CN108148906A - 一种强直性脊柱炎肠道微生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种强直性脊柱炎肠道微生物标志物及其应用，本发明涉及强直性脊柱炎肠道微生物标志物，本发明一方面提供了一种强直性脊柱炎的肠道微生物标志物，检测该生物标志物的丰度变化可用于确定个体患有强直性脊柱炎的概率大小。本发明的有益效果在于：该发明提供早期非侵入性诊断强直性脊柱炎疾病状态的方法及生物标志物。根据受检者肠道菌群的不同，可应用于制备强直性脊柱炎治疗药品及平衡肠道菌群微环境稳态。

Description

一种强直性脊柱炎肠道微生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及强直性脊柱炎肠道微生物标志物，更具体的是：本发明涉及一种强直性脊柱炎标志物，一种利用强直性脊柱炎标志物对多个个体进行分类的方法和装置，属于生物医学材料技术领域。
背景技术
强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是一种主要侵犯脊柱、并累及骶髂关节和周围关节，可伴有葡萄膜炎、炎症性肠炎和银屑病等关节外症状的慢性炎症性疾病。多为青壮年起病，患病率为0.2-0.5％，男性多见。迄今强直性脊柱炎病因尚未明确，研究认为其发病主要由遗传易感因素决定，环境因素如吸烟、感染等在疾病发生、发生过程中也起着重要作用。
AS起病隐匿，早期症状较，症状无特异性，大多不能早期发现。研究显示目前AS的诊断仍延迟8-10年。早期诊断，早期治疗是防止AS病情进展，防止残疾的关键，目前我国大多病人，尤其是偏远地区诊断时已经有骨质破坏，失去了最佳治疗时机。目前最常用的强直性脊柱炎诊断标准为1984年修订的纽约标准：①下腰背痛至少持续3个月，②腰椎在前后和侧屈方向活动受限；③胸廓扩展范围小于同年龄和性别的正常值；④双侧骶髂关节炎Ⅱ～Ⅳ级，或单侧骶髂关节炎Ⅲ～Ⅳ级。如果患者具备④并分别附加①～③中的任何1条可确诊为AS。但这诊断标准缺乏对患者早期诊断的敏感性。虽然2010年国际脊柱关节炎评估委员会(ASAS)提出了脊柱关节炎分类标准，其诊断敏感性提高，但其仍需依靠影像学检查、临床症状和体征、实验室检查的多条指标进行综合判断，操作过程比较复杂，早期影像学诊断主要依靠核磁共振，其结果判读复杂，需有经验的医生，因此其应用也有一定限制。寻找客观、简易的判断方法将有助于促使强直性脊柱炎的早期诊断。
人类白细胞抗原HLA-B27与强直性脊柱炎密切相关，也被2010ASAS脊柱关节炎分类标准纳入为条件之一。HLA-B27在AS患者一级亲属中阳性率明显高于患病率，说明AS发病除了遗传易感因素外，环境因素也起着重要作用。
前期AS经典动物模型HLA-B27/β2m转基因鼠在无菌环境下不能出现关节炎和肠炎等疾病表现，且HLA-B27/β2m转基因鼠与野生鼠比较存在肠道菌群失调，提示肠道菌群在AS的发病中可能其重要作用。另外，40-60％AS患者存在亚临床型肠炎，其中5-10％可能进展为炎症性肠病(IBD，克罗病或溃疡性结肠炎)。基因组学研究发现AS和IBD两种疾病存在共同遗传易感基因，且与肠道炎症和免疫相关，而IBD的发病已经被报道与肠道菌群失调密切相关。随着微生物高通量测序和分析技术发展，已有研究说明，与健康对照相比，AS患者存在肠道菌群失调。到目前为止，AS肠道微生物标记物的报道非常少。因此，建立一种AS肠道微生物标记物的诊断方法对AS的诊治和疾病发病机制的认识将有重要意义。
发明内容
本发明一方面提供了一种强直性脊柱炎的肠道微生物标志物，检测该生物标志物的丰度变化可用于确定个体患有强直性脊柱炎的概率大小。
所述的微生物标志由以下物质组成：
Acidaminococcus fermentans DSM 20731
Alloprevotella sp.feline oral taxon 309
Bifidobacterium longum subsp.longum JDM301
Collinsella aerofaciens
Coprococcus catus
Dialister pneumosintes
Intestinibacter bartlettii DSM 16795
Mitsuokella jalaludini i
Prevotella copri
Ruminococcus sp.5_1_39BFAA
[Ruminococcus]torques
Streptococcus mitis
Streptococcus parasanguinis
Streptococcus salivarius subsp.thermophilus
Veillonella dispar ATCC 17748。
第二方面提供了一种标志物确定个体状态的方法，其特征在于，包括
(1)提取粪便中的微生物提取微生物DNA；
(2)测序；
(3)对微生物的风度和对照组的风度进行比较，根据比较结果确定个体状态。
第三方面提供可能用于治疗强直性脊柱炎的药物/功能性食品的新的方向，所述的标志物在检测强直性脊柱炎、检测强直性脊柱炎、制备治疗强直性脊柱炎药物和功能性视频中应用。
