CN104726596A - 利用肠内细菌的菌落和功能的变化的代谢性及炎症性疾病的早期诊断 - Google Patents

利用肠内细菌的菌落和功能的变化的代谢性及炎症性疾病的早期诊断 Download PDF

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Abstract

本发明提供利用肠内细菌的菌落和功能的变化的代谢性及炎症性疾病的早期诊断，具体涉及用于预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度的组合物及其用途，所述组合物包含能够检测出微生物的制剂，所述微生物是由Akkermansia muciniphila、拟杆菌属、真杆菌属、罗斯氏菌属、史氏甲烷短杆菌、斯氏甲烷球形菌、卵形瘤胃球菌和考拉杆菌属组成的组中的微生物。本发明能够预测代谢性及炎症性疾病的危险程度，能够开发用于预防、诊断各种代谢性及炎症性疾病的快速诊断试剂盒。

Description

利用肠内细菌的菌落和功能的变化的代谢性及炎症性疾病的早期诊断
技术领域
本发明涉及检测出用于预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度的生物标记物的组合物及其用途。
背景技术
近年来，由于向以高热量膳食为主的饮食生活的变化、运动不足、以及压力的增加而使现代人的体内平衡发生紊乱，因此，各种代谢性及炎症性疾病正急剧增加。代谢性及炎症性疾病不仅包括肥胖、高血压、2型糖尿病、炎症性肠道疾病，还包括脑卒中、动脉硬化等心血管疾病以及各种癌症、过敏性疾病、特应症(atopy)等威胁人类的健康及生命的严重的疾病。
另一方面，已知肠内细菌的菌落受到宿主的遗传因素和饮食摄取等环境因素的影响。此外，已知在肥胖、糖尿病、炎症性肠道疾病患者等中发现人的肠内细菌不均衡。由此，虽然存在研究肠内细菌菌落及其与疾病的相关性的以往报告，但是大部分以往研究关注通过比较患有特定疾病的人与健康的人的肠内微生物来发现疾病相关微生物。
发明内容
技术课题
然而，在以往的研究中，对于将健康成人作为对象的部分研究，其实际情况是，对于血糖、中性脂肪等多种临床医学指标的信息不足，因此对于存在于肠内的特定微生物与健康指标的相关关系的信息不足。此外，局限之处在于，对于个体间的遗传性差异的考虑不足。
技术解决方法
本发明的目的是，提供一种用于预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度的组合物，其包含能够检测出微生物的制剂，所述微生物是选自由Akkermansia muciniphila、拟杆菌属(Bacteroides spp.)、真杆菌属(Eubacteriumspp.)、罗斯氏菌属(Roseburia spp.)、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibactersmithii)、斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)组成的组中的1种以上。
本发明的另一目的是，提供一种用于预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度的试剂盒，其包含上述组合物。
本发明的另一目的是，提供一种从个体的试样检测出微生物的方法，其用于提供预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度时所需的信息，所述微生物是选自由Akkermansia muciniphila、拟杆菌属(Bacteroides spp.)、真杆菌属(Eubacterium spp.)、罗斯氏菌属(Roseburia spp.)、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)、斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)组成的组中的1种以上。
本发明的另一目的是，提供一种预测代谢性及炎症性疾病的危险程度的方法，其包括：从个体的试样测定肠内微生物的水平的步骤，所述肠内微生物包含Akkermansia muciniphila、拟杆菌属、真杆菌属、罗斯氏菌属、史氏甲烷短杆菌、斯氏甲烷球形菌、卵形瘤胃球菌和考拉杆菌属；将上述肠内微生物的水平与对照组试样的肠内微生物的水平进行比较的步骤；和，当与上述对照组试样进行比较时，对于个体的试样中Akkermansia muciniphila、真杆菌属、史氏甲烷短杆菌、斯氏甲烷球形菌、卵形瘤胃球菌和考拉杆菌属的水平减少，拟杆菌属和罗斯氏菌属的水平增加的情况，预测为代谢性及炎症性疾病的危险程度高的步骤。
