KR20230043482A - 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단 - Google Patents
장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단 Download PDFInfo
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Abstract
장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 조성물, 키트 및 노화 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
Description
장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 조성물, 키트 및 노화 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
노화는 항상성의 감퇴, 세포 및 조직의 손상, 미토콘드리아 기능 장애, 산화스트레스, 말단 소립자의 단축 등과 같은 생물학적 및 생리적 기능의 변화를 초래한다. 이러한 변화는 결국 심혈관 질환, 제2 형 당뇨, 암, 또는 알츠하이머 질병을 포함한 노화 관련된 질병에 대한 큰 위험 요소이다. 따라서 노화는 삶의 질을 저하시키는 여러 가지 만성 질환의 주된 위험 요소로 인식되며 사회적 문제로 지적되고 있지만, 노화는 매우 복잡한 현상이며 노화에 대한 신뢰성 있는 바이오마커의 부재로 인해 예측할 수 없는 현상으로 여겨진다.
현재 노화를 예측하는 데 기술적 한계가 있기 때문에, 노화의 진행 여부를 조기 진단하여 노화로 인한 질병을 예방하고 노화를 체계적으로 관리하는데 기여할 수 있는 진단 도구의 개발이 필요하다.
한편, 장내 미생물 조성(composition)의 변화 (장내 세균 불균형, dysbiosis)는 장질환을 넘어 다양한 대사성 그리고 면역질환 발생과 관련이 있다. 또한, 노화에 의해서도 그 구성이 변화하며 염증노화(inflammaging) 증가와 노인에서 호발하는 동맥 경화, 당뇨 및 퇴행성 뇌질환 발생의 한 원인으로 지목되고 있다. 정상적으로 장내 미생물의 조성은 24시간 주기로 낮과 밤에 따라 변화하는 일주기성 리듬(circadian rhythm)을 가지며 이 리듬 변화 역시 비만과 당뇨 발생에 기여한다. 일반적으로, 수면, 혈압 및 호르몬 유리에서 보이는 일주기성 리듬이 노인에서는 감소하지만, 노인의 장내 미생물 조성의 일주기성 리듬 변화는 알려진 바 없다.
본 발명은 노화에 따른 장내 미생물 구성의 일주기성 변화 여부를 확인하는 것이 노인 질환 발생 취약성을 예측하고 조기 진단에 도움을 줄 수 있다는 발견에서 비롯된 것이다. 따라서 본 발명은 장내 미생물 군집의 일주기성 리듬 변화를 분석하여 노화의 표지자를 발굴함으로써 노화의 진행 여부를 조기 진단하고 노인성 질환 예방 및 노화 관리에 활용하고자 한다.
일 예는, 남성에서 상기 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 조성물, 키트 및 노화 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
다른 예는, 여성에서 상기 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 조성물, 키트 및 노화 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면에 따라, 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 및 리케넬라 (Rikenella)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 남성에서 상기 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 조성물이 제공된다.
바람직한 구현예로, 12시간 간격으로 수집된 낮시간대 생물학적 시료와 밤시간대 생물학적 시료에서 장내 미생물의 수준을 각각 측정하여 일주기성 리듬을 확인했을 때, 노화되지 않은 대조군과 비교하여, 밤시간대 생물학적 시료에서 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria) 또는 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)이 증가 또는 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014이 감소하거나; 또는 낮시간대 생물학적 시료에서 리케넬라 (Rikenella)가 감소하는 경우 노화가 진행되는 것으로 판정된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 조성물을 포함하는, 남성에서 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 남성의 생물학적 시료에서 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 및 리케넬라 (Rikenella)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 노화 진단을 위한 정보 제공 방법 또는 노화 진단 방법이 제공된다.
바람직한 구현예로, 상기 방법은 12시간 간격으로 낮시간대 생물학적 시료와 밤시간대 생물학적 시료를 수집하고 각 시료 내에서 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 및 리케넬라 (Rikenella) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물의 수준의 변화를 측정하여 일주기성 리듬을 확인하고, 이를 노화되지 않은 대조군과 비교하는 것을 포함한다.
