CN105803061A - 一种用于检测共生梭菌的试剂及其应用 - Google Patents

一种用于检测共生梭菌的试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测共生梭菌的试剂在制备早期大肠癌诊断试剂盒中的应用。该试剂盒通过提取粪便中细菌的DNA并进行定量聚合酶链式反应从而获得共生梭菌的相对丰度的特征，并以该特征为基础进行早期大肠癌(局限于粘膜下层的结肠癌和直肠癌)的诊断。与目前已用于临床或申请专利的无创性筛选大肠癌的方法相比，本发明完全无创，操作相对简易廉价，而且能更准确的预测诊断大肠癌，其ROC曲线下面积(AUC值)在0.70以上。

Description

一种用于检测共生梭菌的试剂及其应用
技术领域
本发明涉及疾病诊断领域，具体涉及一种检测粪便中共生梭菌的试剂及其在大肠癌早期诊断中的应用。
背景技术
大肠癌在所有肿瘤发病率中排名第三。早期发现大肠癌并干预可以有效改善预后，目前对大肠癌的早期诊断依赖于大肠镜活检。然而大肠镜活检为有创性检查，并不能大规模地用于人群筛查。理想的肿瘤筛查指标应具有较高的敏感性和特异性，同时尽可能为无创性检查。近年科研进展提示大肠癌患者和正常健康人的肠道菌群在分布上有显著差异，肠道菌群可能参与了大肠癌的发生发展。如果仅用受试者的粪便进行分析，就能早期判断是否可能患有大肠癌，就能很好地对普通人群进行筛查，从而做到对大肠癌早发现早治疗。而目前粪便菌群分析仰赖于昂贵的基因组测序，操作繁琐，价格高昂，不利于推广及普及。因此，找到一种能无创性，同时又相对经济简易筛选诊断早期大肠癌的方法，能尽早尽大可能地发现人群中的大肠癌患者，从而极大地增加人群的生存期，降低患者的治疗费用，惠及广大人民群众。
目前，已有一部分肿瘤发生相关的生物标记物在临床上得到应用：1、血清癌胚抗原CEA测定：1965年发现血清中检测CEA筛查大肠癌的方法。在大肠癌患者血清中，可以检测到癌胚抗原(CEA)，这是一种糖蛋白，常出现于恶性肿瘤患者血清中，并非大肠癌的特异性相关抗原，故血清CEA测定对本病的诊断不具有很强的特异性。同时，在浸润性肿瘤中CEA的敏感性低于35％，它也不适用于检测早期大肠癌。2、大便隐血试验(FOBT)：FOBT是目前最常用的大肠癌筛查方法，也是唯一一个有前瞻性随机对照试验证明有效的筛查方法。大肠癌组织或者大的腺瘤通常会渗出少量血液，血液进入大便中被排出。大便隐血试验就可检测大便中的少量血液成分。但粪便中带有血液为非特异性表现，故FOBT对本病的诊断并不具有特异性。而且有时单个粪便样本并不能检测到血液。3、CA19-9抗原(Ritts1984)，CA19-9是一种糖蛋白类的肿瘤标志物，在消化道肿瘤患者的血清中含量明显升高。血清CA-19-9浓度与Duke分期呈正相关，随着分期的升级浓度升高，因此浓度的大小对于判断大肠癌的预后有临床应用价值。但血清检测CA19-9的阳性率较低，仅有22.39％，在各Duke分期中，血清与组织中CA19-9的阳性率差异情况与CEA相同。DukeA～DukeC期中，通过血清检测CA19-9的阳性率均明显低于术后组织，尤其是在DukeA期患者，检测血清CA19-9的结果为阴性。CA19-9对大肠癌的早期诊断价值不高，但对结直肠的疗效观察和复发监测具有重要临床意义。
目前尚未在临床应用的通过肠道菌群诊断大肠癌的专利需通过对粪便标本的全基因组测序，结合多种菌群的丰度和种类进行预测。该方法虽具有较高的特异性，但价格十分昂贵且耗时较长，并不适用于一般群众的筛查及随访。因此，迄今尚未有一种廉价简易同时具备较高敏感性特异性的早期诊断大肠癌的无创方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种用于检测共生梭菌的试剂在制备早期大肠癌诊断试剂盒中的应用。该试剂盒通过提取粪便中细菌的DNA并进行定量聚合酶链式反应(qPCR)从而获得共生梭菌的相对丰度的特征，并以该特征为基础进行早期大肠癌(局限于粘膜下层的结肠癌和直肠癌)的诊断。与目前已用于临床或申请专利的无创性筛选大肠癌的方法相比，本发明完全无创，操作相对简易廉价，而且能更准确的预测诊断大肠癌，其ROC曲线下面积(AUC值)在0.70以上。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种用于检测共生梭菌的试剂在制备早期大肠癌诊断试剂盒中的应用。