附图说明
图1表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查临床医学指标(身体质量指数(BMI)、胰岛素抵抗指数(HOMA index)、血压等)与肠内微生物之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度(arcsine square roottransformed abundances)。
图2表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查BMI与Akkermansiamuciniphila之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图3表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查HOMA指数与Akkermansia muciniphila之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图4表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查血液中中性脂肪(甘油三酯)与Akkermansia muciniphila之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图5表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查BMI与挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图6表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查BMI与惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图7表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查BMI与屎副拟杆菌(Parabacteroides merdae)之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图8表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查舒张压(DBP)与斯氏甲烷球形菌之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图9表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查舒张压与史氏甲烷短杆菌之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图10表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查血液中中性脂肪与卵形瘤胃球菌之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图11表示利用多变量线性回归分析工具MaAsLin调查血液中中性脂肪与考拉杆菌属之间的相关性的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图12表示BMI与核黄素及NAD生物合成相关模块存在强相关性。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图13表示HOMA指数及BMI与甲烷代谢及叶酸生物合成代谢途径存在明显的相关关系。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图14表示在检测出IL-17A的试样(P)与未检测出的试样(N)中分析肠内血链球菌(Streptococcus sanguinis)菌落差异的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
图15表示在检测出IL-21的试样(P)与未检测出的试样(N)中分析肠内普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)菌落差异的结果。纵轴表示平方根反正弦变换的丰度。
具体实施方式
本发明通过将健康的韩国双胞胎作为对象，首次查明了肠内细菌与代谢性及炎症性疾病的临床医学指标的相关性，并以此为基础提供了代谢性及炎症性疾病的早期诊断技术。
