KR102406599B1 - 장내 미생물 군집 수준 평가를 통한 비만 예측용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 출원은 장내 미생물 군집 수준 평가를 통한 비만 예측용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 비만 위험도 예측용 조성물, 비만 위험도 예측용 키트, 비만 위험도를 예측하기 위한 정보제공방법, 및 비만 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

장내 미생물 군집 수준 평가를 통한 비만 예측용 조성물 및 이의 용도{Composition for predicting obesity by evaluating the level of intestinal microorganism colony, and use thereof}

장내 미생물 군집 수준 평가를 통한 비만 예측용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

세계보건기구에서 비만은 '장기 치료가 필요한 질병'이라고 규정한 이래로 비만은 현 인류가 극복해야 할 중요한 질병 중 하나로 인식되고 있다. 비만은 만성적으로 섭취하는 영양분에 비해 에너지 소비가 적어 여분의 에너지가 체지방의 형태로 축적되는 현상으로서, 상기 비만은 복합적인 유전 인자와 환경 인자를 포함한 다양한 요소에 의해 유발된다. 구체적으로, 불규칙한 식습관, 과다한 음식 섭취, 운동 부족, 내분비계통 질환, 유전적 요인, 정신적 요인, 및 약물의 과다 복용 등이 비만의 현실적인 원인으로 지목되고 있다. 현재, 비만의 진단은 체질량 지수(Body Mass Index, BMI) 측정법, 생체전기저항 측정법, 허리둘레 측정법, 복부 지방 CT 촬영을 이용한 내장 지방 측정법을 통해 이루어지고 있다.

한편, 최근의 비만 연구에서는 인간의 장내에 존재하는 미생물 균총(microciota)에 주목하여, 미생물 균총이 체내 에너지 대사에 영향을 미쳐 비만과의 관련성이 있음을 보고하고 있다. 가장 잘 알려진 메타게놈 기반의 비만위험도 평가 방법으로는 대변 내 퍼미큐테스(Firmicutes) 문과 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문의 조성 비율을 분석하는 방법이 있으며, Firmicutes/Bacteroidetes ratio (F/B 비율)가 높을수록 비만 위험성이 높은 것으로 판단한다. 그러나 최근 들어 병적 상태나 숙주의 유전적 특징, 그리고 미생물 염기서열의 16S rRNA target region의 차이 등에 의해 F/B 비율과 비만 표현형의 불일치가 잦게 보고되고 있다.

또한, F/B 비율과 BMI의 상관관계에 대한 연구는 주로 서양식 식이를 보유한 집단을 대상으로 진행되었으며, 이에 따라, 다른 식이 습관을 갖는 집단에서는 상기와 같은 상관관계가 그대로 적용되지 않을 수 있다. 따라서, 이러한 한계점을 갖는 종래의 기술을 대체할 수 있는 새로운 비만 위험성 예측 기술의 개발이 절실한 실정이다(한국 등록특허 제10-1992789호).

일 양상은 롬부스티아(Romboutsia) 속, 서터렐라(Sutterella) 속, 및 프레보텔라(Prevotella) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 비만 위험도 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 비만 예측용 조성물을 포함하는 대변 내 미생물을 이용한 비만 위험도 예측용 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 대변 시료에서 롬부스티아 속, 서터렐라 속, 및 프레보텔라 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 대한 증폭산물의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 위험도를 예측하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내 롬부스티아 속, 서터렐라 속, 및 프레보텔라 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 생물학적 시료 내 미생물의 수준을 측정하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 상기 미생물의 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 비만 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 롬부스티아(Romboutsia) 속, 서터렐라(Sutterella) 속, 및 프레보텔라(Prevotella) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 비만 위험도 예측용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "비만"은 신체에 지방조직이 과잉 축적된 상태로, 남은 열량이 지방으로 전환되어 인체 내 피하조직이나 복부장간 막에 축적되는 현상을 지칭한다. 종래 비만의 위험성을 예측하는 기술로서, 퍼미큐테스(Firmicutes) 문과 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문간 조성 비율을 분석하는 방법이 있으나, 이들은 유전적 특징, 및 민족별 식이 습관의 차이에 따라 예측의 정확도가 낮을 수 있다는 한계를 지니고 있다. 이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 대변 시료를 대상으로 속 수준의 특정 미생물을 검출하고, 이들의 수준을 정량적으로 평가함으로써, 보다 정확하게 비만의 위험도를 예측할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 용어, "위험도 예측"은 비만이 발생될 가능성이 있는지를 평가하는 것으로서, 비만 발생 위험성이 높은 개체를 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 위험도 예측을 통하여, 추후 야기될 수 있는 병리 상태의 존재 또는 특징을 예측할 수 있다. 예를 들어, 상기 용어는 "비만의 가능성 예측", "비만의 상태를 진단", 즉, 비만도 진단, 비만 관련 질환의 위험 예후 예측 판단, 비만의 예방 또는 치료용 약제의 투여량 결정을 위한 진단, 비만의 진행에 따른 치료 방법을 결정하기 위한 진단과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 비만 관련 질환은 비만과 관련이 있거나 비만에 의해 야기될 수 있는 대사장애로서, 예를 들어, 대사 증후군, 인슐린 결핍증 또는 인슐린-내성 관련 장애, 당뇨병 (예컨대, 2형 당뇨병), 글루코스 불내성, 이상성 지질대사, 죽상동맥경화증, 고혈압, 심장병리학, 뇌졸중, 비알코올성 지방간 질환, 고혈당증, 지방간, 이상지질혈증, 과체중 및 비만과 연관된 면역계의 기능장애, 심혈관 질환, 고콜레스테롤, 트리글리세라이드 증가, 천식, 수면무호흡, 골관절염, 신경변성, 담낭 질환, 증후군 X, 염증성 및 면역 질환, 죽종형성 이상지질혈증, 암 등일 수 있다.