进一步地，检测共生梭菌的试剂至少包括针对共生梭菌基因组设计的特异性引物。
进一步地，检测共生梭菌的试剂包括针对共生梭菌基因组设计的特异性引物和16srDNA的通用融合引物。
进一步地，特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。
进一步地，16srDNA的通用融合引物包括上游引物和下游引物，上游引物如SEQIDNO:3所示，下游引物如SEQIDNO:4所示。
上述用于检测共生梭菌的试剂在制备早期大肠癌诊断试剂盒中的应用包括以下步骤：
步骤1、提供取自受试者的粪便样品；
步骤2、对步骤1中的粪便样品进行粪便细菌基因组抽提，以针对共生梭菌基因组设计的特异性引物对共生梭菌基因组进行定量PCR扩增和产物纯化，并以16srDNA的通用融合引物作为内参，产物定量和均一化后，进行数据分析；
步骤3、将步骤2中得到的数据与阴性对照结果进行比对分析；即计算PCR过程中得到的Ct值与内参的Ct值之差，记为△Ct值；Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数；PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍；
步骤4、根据步骤3中的比对分析结果进行早期大肠癌高危组分类；对于正常人群，相应△Ct的cut-off值(界定值)为20.304，即低于20.304的人群为早期大肠癌高发人群；对于腺瘤患者，或包括腺瘤及正常人的非癌人群，相应△Ct的cut-off值为20.148，即低于20.148的人群为早期大肠癌高发人群。
进一步地，步骤2中的针对共生梭菌基因组设计的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。
进一步地，步骤2中的16srDNA的通用融合引物包括上游引物和下游引物，上游引物如SEQIDNO:3所示，下游引物如SEQIDNO:4所示。
进一步地，步骤4中的分类方法为共生梭菌单一菌种相对丰度比对阴性对照分析的方法。
进一步地，早期大肠癌包括局限于粘膜下层的结肠癌和直肠癌。
本发明的第一方面是基于以往未认识到的事实，即取自普通人群的粪便标本即可作为早期大肠癌诊断的样品。更具体地，本发明第一次指出单独使用粪便中共生梭菌的相对丰度可预测样品是否为早期大肠癌。基于以单一粪便菌类共生梭菌判断是否为早期大肠癌类别有若干优点。与目前“已应用于临床的无创性筛查大肠癌方法”相比，该方法特异性和敏感性高于其他方法，且易于临床广泛应用。
在我院纳入的人群样本共生梭菌关联早期大肠癌的AUC可达0.70以上，远远高于同组人群的FOBT(粪便隐血试验)的AUC(0.56)及CEA的AUC(0.64)。表明用粪便细菌种类和丰度特征对预测大肠癌有更好的敏感性和特异性。在肠道腺瘤患者中，早期大肠癌的AUC也均高于FOBT及CEA试验(0.64VS0.63；0.64VS0.60)。此外，检测仅需基本的qPCR技术，操作相对简单，成本相对低廉，一般地市级医疗机构即可操作，适于大范围普及和推广。借此用粪便肠菌基因组测序结果来筛查大肠癌，可以大大地提高诊断的敏感性和特异性，大大地减少漏诊率，能很好的有助于判断受试者是否需要进一步的结肠镜检查。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1示出了在正常人(HC)，肠道腺瘤患者(Adenoma)，大肠癌患者(CRC)粪便中根据qPCR所得的共生梭菌相对统一内参的△Ct值，根据方差分析三者间有统计学差异并呈递减趋势(P＝0.003)，说明粪便中共生梭菌的相对丰度依次增加；
图2示出了比较共生梭菌(CS)、CEA和隐血试验(OB)相对于正常人与大肠癌发病的ROC曲线，三者曲线下面积为0.702(CS)、0.647(CEA)、0.562(OB)。说明利用粪便共生梭菌相对含量在正常人群中可较传统筛查方法更有效率筛查出早期大肠癌高危人群；