在本发明中，为了在从健康的韩国双胞胎的粪便试样提取的DNA中，利用新一代碱基序列分析法获得肠内细菌的全部遗传信息，并从其遗传信息掌握肠内细菌以何种种类构成、何种基因存在的多，使用了多种生物信息学工具。此外，在校正了年龄、性别、遗传性因素等后，确认了与分析对象的临床医学指标存在明显的相关关系的肠内细菌的结构和功能。其结果，分析了肠内细菌的菌落和功能，分析结果，确认到与正常范围内的代谢性及炎症性疾病相关临床医学指标有关的肠内细菌。
通过本发明，确认到即使是具有正常范围的临床医学指标的人，随着该数值升高，肠内细菌的菌落和结构也发生变化。因此，能够将本发明中证明了有相关性的肠内细菌用作用于早期诊断代谢性及炎症性疾病的生物标记物，从而能够将在健康人的肠内所发现的较多的肠内细菌用于早期诊断、预防和治疗代谢性及炎症性疾病的目的。
在本发明中，“生物标记物”是指，将发生代谢性及炎症性疾病的危险程度高或者已发生疾病的人的试样与对照组试样进行比较时，由于在两个试样中存在有差别而可以成为预测代谢性及炎症性疾病的危险程度或者诊断是否发生疾病时的基准的物质。
对临床医学指标与肠内微生物之间的相关性进行了调查，其结果显示，随着作为代谢性及炎症性疾病相关临床医学指标的身体质量指数(body massindex，BMI)、胰岛素抵抗指数(HOMA index)、血液中中性脂肪(甘油三酯)的数值升高，Akkermansia muciniphila在肠内的出现率减小。此外，BMI数值与肠内的真杆菌(Eubacterium)、挑剔真杆菌、惰性真杆菌、屎副拟杆菌显示出统计学上显著的负相关关系，与此相反，BMI数值与肠内的拟杆菌(Bacteroides)的出现率显示出统计学上有意义的正相关关系。其重点在于，这种相关性未出现在患者体内，而是出现在正常人体内。此外，发现了罗斯氏菌属与血压显示正相关关系，作为存在于肠内的古细菌中的一种的史氏甲烷短杆菌及斯氏甲烷球形菌越高，与高血压的预防存在越强的相关性。并且，显示卵形瘤胃球菌和考拉杆菌属在肠内存在得越多，血液中中性脂肪的数值越低。同时，显示BMI、血液中中性脂肪等数值越高，肠内微生物对氧化应激反应的功能(核黄素(riboflavin)、谷胱甘肽代谢(glutathione metabolism)等)越高。
此外，对与血清中细胞因子的浓度存在相关性的肠内微生物的菌落构成进行了确认，其结果显示，检测出参与针对感染的先天性免疫反应的IL-17A的试样与未检测出IL-17A的试样相比，血链球菌以显著高的水平存在。此外，显示检测出已知与自身免疫性疾病、炎症性疾病、癌症有关的IL-21的试样与未检测出IL-21的试样相比，普通拟杆菌以显著低的水平存在。于是确认到，通过测定这些肠内微生物的增加或减少，预测特定血液中细胞因子(IL-17A、IL-21)的水平，由此能够预测体内免疫状态、以及代谢性和炎症性疾病。
这样，发现了与早期诊断、预防和治疗代谢性及炎症性疾病有关的肠内微生物，判断其会起到作为诊断和治疗剂的靶标的作用。
因此，作为一个方案，本发明涉及用于预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度的组合物，所述组合物包含能够检测出微生物的制剂，所述微生物是选自由Akkermansia muciniphila、拟杆菌属、真杆菌属、罗斯氏菌属、史氏甲烷短杆菌、斯氏甲烷球形菌、卵形瘤胃球菌和考拉杆菌属组成的组中的1种以上。
上述拟杆菌属可以包括埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、普通拟杆菌、蓝斑拟杆菌(Bacteroides plebeius)等，但不限于此。
上述真杆菌属可以包括挑剔真杆菌、惰性真杆菌等，但不限于此。
除此以外，上述组合物可以进一步包含能够检测出屎副拟杆菌、血链球菌等的制剂，但不限于此。
作为另一个方案，本发明涉及用于预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度的试剂盒，所述试剂盒包含上述组合物。
作为另一个方案，本发明涉及一种从个体的试样检测出微生物的方法，其用于提供预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度时所需的信息，所述微生物是选自由Akkermansia muciniphila、拟杆菌属、真杆菌属、罗斯氏菌属、史氏甲烷短杆菌、斯氏甲烷球形菌、卵形瘤胃球菌和考拉杆菌属所组成的组中的1种以上。