일 실시예에서, 비만 그룹과 정상체중 그룹간 장내 미생물의 전체적인 군집을 확인한 결과, 두 그룹 모두에서 70% 이상 검출된 총 32개의 속 중에서, 롬부스티아 속(Romboutsia), 서터렐라 속(Sutterella), 프레보텔라 속(Prevotella) 미생물은 p-값이 0.05 이하로 양 그룹간 유의한 차이를 나타내었고, 비만의 위험도와 양의 상관 관계를 보여주었다. 따라서, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 비만의 위험도를 예측하는데 사용될 수 있다. 상기 조성물의 검출 대상인 미생물, 즉, 롬부스티아 속, 서터렐라 속, 및 프레보텔라 속은 모두 장내 미생물로서, 정상체중 그룹과 비교하여 비만 그룹의 장내, 구체적으로 대변 시료에서 보다 높은 검출 빈도를 나타내는 바, 이들의 시료 내 수준을 측정함으로써, 비만의 위험도를 예측할 수 있다. 한편, 상기 롬부스티아 속의 하위 종으로는 예를 들어, 롬부스티아 호미니스(Romboutsia hominis), 롬부스티아 일레랄리스(Romboutsia ilealis), 롬부스티아 리투세부렌시스(Romboutsia lituseburensis) 등이 있고, 상기 서터렐라 속의 하위 종으로는 예를 들어, 서터렐라 티모넨시스(Sutterella timonensis), 서터렐라 워즈워덴시스(Sutterella wadsworthensis), 서터렐라 마시엔시스(Sutterella massiliensis) 등이 있으며, 상기 프레보텔라 속의 하위 종으로는 예를 들어, 프레보텔라 브레비스(Prevotella brevis), 프레보텔라 버칼리스(Prevotella buccalis), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens) 등이 있다.

다른 실시예에서, 서양인을 대상으로, 비만 그룹과 정상체중 그룹간 장내 미생물의 전체적인 군집을 확인한 결과, 두 그룹 모두에서 70% 이상 검출된 총 35개의 속 중에서, 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium) 속, 섭돌리그래눌럼(Subdoligranulum) 속, 인테스티니박터(Intestinibacter) 속, 아가토박터(Agathobacter) 속 미생물은 p-값이 0.05 이하로 양 그룹간 유의한 차이를 나타내었고, 비만의 위험도와 양의 상관 관계를 보여주었다. 따라서, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제 역시 비만의 위험도를 예측하는데 사용될 수 있다. 한편, 상기 라치노클로스트리디움 속의 하위 종으로 예를 들어, 라치노클로스트리디움 에두아르디(Lachnoclostridium edouardi), 라치노클로스트리디움 파카엔스(Lachnoclostridium pacaense) 등이 있고, 상기 섭돌리그래눌럼 속의 하위 종으로는 예를 들어, 섭돌리그래눌럼 베리어바일(Subdoligranulum variabile) 등이 있으며, 상기 인테스티니박터 속의 하위 종으로는 예를 들어, 인테스티니박터 바틀레티(Intestinibacter bartlettii)등이 있고, 상기 아가토박터 속의 하위 종으로는 예를 들어, 아가토박터 렉탈리스(Agathobacter rectalis), 아가토박터 루미니스(Agathobacter ruminis) 등이 있다.