바람직한 다른 구현예로, 상기 방법은, 노화되지 않은 대조군과 비교하여, 밤시간대 생물학적 시료에서 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria) 또는 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)이 증가 또는 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014이 감소하거나; 또는 낮시간대 생물학적 시료에서 리케넬라 (Rikenella)가 감소하는 경우 노화가 진행되는 것으로 판정된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium), 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 및 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 여성에서 상기 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 조성물이 제공된다.
바람직한 구현예로, 12시간 간격으로 수집된 낮시간대 생물학적 시료와 밤시간대 생물학적 시료에서 장내 미생물의 수준을 각각 측정하여 일주기성 리듬을 확인했을 때, 노화되지 않은 대조군과 비교하여, 낮시간대 생물학적 시료에서 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)이 증가 또는 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium)이 감소하거나; 또는 밤시간대 생물학적 시료에서 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 또는 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 이 증가하는 경우 노화가 진행되는 것으로 판정된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 조성물을 포함하는, 여성에서 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 여성의 생물학적 시료에서 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium), 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 및 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 노화 진단을 위한 정보 제공 방법 또는 노화 진단 방법을 제공한다.
바람직한 구현예로, 상기 방법은 12시간 간격으로 낮시간대 생물학적 시료와 밤시간대 생물학적 시료를 수집하고 각 시료 내에서 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium), 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 및 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물의 수준의 변화를 측정하여 일주기성 리듬을 확인하고, 이를 노화되지 않은 대조군과 비교하는 것을 포함한다.
바람직한 다른 구현예로, 상기 방법은, 노화되지 않은 대조군과 비교하여, 낮시간대 생물학적 시료에서 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)이 증가 또는 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium)이 감소하거나; 또는 밤시간대 생물학적 시료에서 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 또는 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 이 증가하는 경우 노화가 진행되는 것으로 판정된다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 젊은 성체 대비 성호르몬이 자연 감소한 암수 노령 마우스의 맹장(cecum)을 낮과 밤 두개의 시간대에 적출하여, 장내 박테리아의 조성을 분석하였으며, 노화 및 성별에 따라 상대적 분포도에 일주기성 변화를 보이는 박테리아들을 확인하였다. 그 결과, 젊은 성체와 비교하여, 밤시간대에 수컷 노령 마우스에서는 장내 미생물 불균형을 의미하는 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio, F/B ratio)과 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)의 상대적 분포도가 증가하였고, 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 의 분포가 감소하였으며, 암컷 노령 마우스에서는 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 알로프레보텔라 (Alloprevotella), 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001, 및 파라수테렐라(Parasutterella)의 상대적 분포도가 증가하였다. 낮 시간대에서는 노령 수컷에서는 리케넬라(Rikenella)와 노령 암컷에서는 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium)의 상대적 분포도가 감소한 반면, 노령 암컷에서 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)의 상대적 분포도가 증가하였다.
이러한 결과는 노화에 따라 장내 미생물 조성이 일주기성 리듬에 따라 달라지며 그 조성 변화는 성에 따라 차이가 있음을 보여주는 최초의 연구 성과이다. 본 발명에 근거하여, 예를 들어, 3-4일간 노인에서 낮과 밤시간대의 변을 채취하고, 변내 박테리아 조성 검사로 노화에 따른 일주기성 리듬 변화를 비침습적인 16sRNA sequencing을 이용하여 조기 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어, "노화"는 시간이 지남에 따라 신체의 구조와 생리학적 기능이 점진적으로 퇴화하는 현상을 말한다. 노화의 진행에 대한 정보는 생물학적 연령에 관한 정보일 수 있다. "생물학적 연령(biological age)"은 생체 나이라고도 하고, 성장, 성숙, 또는 노화를 기술할 때의 시간적 척도를 의미한다. 연령은 연, 월, 일과 같은 달력의 척도, 즉 생활 연령(chronological age)으로 나타낼 수 있지만, 성장, 성숙, 또는 노화 현상은 모든 개체가 동일하게 진행되지 않기 때문에 생활 연령 이외의 생물학적 연령의 개념이 제기되었다.