作为另一个方案，本发明涉及一种预测代谢性及炎症性疾病的危险程度的方法，其包括：从个体的试样测定肠内微生物水平的步骤，所述肠内微生物包含Akkermansia muciniphila、拟杆菌属、真杆菌属、罗斯氏菌属、史氏甲烷短杆菌、斯氏甲烷球形菌、卵形瘤胃球菌和考拉杆菌属；将上述肠内微生物的水平与对照组试样的肠内微生物的水平进行比较的步骤；和，当与上述对照组试样进行比较时，在个体的试样中Akkermansia muciniphila、真杆菌属、史氏甲烷短杆菌、斯氏甲烷球形菌、卵形瘤胃球菌和考拉杆菌属的水平减少，拟杆菌属和罗斯氏菌属的水平增加的情况下，预测为代谢性及炎症性疾病的危险程度高的步骤。
以下，对本发明进行更详细的说明。
在本申请中，用语“预测危险程度”是指辨别个体是否存在发生代谢性及炎症性疾病的可能性，其可以为了通过对发生代谢性及炎症性疾病的危险程度高的个体进行特别且适当的管理，推迟发病时间或尽可能杜绝发病，或者为了治疗决定，选择最合适的治疗方式而应用于临床。此外，“诊断”的意思是确认病理状态的存在或特征，针对本发明的目的，诊断的意思可以是确认代谢性及炎症性疾病的发病与否。
在本发明中，代谢性及炎症性疾病可以是肥胖、高血压、糖尿病、胰岛素抵抗综合症、高脂血症、癌症、心血管疾病、炎症性肠道疾病、特应症、过敏性疾病或代谢综合症。
在本发明中，作为能够检测出提供为生物标记物的微生物或测定微生物水平的制剂，可以使用能够特异性检测出特异性存在于试样内相应微生物的诸如蛋白、核酸、脂质、糖脂质、糖蛋白或糖(单糖类、二糖类、低聚糖类等)等之类的有机生物分子的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体、抗体等。
作为一个例子，本发明中，能够检测出上述微生物或测定微生物水平的制剂可以是能够检测出相应微生物的引物。上述引物优选特异性检测出相应微生物的基因组序列(比如，16S rRNA)，并且不与其他微生物的基因组序列进行特异性结合。
在本申请中，用语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(basepair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。在本申请中，用语“16s rRNA”是指构成原核生物核糖体的30S小亚单位的rRNA，其一方面碱基序列的大部分被高度保留，另一方面部分区域显示出高的碱基序列多样性。特别是在同种之间几乎不存在多样性而异种间显示出多样性，因此通过比较16S rRNA的序列，能够有效鉴定原核生物。
作为一个实施方式，在本发明中，上述引物可以用于扩增相应微生物中保留的16S rRNA的序列，扩增序列后，通过期望的产物的生成与否，能够检测出微生物的存在或测定微生物水平。利用引物的序列扩增方法可以使用本领域已知的多种多样的方法。例如，可以使用聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重PCR、降落(touchdown)PCR、热启动(hot start)PCR、巢式(nested)PCR、增效(booster)PCR、实时(real-time)PCR、差示PCR(differential display PCR：DD-PCR)、cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cDNA ends：RACE)、反向(inverse)聚合酶链式反应、载体介导(vectorette)PCR、热不对称交错PCR(TAIL-PCR(thermal asymmetric interlacedPCR))、连接酶链式反应、修复链式反应、转录-介导的扩增、自主序列复制(self-sustained sequence replication)、目标碱基序列的选择性扩增反应，但本发明的范围不限于此。
此外，在本发明中，检测出微生物或测定微生物水平的制剂可以是抗体，通过使用将抗原-抗体反应作为基础的免疫学方法，可以检测出相应微生物或测定微生物水平。作为用于此的分析方法，有蛋白质印迹、酶联免疫吸附分析(ELISA(enzyme linked immunosorbent asay))、放射免疫分析(RIA：Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、欧氏(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation assay)、补体结合分析法(Complement Fixation Assay)、荧光活化细胞分选器(FACS(Fluorescence activated cell sorter))、蛋白芯片(proteinchip)等，但不限于此。
除此之外，可以将本领域广泛使用的分子免疫学方法用于本发明的检测微生物或测定微生物水平。