상기 미생물을 검출할 수 있는 제제로는, 시료 내 해당 미생물들에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 항체 등을 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 해당 미생물을 검출할 수 있는 프라이머 일 수 있다. 상기 프라이머는 해당 미생물들의 게놈 서열(예컨대, 16S rRNA)을 특이적으로 검출하고 다른 미생물의 게놈 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 용어, "프라이머"는, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 용어, "16s rRNA "는, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 염기서열이 대부분 상당히 보존되어 있는 한편 일부 구간에서는 높은 염기서열 다양성이 나타난다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 프라이머는 해당 미생물에 보존된 16S rRNA 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있으며, 서열 증폭 결과 원하는 생성물의 생성 여부를 통하여 해당 미생물의 존재를 검출할 수 있다. 프라이머를 이용한 서열 증폭 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는, 항체일 수 있으며, 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

그 외, 당업계에 널리 사용되는 분자 및 면역학적 방법이 일 실시예에 따른 미생물을 검출하는 데 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 비만 위험도 예측용 조성물을 이용하여 비만의 위험도를 예측하는 경우, 현재 유지하는 식단이 비만을 유도하는지 여부를 판단할 수 있으므로 정상체중을 가진 사람이 비만이 되지 않도록 적절한 식이를 조절할 수 있는바 비만을 효과적으로 예방할 수 있다.

다른 양상은 상기 비만 예측용 조성물을 포함하는 비만 위험도 예측용 키트를 제공한다.

상기 비만 위험도 예측용 키트는 전술한 비만 예측용 조성물을 그대로 포함하거나, 이를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.

일 구체예에서, 상기 키트는 해당 미생물들을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 항체 등의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적으로, 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 미생물에 특이적인 프라이머를 포함하는 키트는 PCR 등의 증폭 반응을 수행하기 위한 필수 요소들을 포함할 수 있으며, 예를 들어, PCR용 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 커테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 적용할 수 있으며 예를 들어, 상기 시료는 대변 또는 분변 시료일 수 있다. 상기 키트는 시료의 채취를 위한 시료 채취용 포집 기구를 포함하며, 상기 포집 기구는 예를 들어, 브러쉬, 흡수성 패드, 면봉, 스포이드, 스왑, 주사기 등일 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 대변 시료에서 롬부스티아 속, 서터렐라 속, 및 프레보텔라 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 대한 증폭산물의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 위험도를 예측하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 비만 위험도를 예측하기 위한 정보제공방법은 전술한 비만 예측용 조성물을 그대로 포함하거나, 이를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.

상기 방법은 라치노클로스트리디움 속, 섭돌리그래눌럼 속, 인테스티니박터 속, 및 아가토박터 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 대한 증폭산물의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 방법은 시료 내 상기 미생물에 대한 증폭산물의 양이 정상 대조군 시료 내 미생물의 증폭산물보다 많은 경우, 비만의 위험성이 높은 것으로 예측하는 것일 수 있다.

상기 개체는 척추동물일 수 있고, 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있고, 포유동물일 수 있으며, 예를 들어 인간(Homo sapiens)일 수 있다. 일 실시예에 따르면 상기 롬부스티아 속, 서터렐라 속, 및 프레보텔라 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물은 동양인으로부터 수득한 시료로부터 검출하는 것일 수 있고, 상기 라치노클로스트리디움 속, 섭돌리그래눌럼 속, 인테스티니박터 속, 및 아가토박터 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물은 서양인으로부터 수득한 시료로부터 검출하는 것일 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내 롬부스티아 속, 서터렐라 속, 및 프레보텔라 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 생물학적 시료 내 미생물의 수준을 측정하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 상기 미생물의 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 비만 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 비만 치료 물질을 스크리닝하는 방법은 전술한 비만 예측용 조성물을 그대로 포함하거나, 이를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.

상기 방법은 라치노클로스트리디움 속, 섭돌리그래눌럼 속, 인테스티니박터 속, 및 아가토박터 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 시험물질을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 방법은 비만의 예방 또는 치료를 위한 시험물질의 존재 및 부재 하에서 시료 내 상기 미생물의 수준 또는 군집 형성 정도를 각각 측정하여 양자를 비교한 후, 시험물질이 존재할 때 미생물의 수준 또는 군집 형성 정도가 더 감소하는 경우, 해당 시험물질을 비만의 예방 또는 치료제로 선택하는 것 일 수 있다.