본 발명에서 용어, "일주기성 리듬(diurnal 또는 circadian rhythm)" 이란 지구의 자전으로 인하여 낮과 밤이 바뀌는 24시간 주기의 변화에 적응하기 위한 특성을 말하며, 내인성 생체리듬 이라고도 한다. 생체는 체온, 혈압, 호르몬 유리, 대사, 수면 등의 생리 활동 뿐만 아니라 장내 미생물 (gut microbiota)도 낮과 밤의 사이클에 따라 24시간 주기의 고유한 일주기성 리듬을 나타낸다. 일주기성 리듬은 야간 작업, 근무 교대 및 장거리 비행 등에 의해 교란되며, 이러한 일주기성 리듬 변화는 대사성 질환(metabolic disease) 또는 암과 같은 질병 발생을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "일주기성 리듬의 변화"란 내생적으로(endogenously) 생성된 일주기성 리듬에 변화가 생긴 것을 말하며, 예를 들어 노화되지 않은 개체에서 나타나는 장내 미생물의 수준 및/또는 분포에 대한 일주기성 리듬에 유의적인 변화가 일어난 것을 말한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 상태에 대한 객체의 감수성을 판정하는 것, 객체가 특정 질병 또는 상태를 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 상태인 객체의 예후를 판정하는 것, 또는 이를 모니터링하는 것을 지칭할 수 있고, 구체적으로는 노화의 진행을 평가 또는 측정하는 것을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 "마커(marker)" 또는 "바이오마커(bionarker)"란 노화가 진행되는 개체와 노화되지 않은 개체를 구분하여 평가할 수 있는 물질을 의미하며, 노화되지 않은 개체에 비하여 노화가 진행되는 개체에서 수준이나 분포에 변화를 나타내는 생체 유기 분자들을 의미한다. 본 발명의 목적상, 노화 마커는 노화가 진행되는 개체에서 특이적으로 분포 변화를 나타내는 장내 미생물 또는 군집을 의미한다.
본원에서 용어, "장내 미생물을 검출할 수 있는 제제" 란, 시료 내에서 장내 미생물의 수준 또는 분포 변화를 측정하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, 본원에 따른 장내 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체 등이 될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 장내 미생물을 검출할 수 있는 제제는 프라이머 일 수 있다. 상기 프라이머는 본원에 따른 장내 미생물의 게놈 서열을 특이적으로 검출하고 다른 미생물의 게놈 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, 본원에 따른 장내 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다.
본원에서 용어, "프라이머"란, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 프라이머는 본원에 따른 장내 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
본원에서 용어, "16S rRNA "란, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 모든 종에 공통적인 보존 영역(conserved region)과 특정 종을 분류할 수 있는 초가변 영역(hypervariable region)이 존재하므로 염기서열분석을 통하여 미생물을 동정할 수 있다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다. 또한 16S rDNA 는 16S rRNA 를 코딩하는 유전자이므로, 16S rDNA 를 활용하여 미생물을 동정할 수도 있다.
바람직한 일구현예로, 본 발명에서 상기 프라이머는 본원에 따른 장내 미생물에 특이적인 16S rRNA (또는 16S rDNA) 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있으며, 서열 증폭 결과 원하는 생성물의 생성 여부를 통하여 장내 미생물의 존재를 검출할 수 있다. 프라이머를 이용한 서열 증폭 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 또는 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명에서 미생물 검출 제제는, 항체일 수 있으며, 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion),오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 또는 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 외, 당업계에 널리 사용되는 분자 및 면역학적 방법이 본 발명의 미생물을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 미생물 검출 제제를 포함하는 진단용 조성물은, 진단 키트 형태로 구현되어 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 해당 미생물을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체 등의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일예로, 본 발명에서 본원에 따른 장내 미생물에 특이적인 프라이머를 포함하는 키트는, PCR 등의 증폭 반응을 수행하기 위한 필수 요소들을 포함하는 키트 일 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 용 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 또는 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 시료로부터 특정 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 측정함으로써 노화를 진단하는 방법을 제공한다.