本发明的包含上述检测微生物或测定微生物水平的制剂的组合物可以以诊断试剂盒的形式提供。本发明的试剂盒不仅包含用于检测相应微生物的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体、抗体等的制剂，还可以包含适合于分析方法的1种以上其他构成成分组合物、溶液或装置。
作为具体的一个例子，在本发明中，包含对相应微生物具有特异性的引物的试剂盒可以是包含用于实施PCR及类似扩增反应的必须要素的试剂盒。例如，上述PCR用试剂盒可以包含测试管或其他合适的容器、反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶逆转录酶等酶、DNase、RNAse抑制剂、DEPC-水(DEPC-water)、无菌水等。
在本发明中，个体的试样优选可以为粪便试样。
在本发明中，对照组试样可以是健康人的粪便试样。更具体而言，上述对照组可以是如下人：试样采集当时未发生代谢性及炎症性疾病，并且试样采集后至少3、6、9或10年以上未发生代谢性及炎症性疾病。
此外，在本发明中，为了从个体的试样检测出微生物，可以使用本领域已知的常规扩增技术，例如，聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、多重PCR、降落PCR、热启动PCR、巢式PCR、增效PCR、实时PCR、差示PCR、cDNA末端快速扩增、反向PCR、载体介导PCR、TAIL-PCR、连接酶链式反应、修复链式反应、转录-介导的扩增、自主序列复制、目标碱基序列的选择性扩增反应，但本发明的范围不限于此。
此外，可以使用将本领域已知的通常的抗原-抗体反应作为基础的免疫学方法，例如，蛋白质印迹、ELISA、放射免疫分析、放射免疫扩散法、欧氏免疫扩散法、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、FACS、蛋白芯片等，但本发明的范围不限于此。
除此之外，本领域广泛使用的分子免疫学方法可被用于检测本发明的微生物。
在以往的研究中存在有关代谢性及炎症性疾病和肠内细菌的菌落变化的报告，然而没有如下报告，即，如本发明所示，即使是显示正常范畴的健康状态的人，也存在这种疾病相关肠内细菌的菌落和功能的变化，这表示可以将相应细菌用于代谢性及炎症性疾病的早期诊断。并且，在本发明中，通过将肠内微生物分析至物种(species)水平，揭示了作为诊断和治疗剂的精确的微生物靶标。
如果说以往的研究是以具有特定疾病的患者为对象的研究，那么本研究是以健康人为对象的研究，此点为两者的区别点。此外，在本研究中，对临床医学指标与肠内细菌的结构和功能的关系进行分析时，校正遗传因素和性别、年龄等，从而能够得到与以往研究相比更加精确的结果。确认到，即使在以临床医学指标进行判断时属于正常状态，也有可能发生与疾病有关的肠内细菌的结构和功能的变化。即，显示出通过肠内细菌的分析，可以事先预测代谢性及炎症性疾病的危险，可以将预测为对健康起有利作用的肠内细菌用于疾病的治疗和预防的目的。
以下，依据实施例对本发明进行详细说明。但，下述实施例仅用于例示本发明，本发明不受下述实施例的限制。
实施例1.研究对象和试样收集
本研究是以参与韩国双胞胎研究(Healthy Twin Study)的同卵性双胞胎为对象实施的。双胞胎的同卵性与否是通过AmpFlSTR鉴定试剂盒(AmpFlSTRIndentifier Kit(15个常染色体短串联重复(short tandem repeat)标记和1个性别决定标记))和显示出90％以上的精确度的问卷调查来确认的，对于本双胞胎世代研究的详细的方法论已记载于以往的论文中(Sung,J.等人，Twin Research andHuman Genetics，2006.9(6)：p.844-848.)。从两对双胞胎收集1次、从八对双胞胎收集2次粪便试样，将共36个粪便试样用于宏基因组鸟枪法测序分析。另一方面，为了分析肠内微生物的菌落结构，使用从腰围存在差异的共15对双胞胎获得粪便试样，为了测定细胞因子浓度，使用他们的血清试样。粪便试样主要在健康检查当日早晨生成，并保管在-25℃，移至医院后，保管在-80℃。健康检查时，对生活方式、用药史、饮食习惯进行了调查，同时还进行了身体测量(身高、体重、腰围等)和血液检查(葡萄糖、超敏C反应蛋白(hsCRP)、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(triglyceride)等)。
实施例2.DNA提取
利用Mobio强力土壤DNA提取试剂盒(Mobio Power Soil DNA isolation kit)从各粪便试样提取全体DNA，直至分析前，一直保管在-80℃。