상기 시험 물질은 비만의 예방 또는 치료에 이용될 수 있는 각종 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예를 들어, DNA, RNA, PNA 등), 단백질, 당 및 지질 등을 포함할 수 있다.

일 양상에 따른 조성물에 따르면, 소량의 대변으로 비만의 위험도를 예측할 수 있는 효과가 있다. 또한, 일 양상에 따른 장내 미생물 군집은 비만도와 유의하게 연관된 것으로서, 장내 미생물 대상으로 이루어지던 종래 연구 대비 진단의 정확성을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 비만의 예방 또는 치료용 신약 개발의 타겟으로 활용할 수 있다.

도 1은 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물 다양성을 주성분 분석으로 나타낸 것이다.
도 2는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물 조성 차이를 문(phylum) 수준에서 나타낸 것이다.
도 3은 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물 조성 차이를 강(class) 수준에서 나타낸 것이다.
도 4는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물 중 군간 풍부도의 유의적인 차이가 있었던 미생물 속(genus)을 바 그래프로 나타낸 것이다.
도 5a는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 롬부스티아 속의 비율을 박스플롯으로 나타낸 것이다.
도 5b는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 서터렐라 속의 비율을 박스플롯으로 나타낸 것이다.
도 5c는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 프레보텔라 속의 비율을 박스플롯으로 나타낸 것이다.
도 6a는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 서양인 대변 시료 내 라치노클로스트리디움 속의 비율을 박스플롯으로 나타낸 것이다.
도 6b는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 서양인 대변 시료 내 섭돌리그래눌럼 속의 비율을 박스플롯으로 나타낸 것이다.
도 6c는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 서양인 대변 시료 내 인테스티니박터 속의 비율을 박스플롯으로 나타낸 것이다.
도 6d는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 서양인 대변 시료 내 아가토박터 속의 비율을 박스플롯으로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 대상 및 시료 수집

심각한 질병을 보유하지 않은 한국인 675명의 대변 샘플을 수집하였으며, 이들 중 저체중 13명, 과체중 158명, 신체계측 기록 누락 7명의 데이터는 본 실험에서 제외하였다. BMI 25이상의 성인 214명을 비만 그룹으로 설정하고, BMI 정상범위의 BMI(18.5~23)를 갖는 283명을 대조군(정상체중 그룹)으로 설정하였다. 두 그룹의 BMI는 P-value < 0.0001의 유의한 차이를 보였으며, 비만 그룹과 정상체중 그룹의 평균 연령은 48세로 유의한 차이가 나지 않았다. 비만의 범주는 WHO 아시아태평양지역 기준을 근거로 분류하였다. 멸균된 면봉을 사용하여 대변을 채변한 뒤 보존액에 섞은 상태로 상온 보관하였다.

[표 1]

이후, 보관된 시료를 실험실로 옮긴 뒤 stool DNA preparation 키트를 이용하여 시료로부터 genomic DNA를 추출하였으며, DNA 양은 Nanodrop을 이용하여 정량하였다. 추출된 DNA는 박테리아 16S rRNA의 V4 region을 타겟으로 하는 515F/806R 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고 Illumina의 MiSeq을 사용하여 증폭 산물의 염기서열 데이터를 시퀀싱하였다.

한편, 증폭에 사용된 바코드 융합 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 듀얼 인덱싱 방식으로 라이브러리를 제작하였으며 사용된 8bp의 인덱스 시퀀스는 표 1의 염기서열 내에 X로 표기하였다.

[표 2]

이후, 시퀀싱된 염기서열 데이터에서, 짝지어지지 않은 싱글 리드를 제거한 후, Quality Score를 고려하여 고품질 리드(high quality reads)만 필터링하였다. 각 리드 쌍을 하나의 리드로 병합시키고 시퀀스 클러스터링 알고리즘으로 sklearn을 사용하여 시퀀스 유사도에 따라 Operational Taxonomy Unit(OTU) 클러스터링을 수행하였다. 이후, 16S rRNA taxonomy database로 SILVA 132를 사용하여 99% 이상의 시퀀스 유사도를 갖는 박테리아를 각 OTU 별로 할당하여 분류학적 분석을 수행하였다. 전체적인 분석의 도구로 QIIME2를 활용하였으며, 비만 그룹과 정상체중 그룹의 미생물 군집 다양성 지표를 확인하고 문,강,속 수준에서의 미생물 분포를 분석하였다.