달리 말하면, 본 발명은 노화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 특정 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 측정하는 방법을 제공한다. 또는, 시료로부터 특정 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 노화 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
바람직한 일례로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하여 구현될 수 있다:
(a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계,
(b) 상기 추출된 게놈 DNA 에 본원에 따른 장내 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계, 및
(c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계.
상기 단계 (a) 에서, "시료"란, 노화 진행 여부를 진단하고자 하는 남성 또는 여성의 몸에서 채취된 것으로, 바람직하게는, 장내 미생물이 포함된 세포 시료, 조직 시료 또는 체액 시료일 수 있으며, 예컨대 분변 시료일 수 있다. 또한, 시료는 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화 측정을 위하여, 12시간 간격으로 낮시간대와 밤시간대에 각각 수집되는 것이 바람직하다.
상기 단계 (b) 에서 시료로부터 게놈 DNA의 추출은 당업계에 알려진 일반적인 기술을 적용하여 수행할 수 있으며, 본원에 따른 장내 미생물에 특이적인 프라이머는 위에서 설명한 바와 같다.
상기 단계 (c)에서 반응물을 증폭시키는 방법은 당업계에 알려진 일반적인 증폭 기술들, 예를 들어 중합효소 연쇄반응, 역전사-중합효소 연쇄반응, 멀티플렉스 PCR, 터치다운 PCR, 핫 스타트 PCR, 네스티드 PCR, 부스터 PCR, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR, cDNA 말단의 신속 증폭, 인버스 PCR, 벡토레트 PCR, TAIL-PCR, 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.
상기 단계 (c)에서, 반응물의 증폭 산물의 양을 12시간 간격으로 수집된 낮시간대 생물학적 시료와 밤시간대 생물학적 시료에서 장내 미생물의 수준을 각각 측정하여 일주기성 리듬을 구현하고, 이를 노화되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 추가로 수행할 수 있으며, 특정 미생물이 특정 일주기성 리듬 변화를 나타낸 경우 해당 개체는 노화가 진행되는 것으로 진단할 수 있다.
본 발명에 따라 노화의 진행 여부를 조기 진단하여 노화로 인한 질병을 예방하고 노화를 체계적으로 관리하는데 기여할 수 있다.
도 1은 문(phylum) 및 과(Family) 수준에서 노화에 따른 장내 미생물 분포의 일주기성 변화를 나타낸다. (A)는 젊은 성체와 노령 개체 수컷의 맹장에서 낮(10 AM)과 밤(10 PM)에 따라 문(phylum) 수준에서 1% 이상의 상대적 분포를 보이는 장내 미생물의 누적 막대 그래프이다. (B)는 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (F/B ratio), (C)는 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), (D)는 시아노박테리아(Cyanobacteria)의 상대적 분포의 평균값 변화를 나타낸다. (E)는 젊은 성체와 노령 개체 암컷의 맹장에서 AM과 PM에 따라 문(phylum) 수준에서 1% 이상의 상대적 분포를 보이는 장내 미생물의 누적 막대 그래프이다. (F)는 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (F/B ratio)의 평균값 변화를 나타낸다. (G)는 젊은 성체와 노령 개체 수컷의 맹장에서 AM과 PM에 따라 과(Family) 수준에서 1% 이상의 상대적 분포를 보이는 장내 미생물의 누적 막대 그래프이다. (H)는 젊은 성체와 노령 개체 암컷의 맹장에서 AM과 PM에 따라 과(Family) 수준에서 1% 이상의 상대적 분포를 보이는 장내 미생물의 누적 막대 그래프이다. (I)는 수테렐라세아에(Sutterellaceae)의 상대적 분포의 평균값 변화를 나타낸다. 모두 그룹당 n = 3 이고, *p < 0.05 이다.