图3示出了比较共生梭菌(CS)、CEA和隐血试验(OB)相对于腺瘤患者与大肠癌发病的ROC曲线，三者曲线下面积为0.636(CS)、0.601(CEA)、0.629(OB)。说明在大肠癌癌前疾病腺瘤患者中，利用共生梭菌区分早期大肠癌高危人群仍比传统方法更有效；
图4示出了比较共生梭菌(CS)、CEA和隐血试验(OB)相对于非癌患者(包括正常人和腺瘤患者)与大肠癌发病的ROC曲线，三者曲线下面积为0.663(CS)、0.620(CEA)、0.601(OB)。说明利用共生梭菌区分正常患者和大肠腺瘤患者中早期大肠癌高危群人较传统方法更为有效。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。
1、病人和组织样本：
1)人群：上海交通大学医学院附属仁济医院2012年1月1日至2015年12月30日期间行电子全结肠镜检查及大肠癌手术患者的粪便标本。
纳入标准为：
(1)年龄≥50岁；
(2)具有正常的结肠运动节律，排便频率不多于1天2次，不少于2天1次；
(3)全结肠镜检查由经验丰富的医生按照标准规范操作，且退镜时间充分。
排除标准为：
(1)既往有大肠腺瘤、大肠癌、肠易激综合征(IBS)、溃疡性结肠炎(UC)、或克罗恩病(CD)病史；
(2)既往有消化道手术史，包括胃、胆道、肠道等；
(3)遗传性大肠癌高危人群，指来自以下多种疾病家系成员：胃肠道肿瘤家族史；家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)以及P-J综合征等；
(4)伴有心血管系统、内分泌系统、血液系统及免疫系统疾病；
(5)伴有肝肾功能损害、肝硬化及门脉高压性胃病；
(6)6个月内应用过抗生素、阿司匹林等非甾体抗炎药(NSAIDs)、炎皮质激素类药物、促胃肠动力药以及调整肠道菌群的药物；
(7)6个月内接受过系统性的放疗或化疗。
我们将符合上述条件，经全结肠镜及病理证实为大肠癌者纳入CRC组，证实为腺瘤者纳入AD组(Adenoma)，而经肠镜证实无明显异常表现者纳入正常对照(healthycontrol,HC)组。粪便标本封存后于液氮中转移，并于-80℃环境长期保存。共收集粪便(fecal,F)标本118例，其中包括NC组41例，AD组40例，和CRC组37例。
2、粪便细菌基因组抽提
使用QIAGEN粪便基因组DNA提取试剂盒(QIAampStoolDNAKit)：
(1)称取200mg的标本于2ml离心管中，再加入1.4mlBufferASL用最大速度涡旋3～5min，充分溶解样品；
(2)95℃水浴5分钟；
(3)室温下离心(14,000rpm×1min)取1ml上清液于一个新的2ml离心管中并加入1片InhibitEXtablet，涡旋充分混匀；
(4)室温下离心(14,000rpm×1min)，取200μl上清液于一个新的2ml离心管中并加入15μl蛋白酶K和200μlBufferAL,涡旋充分混匀；
(5)70℃水浴10min；
(6)加入200μl95％乙醇，涡旋充分混匀；
(7)取200μl混匀溶液加入QIAampDNAColumn中，静置1分钟后室温下离心(14,000rpm×1min)去除过滤液并重新利用收集管；
(8)加入500μlBufferAW1于QIAampDNAColumn中，离心14,000rpm×1min，去除过滤液置于新的2ml收集管中；
(9)加入500μlBufferAW2于QIAampDNAColumn中，离心14,000rpm×3min，去除过滤液置于新的2ml收集管中；
(10)去除过滤液置于新的2ml收集管中，离心14,000rpm×1min，以去除残留的乙醇，弃置收集管；
(11)把QIAampDNAColumn移入1.5ml离心管中，加入200μlBufferAE于过滤膜中心室温温育1min；
(12)离心14,000rpm×1min洗脱DNA。
3、DNA浓度测定
从抽提的DNA样品中取1μl,以NANODROP2000仪器测浓度和OD260/OD280的比值，比值1.8～2.0的继续用于后续实验。所有DNA样品置于-20℃保存，用于后续PCR扩增。
4、PCR扩增和鉴定