실시예 2. 대변 시료 내 균총 분석

(2.1) 다양성 지표 및 주성분 분석 결과

비만 그룹과 정상체중 그룹의 시료 내 존재하는 전체적인 미생물 패턴을 파악하기 위하여 먼저, 미생물 군집의 다양성을 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 이때, Faith_pd는 계통다양성, Observed_OTUs는 관찰된 Operational Taxonomic Unit(OTU)의 수, Shannon index는 종의 다양성을 의미한다.

[표 3]

표 3에 나타낸 바와 같이, 미생물 군집의 다양성 지표 분석 결과, 모든 지표에서 정상체중 그룹이 비만 그룹에 비하여 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, QIIME2를 활용하여 주성분 분석인 Emperor Principal Coordinates Analysis (PCoA)를 수행하였다.

도 1은 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물 다양성을 주성분 분석으로 나타낸 것이며, 그 결과, 상기의 분석 결과만으로는 비만 그룹과 정상체중 그룹을 명확하게 구분할 수 없음을 확인하였다.

(2.2) 문 (Phylum) 및 강 (Class) 수준에서의 미생물 조성 분석

도 2는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물 조성 차이를 문(phylum) 수준에서 나타낸 것이며, 도 3은 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물 조성 차이를 강(class) 수준에서 나타낸 것이다.

샘플 별 1% 이상 검출된 미생물 문의 분포 비율을 확인한 결과, 각 그룹간 미생물의 풍부도는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 반면, 강 수준에서의 미생물 분포 비율을 확인한 결과, 두 그룹간 장내 미생물 조성은 유의한 차이가 나타내었다. 구체적으로, 샘플 별 1% 이상 검출된 미생물 강의 분포 비율을 확인한 결과, 두 그룹 모두 박테로이디아(Bacteroidia), 클로스트리디아(Clostridia), 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 네가티비콕쿠스(Negativicutes), 액티노박테리아(Actinobacteria) 강 순으로 풍부하게 존재하였다. 그러나, 박테로이디아, 클로스트리디아, 액티노박테리아 강에 대한 두 그룹 간 풍부도는 유의한 차이를 보여주었다.

실시예 3. 동양인의 장내 미생물 분포와 비만간 상관관계 분석

대변 내 균총과 비만과의 연관성을 보다 정확하게 파악하기 위하여 속(genus) 수준에서 장내 미생물 균총을 분석하였다. 구체적으로, 정상체중 그룹 및 비만 그룹을 포함하는 총 497명의 대변에서 검출된 미생물 578 개의 속 중에서 검출빈도가 70% 이상을 나타내는 속을 선별하여 표 4에 나타내었다.

[표 4]

표 4에 나타낸 바와 같이, 두 그룹 모두에서 70% 이상 검출된 속은 총 32개였으며, 이들 중에서 정상체중 그룹과 비만 그룹 사이에서 알리스티페스 속(Alistipes), 오스실리박터 속(Oscillibacter), 롬부스티아 속(Romboutsia), 서터렐라 속(Sutterella), 오도리박터 속(Odoribacter), 루미니클로스트리디움 속(Ruminiclostridium), 프레보텔라 속(Prevotella), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium) 미생물은 p-값이 0.05 이하로 유의한 차이를 나타내는 것을 확인하였다.

도 4는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물 중 그룹간 풍부도의 유의적인 차이를 나타내는 미생물 속(genus)을 바 그래프로 나타낸 것이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 프레보텔라(Prevotella) 속의 경우, 8개의 미생물 속 중에서 풍부도가 가장 높았으며 정상체중 그룹에서 15.03%, 비만 그룹에서 18.64%의 풍부도를 나타내었다.

도 5a 내지 5c는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물의 상대적 풍부도 차이를 박스플롯으로 나타낸 것이다. 도 5a 내지 5c에 나타낸 바와 같이, 롬부스티아(Romboutsia) 속, 서터렐라(Sutterella) 속 및 프레보텔라(Prevotella) 속 미생물의 경우, 정상체중 그룹에 비해 비만 그룹에서 상대적으로 풍부하게 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 미생물 속은 장내 유해균인 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 서양인의 장내 미생물 분포와 비만간 상관관계 분석

(4.1) 실험 대상 및 시료 수집

영국인을 대상으로 퍼블릭 메타지놈 데이터를 활용하여 상기 실시예와 동일한 방법으로, 속 수준에서 비만 그룹과 정상체중 그룹에서 유의한 차이를 보이는 미생물을 확인하였다. European Bioinformatics Institute (EBI)의 공개된 데이터 중 메타지놈 데이터 ERP006339를 활용하여 비교 분석하였다. 실험 데이터는 상기 실시예 1과 동일하게 V4 region을 타겟으로 하는 16S rRNA amplicon 시퀀싱 방법으로 생산되었고 시퀀싱 플랫폼으로는 Illumina의 MiSeq 장비를 사용하였다.