도 2는 속(genus)에서 노화에 따른 장내 미생물 분포의 일주기성 변화를 나타낸다. 젊은 성체와 노령 개체 수컷의 맹장에서 낮(10 AM)과 밤(10 PM)에 따라 (A) 리케넬라 (Rikenella), (B) 리케넬라세아에 RC9 장 그룹 (Rikenellaceae RC9 gut group), (C) 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 및 (D) 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 의 상대적 분포의 평균값 변화를 나타낸다. 또한, 젊은 성체와 노령 개체 암컷의 맹장에서 AM과 PM에 따라 (E) 알로프레보텔라 (Alloprevotella), (F) 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), (G) 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001, (H) 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium), 및 (I) 파라수테렐라 (Parasutterella)의 상대적 분포의 평균값 변화를 나타낸다. 모두 그룹당 n = 3 이고, *p < 0.05 이다.
도 2는 속(genus)에서 노화에 따른 장내 미생물 분포의 일주기성 변화를 나타낸다. 젊은 성체와 노령 개체 수컷의 맹장에서 낮(10 AM)과 밤(10 PM)에 따라 (A) 리케넬라 (Rikenella), (B) 리케넬라세아에 RC9 장 그룹 (Rikenellaceae RC9 gut group), (C) 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 및 (D) 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 의 상대적 분포의 평균값 변화를 나타낸다. 또한, 젊은 성체와 노령 개체 암컷의 맹장에서 AM과 PM에 따라 (E) 알로프레보텔라 (Alloprevotella), (F) 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), (G) 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001, (H) 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium), 및 (I) 파라수테렐라 (Parasutterella)의 상대적 분포의 평균값 변화를 나타낸다. 모두 그룹당 n = 3 이고, *p < 0.05 이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. 사용 동물과 샘플링 방법
C57Bl/6 10-12주령(젊은 성체)와 20개월령(노령)의 수컷 및 암컷 마우스를 12시간 명/암 주기(오전 8시 점등(light on), 오후 8시에 소등(light off)) 하에 동물실 사육실에서 2주이상 사육하고, 사료는 제한하지 않았다. 장내 미생물 분석을 위하여 성별로 6마리의 젊은 성체와 6마리의 노령 마우스를 사용하였다(n=3). 오전 10시(AM)와 밤 10시(PM)에 마우스를 마취 하에 맹장(cecum)을 얻었으며, 밤 시간대에는 소등상태에서 마취시킨 후 점등 상태에서 샘플을 얻었다. 샘플은 분석전까지 섭씨 -80도 냉동상태에 보존하였다. 모든 절차는 이화여자대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받고 실험동물의 윤리적 사용에 대한 국제 지침을 준수하였다.
실시예 2. 박테리아 DNA 추출 및 16S rRNA 유전자 시퀀싱
맹장 내의 DNA는 DNA Fast Stool extraction kit (Qiagen, Hilden, 독일)로 추출하였고, 16S rRNA(ribosomal RNA)은 이바이오젠㈜에서 분석하였다. 각 샘플은 Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library protocol에 따라 준비하였고, 16S V3-V4 프라이머를 이용하였다. 각 분류군(taxa)은 SILVA reference (region V3-V4) database에 기반한 Q2-Feature classifier에 따라 분류하였다 (https://www.arb-silva.de/).
실시예 3. 통계 방법
실험 결과는 평균±표준오차로 표기하였다. 각 그룹간 F/B ratio와 상대적 분포도 비교는 Kruskal-Wallis test후 Dunn's multiple comparison test를 시행하였다. 유의성 있는 p값은 P ＜ 0.05로 표기하였다.