实施例3.宏基因组鸟枪法测序
利用Illumina HiSeq2000101循环双端测序(Illumina HiSeq2000 101 CyclePaired End Sequencing)，根据制造公司的说明对在肠内微生物与临床医学指标的相关关系分析中所使用的试样实施了宏基因组鸟枪测序，各试样生成了平均3.5千兆碱基(gigabase)的碱基序列。
实施例4.16S rRNA基因测序
对于在肠内微生物与血清细胞因子的相关关系分析中所使用的试样，使用正向引物和反向引物进行了扩增，所述正向引物包含454Life Sciences(Roche)钛互换的接头(adapter)序列(5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-3')、4-碱基连接(linker)序列(TCAG)和被保存的细菌引物8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，所述反向引物包含454Life Sciences(Roche)钛互换的接头序列(5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-3')、4-碱基连接序列(TCAG)、9-或10-碱基多重标签(MID)和细菌引物534R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')。PCR反应液由0.5μM的正向、反向引物、约50ng/μL的模板(template)DNA、1×PCR反应缓冲液、400μM的dNTP混合物、2.5U G-Taq聚合酶(Cosmo，首尔，韩国)构成，PCR反应包括如下阶段：在94℃下改性5分钟；在94℃下45秒、在55℃下30秒和在72℃下90反复进行35次；在72℃下进行10分钟的最终延长。利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen、Valencia、CA、美国))精制PCR扩增产物，利用454Life Sciences Genome Sequencer FLX Titaniummachine(Roche)进行测序。
实施例5.宏基因组鸟枪法测序分析
利用被称为MetaPhlAn(Segata,N.等人，Nature methods，2012.9(8)：p.811-814)的分析工具，从通过宏基因组鸟枪法测序获得的碱基序列，掌握了肠内微生物的菌落构成，利用被称为HUMAnN(Abubucker,S.等人，PLoScomputational biology，2012.8(6))的工具，掌握了肠内微生物的代谢途径构成。
实施例6.16S rRNA基因测序分析
利用麻省哈佛总研究院(Broad Institute of MIT and Harvard)开发的ABCpipeline，从通过16S rRNA基因测序获得的碱基序列，掌握了肠内微生物的菌落构成。
实施例7.血清中细胞因子模式分析
利用MILLIPLEX MAP Human Magnetic Bead TH17-20Plex(密理博公司、St.Charles、美国)(HTH17MAG-14K-20)分析了血清试样中20种分泌细胞因子模式。作为分析对象的20个细胞因子是IFNγ、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17A、IL-1β、IL-2、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28A、IL-31、IL-33、IL-4、IL-5、IL-6、MIP-3α、TNF-α、TNF-β。分析过程遵守使用的试剂盒的说明书(protocol)而实施，其过程如下。
将200μL的检测缓冲液(assay buffer)添加到96-孔(well)的各孔中，然后密封(sealing)培养板(plate)，在20-25℃、在培养板振荡仪(plate shaker)中充分混合10分钟。去除检测缓冲液，通过对培养板抽液(tapping)去除剩余缓冲液，然后将25μL的标准物(standard)和对照物(control)添加到相应孔中，将25μL的检测缓冲液添加到背景孔(background well)和样品孔(sample well)中。将25μL的血清用基质溶液(matrix solution)添加到背景孔、标准孔、对照孔，向样品孔添加25μL血清试样。向所有孔添加25μL的混合的/预混合的珠(Mixed/Premixed Bead)，然后利用培养板振荡仪在4℃下反应16-18小时。