총 525개의 샘플 중 신체계측 정보가 누락된 18건, 저체중 7건, 과체중 95 건을 제외하고 BMI 25이상의 성인 276명을 비만 그룹으로 설정하고 BMI 정상범위(18.5~23)의 129명을 대조 그룹(정상체중 그룹)으로 설정하여 분석을 실시하였다. 상기 비만 그룹 및 정상체중 그룹의 정보는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.

[표 5]

(4.2) 분석 결과

정상체중 그룹 및 비만 그룹을 포함하는 총 405 명의 대변에서 검출된 미생물 속 중에서 검출빈도가 70% 이상을 나타내는 속을 선별하여 표 6에 나타내었다.

[표 6]

표 6에 나타낸 바와 같이, 두 그룹 모두에서 약 70% 이상 검출된 속은 총 35개였으며, 그 중에서 정상체중 그룹과 비만 그룹 사이에서 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium) 속, 섭돌리그래눌럼(Subdoligranulum) 속, 인테스티니박터(Intestinibacter) 속, 아가토박터(Agathobacter) 속 미생물은 p-값이 0.05 이하로 유의한 차이를 나타내는 것을 확인하였다.

도 6a 내지 6d는 비만 그룹과 정상체중 그룹의 대변 시료 내 미생물의 상대적 풍부도 차이를 박스플롯으로 나타낸 것이다. 도 6a 내지 6d에 나타낸 바와 같이, 라치노클로스트리디움 속, 섭돌리그래눌럼 속, 인테스티니박터 속, 아가토박터 속 미생물의 경우, 정상체중 그룹에 비해 비만 그룹에서 상대적으로 풍부하게 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 미생물 속은 장내 유해균인 것을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> GENINUS Inc. <120> Composition for predicting obesity by evaluating the level of intestinal microorganism colony, and use thereof <130> PN134559 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 515F <220> <221> variation <222> (33)..(40) <223> n is 8bp index sequence <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ctnnnnnnnn tatggtaatt gtgtgycagc 60 mgccgcggta a 71 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 806R <220> <221> variation <222> (25)..(32) <223> n is 8bp index sequence <400> 2 caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnagtcagcc agccggacta cnvgggtwtc 60 taat 64

Claims (14)

1. 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium) 속 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 비만 위험도 예측용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 롬부스티아(Romboutsia) 속, 서터렐라(Sutterella) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속 섭돌리그래눌럼(Subdoligranulum) 속, 인테스티니박터 (Intestinibacter) 속, 및 아가토박터(Agathobacter) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 비만 위험도 예측용 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체인 것인, 비만 위험도 예측용 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 프라이머는 상기 미생물의 16s rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 것인, 비만 위험도 예측용 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 대변 시료에 적용되는 것인, 비만 위험도 예측용 조성물.
6. 청구항 1 또는 청구항 2의 비만 위험도 예측용 조성물을 포함하는 비만 위험도 예측용 키트.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 비만 위험도 예측용 키트.
8. 개체로부터 분리된 대변 시료에서 라치노클로스트리디움 속 미생물에 대한 증폭산물의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 비만 위험도를 예측하기 위한 정보제공방법.
9. 청구항 8에 있어서, 롬부스티아 속, 서터렐라 속, 프레보텔라 속 섭돌리그래눌럼 속, 인테스티니박터 속, 및 아가토박터 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 대한 증폭산물의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 비만 위험도를 예측하기 위한 정보제공방법.
10. 청구항 8에 있어서, 상기 증폭산물의 수준을 측정하는 단계는 대변 시료 내 전체 미생물에 대한 상대적인 비율을 산출하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 비만 위험도를 예측하기 위한 정보제공방법.
11. 청구항 8에 있어서, 상기 미생물에 대한 증폭산물의 수준이 정상 대조군에 비해 높은 경우, 비만의 위험성이 높을 것으로 예측하는 것인, 비만 위험도를 예측하기 위한 정보제공방법.
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