실험결과
1. 문(phylum)과 과(family) 수준에서 노화에 따른 장내 미생물 조성 변화
젊은 성체와 노령 개체의 오전과 밤의 장내 미생물의 조작분류단위(operational taxonomic units, OTU), 균등도(evenness) 및 다양성(diversity)에는 차이를 보이지 않았다 (표 1).
| 특성 | 젊은 성체 | 노령 개체 | P 값 | ||
| AM | PM | AM | PM | ||
| 수컷 | |||||
| OTU의 수 | 312 | 357 | 304 | 289 | 0.30 |
| 알파 다양성 (Shannon Index) | 4.94 | 5.42 | 6.32 | 4.26 | 0.16 |
| 베타 다양성 | 0.53 | 0.55 | 0.55 | 0.53 | 0.54 |
| Faith의 계통발생 다양성(Faith's phylogenetic diversity) | 16.88 | 23.87 | 19.01 | 22.15 | 0.67 |
| 균등도 (Peilou Index) | 0.60 | 0.63 | 0.76 | 0.52 | 0.05 |
| 암컷 | |||||
| OTU의 수 | 391 | 399 | 262 | 349 | 0.08 |
| 알파 다양성 (Shannon Index) | 6.13 | 6.09 | 4.44 | 5.94 | 0.07 |
| 베타 다양성 | 0.43 | 0.40 | 0.31 | 0.55 | 0.10 |
| Faith의 계통발생 다양성(Faith's phylogenetic diversity) | 19.97 | 20.18 | 16.22 | 20.21 | 0.07 |
| 균등도 (Peilou Index) | 0.71 | 0.70 | 0.55 | 0.69 | 0.06 |
문(phylum) 수준에서, 노령 수컷에서 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio: F/B ratio)의 증가, 베루코미크로비아(Verrucomicrobia)와 시아노박테리아(Cyanobacteria)의 상대적 분포도가 젊은 성체에 비해 밤시간대에 증가한 반면(도 1A-D), 암컷에서는 노화에 따른 차이를 보이지 않았다(도 1F).
과(Family) 수준에서는 1% 이상의 상대적 분포도를 보이는 미생물을 대상으로 분석하였고, 노령 암컷에서 수테렐라세아에(Sutterellaceae)의 분포가 밤시간에 증가하는 것을 제외하고 노화에 따른 차이를 보이지 않았다 (도 1G-I). 이러한 결과는 일부 박테리아는 문(phylum)과 과(family) 수준에서 노화에 따라 상대적 분포의 일주기성 변화가 있으며, 이러한 변화는 성별에 차이가 있음을 보여준다.
2. 속(Genus) 수준에서 노화에 따른 장내 미생물 조성 변화
노화에 따라 장내 미생물은 속(genus) 수준에서 변화된다고 보고하고 있어, 낮과 밤시간대에서 1%이상의 상대적 분포를 보이는 장내 박테리아를 속(genus) 수준(수컷에서 19개, 암컷에서 18개의 박테리아)에서 분석하였다.
수컷에서는 4개의 박테리아의 상대적 분포가 젊은 성체와 비교시 노령 마우스에서 차이를 보였다. 즉, 리케넬라 (Rikenella)와 리케넬라세아에 RC9 장 그룹 (Rikenellaceae RC9 gut group)은 낮시간에서 젊은 성체에서 증가하였지만, 노령에서는 오전과 밤 시간대 모두 현저히 감소하였다(도 2A-B). 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)의 상대적 분포는 노령에서 특히 밤시간대에 증가하였고(도 2C), 반면 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 분포는 밤시간대에 노령개체에서 감소하였다 (도 2D).
암컷 마우스에서는 5개 박테리아에서 노화에 따라 낮과 밤의 상대적 분포에 차이를 보였으며 수컷과 다른 양상을 보였다. 알로프레보텔라 (Alloprevotella)와 파라수테렐라 (Parasutterella)는 젊은 성체에서는 관찰되지 않았으나 노령에서 밤시간대에 현저히 증가하였다(도 2E와 I). 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001의 상대적 분포는 젊은 성체와 차이를 보이지 않았으나, 노령에서 밤 시간대에 증가하였다(도 2G). 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)의 상대적 분포는 노령에서 오전에 현저히 증가한 반면, 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium) 은 오전에 감소하였다(도 2F와 H). 이러한 결과는 노화에 따라 속(genus) 수준에서 일부 박테리아의 상대적 분포에 있어 일주기성 변화가 있으며, 이러한 변화는 성별에 따라 차이가 있음을 나타낸다.
