2013年发表的男性不孕不育患者和健康男性的精液微生物数据，样本采自33名伴随少精弱精不孕不育患者(AS)，25名严重少精弱精不孕不育患者(SS)和15名健康人的精液样本。利用通用引物从样本DNA中扩增出16S rDNA片段，经Roche 454 GS-FLX焦磷酸测序后，通过生物信息学分析得到97％相似性的微生物操作分类单元(operationaltaxonomic unit，OTU)，其中每个OTU代表代表一个物种，每一个样本中该OTU的测序内容代表该OTU在该样本内的物种丰度。

构建精液菌群互作网络：

以OTU丰度为基础，分别计算不孕不育患者和健康男性精液菌群内OTU间的Spearman相关系数R，选取p≤0.05相互作用关系，其中相关系数R＜0表示OTU间为负相互作用关系，R＞0表示OTU间为正相互作用关系。

输出不孕不育患者和健康男性的精液菌群互作网络中三角基序的数量及RDHT值：

输出精液菌群互作网络中15种三角基序的数量，结果如表7所示，三组菌群互作网络中均发现了SLM-I型三角基序，而AS组和SS组菌群互作网络中还找到了I型、IV型、DLM型及TLM型三角基序，并且SS组中I型、SLM-I型、DLM型和TLM-I、-II及-III型三角基序的数量均高于AS组。通过表7所示，AS组与健康组的RDHT值除SLM-I型外均远高于1，SS组与健康组的RDHT值同样大于1，表明不孕不育患者精液菌群互作网络中三角基序数量与健康男性间存在显著差异。此外，SS组与AS组的RDHT值中不等于1的值均远远高于1，可见随着病情的加重，患者菌群互作网络中三角基序数量与健康人之间的差异越显著。

表7.HIV阳性组和HIV阴性组微生物菌群互作网络中三角基序的数量

Claims (2)

1.一套菌群互作网络标志物在制备筛检疾病相关菌群装置中的应用，其特征在于：

所述的标志物由15种特殊的三角形互作网络基序组成，基序信息见表1，表1包括表1.1和表1.2，表中图例代表基序拓扑结构；根据基序的拓扑结构，15种基序被分为7大型：I～IV型由三个顶点组成，不包括特殊顶点分支；SLM、DLM和TLM型由四个顶点组成，包括特殊顶点分支；基序的每个顶点为一个由操作分类单元所代表的细菌，实心顶点代表具有特殊功能的细菌，空心顶点代表普通细菌；特殊功能细菌包括：群落中丰度最高的细菌，或群落中占主导地位的物种，或在互作网络中拥有最多边的物种；边为两个顶点细菌间的相互作用关系，特殊功能顶点分支表示特殊功能顶点与由普通顶点组成的三角形基序相连接的边；表中“+”号表示正相互作用关系，“-”表示负相互作用关系，表1.1中的“+”和“-”表示三角形基序中三条边的互作关系，表1.2中的“+”和“-”表示特殊功能顶点分支所连两个顶点间的互作关系；

表1.1 6种无特殊顶点分支的网络基序的结构信息

表1.2 9种有特殊顶点分支的网络基序的结构信息

所述的应用，针对HIV感染相关肠道菌群、与吸烟相关的口腔菌群、AD相关的皮肤菌群、肺纤维化相关的呼吸道内菌群、BV相关的阴道菌群、不孕不育相关的精液菌群，还包括如下步骤：

S1：获取特定位点的已知正常菌群样本，以及待测可能与疾病相关的菌群样本，提取DNA，扩增并测序16s rDNA，基于测序结果，利用标准生物信息分析流程获得每个菌群样本的细菌物种组成信息，即操作分类单元，其中每个操作分类单元代表一个物种，每一个样本中该操作分类单元的测序内容代表该操作分类单元在该样本内的物种丰度；

S2：以菌群细菌物种组成及各细菌物种丰度作为输入；

S3：基于细菌间的相互作用关系，分别构建正常菌群和待测菌群的互作网络；

S4：统计每个互作网络中上述15种目标标记物的数量；

S5：计算待测菌群与正常菌群剩余目标标志物的数值比值，记作RDHT；

S6：以RDHT作为筛检标准对待测菌群异常情况进行判断，判断结果作为装置输出。

2.根据权利要求1所述的一套菌群互作网络标志物在制备筛检疾病相关菌群装置中的应用，其特征在于：所述应用以任何软件和硬件形式实现其算法和功能。

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