对于反应结束的培养板，根据试剂盒所提供的说明(instruction)，利用磁性洗板机(magnetic plate washer)洗涤两次后，添加25μL的检测抗体(DetectionAntibodies)，在20-25℃振荡1小时并反应。之后，放入25μL链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-Phycoerythrin)溶液，在20-25℃反应30分钟，然后再次实施2次洗涤。当反应结束时，向所有孔放入150μL的鞘液(Sheath Fluid)并振荡5分钟，然后利用Luminex设备检测荧光信号。
分析设备利用MAGPIX(Luminex、Austin、TX、美国)，并将中位荧光强度(MFI(Median Fluorescence Intensity))值用于定量分析。在对各标准(Standard)浓度的反应测定值(MFI)计算s/w“MasterPlex QT 2010(MiraiBio、日立、CA、美国)”中，利用最佳匹配(best fit)方法求得标准曲线(standard curve)，以该曲线为基准计算各试样结果浓度值，此外，在调整标准曲线时，考虑试样的数据(data)分布，使其反映成尽最大可能计算试样的浓度值。
实施例8.肠内微生物与临床医学指标的相关关系分析
为了分析临床医学指标与肠内微生物的相关关系，利用被称为MaAsLin的分析工具。MaAsLin利用boosting来选择与肠内微生物显示潜在的相关性的元数据，之后，将该元数据设为独立变量、将肠内微生物的平方根反正弦变换的丰度设为从属变量，实施多变量分析，从而掌握统计学上显著的元数据和肠内微生物的菌落构成。
实施例9.肠内微生物与血清细胞因子的相关关系分析
血清细胞因子的浓度分析结果显示，在大部分的试样中未测出除了CCL20、IL-27、TNF-α之外的剩余细胞因子。因此，对于相应细胞因子，分类为测出的试样和未测出的试样并进行分析。
为了分析肠内微生物与血清细胞因子的相关关系，利用MaAsLin，将分析对象的年龄和腰围设为固定因素，将双胞胎关系设为随机因素，进行了分析。
实验结果
对于由最多进行2次而收集的20人的粪便试样构成的共36个粪便试样，实施了宏基因组鸟枪法测序。此外，对于BMI、空腹血糖(fasting blood sugar、FBS)、胆固醇水平(LDL、HDL)、空腹胰岛素(fasting blood insulin、FBI)、HOMA指数、中性脂肪(甘油三酯)、肝、肾脏功能等临床医学指标也收集了数据。根据分析碱基序列后的DNA读序(read)，利用MetaPhlAn，掌握了物种水平的肠内微生物菌落构成，利用HUMAnN掌握了肠内微生物的代谢途径构成。此外，为了分析血清内细胞因子与肠内微生物的相关性，对于显示腰围差异的15对双胞胎的粪便试样，实施了16S rRNA基因测序，从他们的血清试样共测定了20种细胞因子的浓度。为了确认与临床医学指标和血清中细胞因子的数值存在统计学上显著的相关性的肠内微生物的菌落构成，使用了能够去除混沌变量影响的多变量分析工具MaAsLin。
为了调查临床医学指标与肠内微生物之间的相关性，使用了多变量线性回归分析工具MaAsLin。MaAsLin在校正性别、年龄、吸烟与否等变量的同时，分析元数据与肠内微生物的菌落构成的相关性。通过该分析，发现了BMI、HOMA指数、血压等与特定肠内微生物和代谢途径的相关性。例如显示，随着作为与代谢性及炎症性疾病有关的临床医学指标的BMI、HOMA指数、血液中中性脂肪(甘油三酯)的数值升高，Akkermansia muciniphila在肠内的出现率减少(图1至图4)。该细菌作为分解粘蛋白(mucin)的肠内微生物，在具有正常范围的BMI和FBS水平的人中出现这种倾向，是通过本研究第一次报告的。
此外，真杆菌、挑剔真杆菌、惰性真杆菌、屎副拟杆菌与BMI显示出统计学上显著的负相关关系(图1、图5至图7)。另一方面，BMI数值与肠内拟杆菌的出现率显示出统计学上有意义的正相关关系(图1)。这种相关性的重点在于，未出现在患者体内，而是出现在正常人体内。
此外，发现罗斯氏菌(Roseburia)与血压表现出正相关关系(图1)，作为存在于肠内的古细菌的一种的史氏甲烷短杆菌和斯氏甲烷球形菌越多，与预防高血压具有越强的相关性(图8和图9)。
此外，表现出卵形瘤胃球菌和考拉杆菌属在肠内存在的越多，血液中中性脂肪的数值越低(图10和图11)。
而且，表现出BMI、血液中中性脂肪等的数值越高，肠内微生物对氧化应激反应的功能(核黄素、谷胱甘肽代谢等)越高。