따라서, 낮과 밤의 장내 미생물 분포 변화를 통해, 노화성 일주기 리듬 조절 이상을 조기 진단할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (12)
- 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 및 리케넬라 (Rikenella) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는,
남성에서 상기 장내 미생물의 일주기성 리듬(circadian rhythm) 변화를 이용한 노화 진단용 조성물. - 제1항에 있어서,
12시간 간격으로 수집된 낮시간대 생물학적 시료와 밤시간대 생물학적 시료에서 장내 미생물의 수준을 각각 측정하여 일주기성 리듬을 확인했을 때, 노화되지 않은 대조군과 비교하여, 밤시간대 생물학적 시료에서 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria) 또는 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)이 증가 또는 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014이 감소하거나; 또는 낮시간대 생물학적 시료에서 리케넬라 (Rikenella)가 감소하는 경우 노화가 진행되는 것으로 판정되는 것인, 조성물. - 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는,
남성에서 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 키트. - 남성의 생물학적 시료에서 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 및 리케넬라 (Rikenella) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 측정하는 단계를 포함하는,
노화 진단을 위한 정보 제공 방법. - 제4항에 있어서,
12시간 간격으로 낮시간대 생물학적 시료와 밤시간대 생물학적 시료를 수집하고 각 시료 내에서 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014 및 리케넬라 (Rikenella) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물의 수준의 변화를 측정하여 일주기성 리듬을 확인하고, 이를 노화되지 않은 대조군과 비교하는 것을 포함하는, 방법. - 제5항에 있어서,
노화되지 않은 대조군과 비교하여, 밤시간대 생물학적 시료에서 피르미쿠테스 대 박테로이데테스 비율 (Firmicutes to Bacteroidetes ratio), 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 시아노박테리아(Cyanobacteria) 또는 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)이 증가 또는 루미노코카세아에 (Ruminococcaceae) UCG-014이 감소하거나; 또는 낮시간대 생물학적 시료에서 리케넬라 (Rikenella)가 감소하는 경우 노화가 진행되는 것으로 판정되는 것인, 방법. - 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium), 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 및 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는,
여성에서 상기 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 조성물. - 제7항에 있어서,
12시간 간격으로 수집된 낮시간대 생물학적 시료와 밤시간대 생물학적 시료에서 장내 미생물의 수준을 각각 측정하여 일주기성 리듬을 확인했을 때, 노화되지 않은 대조군과 비교하여, 낮시간대 생물학적 시료에서 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)이 증가 또는 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium)이 감소하거나; 또는 밤시간대 생물학적 시료에서 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 또는 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 이 증가하는 경우 노화가 진행되는 것으로 판정되는 것인, 조성물. - 제7항 또는 제8항의 조성물을 포함하는,
여성에서 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 이용한 노화 진단용 키트. - 여성의 생물학적 시료에서 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium), 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 및 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물의 일주기성 리듬 변화를 측정하는 단계를 포함하는,
노화 진단을 위한 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
12시간 간격으로 낮시간대 생물학적 시료와 밤시간대 생물학적 시료를 수집하고 각 시료 내에서 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group), 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium), 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 및 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 장내 미생물의 수준의 변화를 측정하여 일주기성 리듬을 확인하고, 이를 노화되지 않은 대조군과 비교하는 것을 포함하는, 방법. - 제11항에 있어서,
노화되지 않은 대조군과 비교하여, 낮시간대 생물학적 시료에서 라크노스피라세아에 NK4A136 그룹 (Lachnospiraceae NK4A136 group)이 증가 또는 루미니클로스트리디움 (Ruminiclostridium)이 감소하거나; 또는 밤시간대 생물학적 시료에서 수테렐라세아에(Sutterellaceae), 파라수테렐라(Parasutterella), 알로프레보텔라 (Alloprevotella) 또는 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) UCG-001 이 증가하는 경우 노화가 진행되는 것으로 판정되는 것인, 방법.
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