本发明的有益效果在于：该发明提供早期非侵入性诊断强直性脊柱炎疾病状态的方法及生物标志物。根据受检者肠道菌群的不同，可应用于制备强直性脊柱炎治疗药品及平衡肠道菌群微环境稳态。
具体实施方式
1.测序数据的获取
1.1样本收集和DNA提取
样本收集需要器械包括：坐便器、粪便样本采集器
强直性脊柱炎患者均来自中山大学附属第三医院，实验用无菌粪便样本采集器采集了41例中国汉族强直性脊柱炎患者的新鲜粪便样品，置于4℃冰盒中2小时内输送至实验室分装到EP管中，每份200mg/份，共5份，立即-80℃冰箱冷冻保存。
利用市面在售粪便微生物DNA提取试剂盒按照说明书步骤提取微生物DNA，-80℃保存。
1.2构建文库及测序
DNA建库按仪器制造商(Illuminate)的16S rRNA基因扩增子测序操作指南进行。利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl。以稀释后的基因组DNA为模板，选取带有Barcode的细菌16S rRNA基因高可变区V4区特异性引物(515F,
5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’,and 806R
5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，New England Biolabs公司的
High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶进行PCR。
PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。使用 DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用HiSeq2500PE250进行上机测序。
2.生物标志物的鉴定
2.1测序数据的基本处理
利用扩增子测序技术进行测序，得到高质量读段(reads)根据Barcode序列将下机数据拆分为不同样品数据，并截去Barcode序列和PCR扩增引物。此后按照高标准进行reads拼接、过滤、去除嵌合体序列等质控步骤，得到有效读段(effective reads)用于微生物物种鉴定。Effective reads通过与SILVA数据库比对注释进行物种鉴定。
2.2物种丰度分析：1)OTU聚类：使用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，(http://drive5.com/uparse/))对所有样品的全部Effective Tags序列进行97％和95％的一致性(Identity)两个等级聚类，形成OTU；2)OTU注释：选取OTU代表序列，使用Qiime中的assign_taxonomy.py脚本和RDP Classifier方法，Silva数据库进行比对获得物种注释信息(置信度阈值默认为0.8以上)；3)使用R软件进行OUT各个分类等级的注释比例和各个分类等级物种相对丰度的统计。
2.3差异物种筛选
基于均一化的物种的丰度表，同时使用R软件进行组间物种的差异显著分析，使用Fisher精确检验并进行FDR校正。根据标准筛选出差异菌群丰度＞1*e^(-4)和p值<0.05差异物种，。结果发现，14个菌种在AS中丰度成显著升高，1个菌种在健康对照者中显著升高。菌种如下表：
2.4利用以上差异菌种构建判断个体状态的诊断器ROC曲线，发现本诊断器预测个体为强直性脊柱炎的准确性为84％。

Claims (3)

1.一种强直性脊柱炎肠道微生物标志物，其特征在于，所述的微生物标志由以下物质组成：
Acidaminococcus fermentans DSM 20731
Alloprevotella sp.feline oral taxon 309
Bifidobacterium longum subsp.longum JDM301
Collinsella aerofaciens
Coprococcus catus
Dialister pneumosintes
Intestinibacter bartlettii DSM 16795
Mitsuokella jalaludinii
Prevotella copri
Ruminococcus sp.5_1_39BFAA
[Ruminococcus]torques
Streptococcus mitis
Streptococcus parasanguinis
Streptococcus salivarius subsp.thermophilus
Veillonella dispar ATCC 17748。
2.如权利要求1所述的标志物在检测强直性脊柱炎、检测强直性脊柱炎、制备治疗强直性脊柱炎药物和功能性视频中应用。
3.一种利用权利要求1所述的标志物确定个体状态的方法，其特征在于，包括
(1)提取粪便中的微生物提取微生物DNA；
(2)测序；
(3)对微生物的风度和对照组的风度进行比较，根据比较结果确定个体状态。
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