在本发明中，BMI表现出与核黄素和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成相关模块具有强相关性，与叶酸生物合成代谢途径也表现出存在统计学上显著的正相关关系(图12和图13)。这样的功能可看作是反映在肠内对氧化应激反应的功能。在将健康人作为对象的本研究中，还未查明为何表现出这种特征，以及这种变化与日后健康的变化存在何种关联，但与最新研究的结果一致，即肠内微生物的代谢性功能与肠内炎症存在相关性。
另一方面，为了确认与血清中细胞因子的浓度存在相关性的肠内微生物的菌落构成，由15对的双胞胎测定血清中细胞因子的浓度的结果，CCL20、IL-27、TNF-α的平均浓度分别显示出10.23±7.51pg/mL、0.36±0.33ng/mL、5.11±2.03pg/mL(表1)，对于其余细胞因子的情况，由于测定出检测限以上的样品数少，因此对检出与否分类后进行了分析(表2)。
[表1]
[表2]
细胞因子 IL-12 IL-21 IL-17A IL-31 IL-33 IL-5 IL-2 IFN-γ IL-4 IL-22 TNF-β
阳性数1) 16 11 5 5 5 5 4 3 2 2 1
1)是指检测出相应细胞因子的试样的个数
血清中的细胞因子与肠内微生物的菌落构成的相关性的分析使用了被称为MaAsLin的分析工具。将分析对象的年龄和腰围设为固定因素，并且将双胞胎关系设为随机因素，然后检索了统计学上显著的血液中细胞因子与肠内微生物的菌落构成的关系。其结果表现出，检测出作为参与针对感染的先天性免疫反应的细胞因子的IL-17A的试样与未检测出IL-17A的试样相比，血链球菌以显著高的水平存在(图14)。此外，表现出，检测出已知与自身免疫性疾病、炎症性疾病、癌症有关的IL-21的试样与未检测出IL-21的试样相比，普通拟杆菌以显著低的水平存在(图15)。
血液中细胞因子水平与炎症性疾病、免疫疾病和肥胖等存在相关性，因此通过测定上述特定肠内微生物的增加或减少，预测特定血液中细胞因子(IL-17A、IL-21)的水平，由此能够预测体内免疫状态以及代谢性和炎症性疾病。
产业可利用性
本发明提供用于检测代谢性及炎症性疾病的新型生物标记物的组合物，如果使用该组合物，则通过简单的试样采集，能够预测代谢性及炎症性疾病的危险程度，能够开发用于预防、诊断各种代谢性及炎症性疾病的快速诊断试剂盒。此外，作为用于预防或治疗各种代谢性及炎症性疾病的新药开发和控制的靶标，期待也能够有效利用上述组合物。

Claims (6)

1.一种用于预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度的组合物，其包含能够检测出微生物的制剂，所述微生物是由Akkermansia muciniphila、拟杆菌属(Bacteroides spp.)、真杆菌属(Eubacterium spp.)、罗斯氏菌属(Roseburiaspp.)、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)、斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)组成的组中的微生物。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述能够检测出微生物的制剂是对微生物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
3.根据权利要求2所述的组合物，所述引物是能够扩增微生物的16SrRNA的引物。
4.根据权利要求1所述的组合物，所述代谢性及炎症性疾病是肥胖、高血压、糖尿病、胰岛素抵抗综合症、高脂血症、癌症、心血管疾病、炎症性肠道疾病、特应征、过敏性疾病或代谢综合症。
5.一种用于预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度的试剂盒，其包含权利要求1～4中任一项所述的组合物。
6.一种从患者的试样检测出微生物的方法，其用于提供预测或诊断代谢性及炎症性疾病的危险程度时所需的信息，所述微生物是由Akkermansiamuciniphila、拟杆菌属(Bacteroides spp.)、真杆菌属(Eubacterium spp.)、罗斯氏菌属(Roseburia spp.)、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)、斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)组成的组中的微生物。
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