1)共生梭菌基因组的特异性引物序列(F：3’-CGCTGAGGATCTTGGCTATG，R：3’-GGTTTACCGGTTGCTTCGTC)，内参16srDNA的通用融合引物(F：3’-GGTGAATACGTTCCCGG，R：3’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT)，进行定量PCR扩增和产物纯化。
2)PCR扩增体系
PCR采用SYBRGreenII10μl反应体系,
试剂单个反应用量:
3)
PCR步骤 条件 时间
变性 95℃ 30s
退火 95℃ 5s
延伸 60℃ 30s
循环数 40
根据各组标本的△Ct值和行肠镜检查的前后3个月内的我院进行的CEA和隐血试验结果进行比对和计算。
比对方法及判断标准。
在正常人群中，相应△Ct的cut-off值为20.304，即△Ct低于20.304的人群为早期大肠癌高危组，其敏感性为0.946，特异性为0.415。
在大肠腺瘤人群中，相应△Ct的cut-off值为20.148，即△Ct低于20.148为早期大肠癌高危组，其敏感性为0.946，特异性为0.300。
在非癌人群(包括正常人群和大肠腺瘤人群)中，相应△Ct的cut-off值为20.148，即△Ct低于20.148为早期大肠癌高危组，其敏感性为0.946，特异性为0.358。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.用于检测共生梭菌的试剂在制备早期大肠癌诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测共生梭菌的试剂至少包括针对共生梭菌基因组设计的特异性引物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测共生梭菌的试剂包括针对共生梭菌基因组设计的特异性引物和16srDNA的通用融合引物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如SEQIDNO:1所示，所述下游引物如SEQIDNO:2所示。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述16srDNA的通用融合引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如SEQIDNO:3所示，所述下游引物如SEQIDNO:4所示。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
步骤1、提供取自受试者的粪便样品；
步骤2、对步骤1中的所述粪便样品进行粪便细菌基因组抽提，以针对共生梭菌基因组设计的特异性引物对所述共生梭菌基因组进行定量PCR扩增和产物纯化，并以16srDNA的通用融合引物作为内参，产物定量和均一化后，进行数据分析；
步骤3、将步骤2中得到的数据与阴性对照结果进行比对分析；
步骤4、根据步骤3中的比对分析结果进行早期大肠癌高危组分类。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤2中的所述针对共生梭菌基因组设计的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如SEQIDNO:1所示，所述下游引物如SEQIDNO:2所示。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤2中的所述16srDNA的通用融合引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如SEQIDNO:3所示，所述下游引物如SEQIDNO:4所示。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤4中的分类方法为共生梭菌单一菌种相对丰度比对阴性对照分析的方法。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述早期大肠癌包括局限于粘膜下层的结肠癌和直肠癌。
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