KR102616111B1 - 리팍시민 투여에 따른 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로, 리팍시민 투여 전과 비교하여 리팍시민 투여된 중증 알코올성 간염 환자군으로 부터 분리된 시료에서 수준 변화나 나타나는 미생물군 및 상기 미생물군 유래 세포 밖 소포체를 확인함에 따라, 상기 수준 변화가 확인된 미생물군 및 상기 미생물군 유래 세포 밖 소포체를 중증 알코올성 간염 환자의 약물투여 후 치료 반응성 예측용 바이오마커 조성물로 제공하여 약물 치료에 따른 환자의 중증 알코올성 간염 치료 효과를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
알코올성 간염은 장기간 과도하게 진행된 음주에 의해 간세포가 파괴되고 염증 반응이 동반되어 급격한 간기능 장애를 보이는 알코올성 간질환의 하나로서, 이중 중증 알코올성 간염 (severe alcoholic hepatitis)은 예후가 매우 불량하여 발병 1개월 이내의 단기 사망율이 40%에 이른다.
이러한 중증 알코올성 간염의 예후 예측은 일반적인 경우 mDF(Modified Discriminant Function) 점수가 32점 이상이거나 간성 뇌증을 동반한 경우로 중증 알코올성 간염으로 정의하며, 이는 mDF 점수가 32점 미만일 경우 환자의 28일 생존율이 90%인데 반해, mDF 점수가 32점 이상일 경우에는 환자의 28일 생존률이 50-65%로 불량한 예후를 보이는 것으로 보고되어 있다.
이러한 중증 알코올성 간염의 예후를 예측하기 위한 지표로 MELD (Model for End Stage Liver Disease) 점수, Glasgow 알코올성 간염 점수(Glasgow Alcoholic Hepatitis Score, GAHS)와 ABIC (Age, Bilirubin, INR, Creatinine) 점수 등이 있으며, 중증 알코올성 간염의 치료 예후를 예측하기 위한 다양한 지표 연구들이 진행되고 있으나, 각 연구마다 예후 평가에 유용한 절단값의 차이를 보이거나 단기 예후의 예측능에 비해 장기 예후 예측 효과가 낮은 문제점이 나타남에 따라, 중증 알코올성 감염의 치료 효과를 보다 정확하게 예측하기 위한 지표의 개발이 필요한 실정이다.
최근 인체 내에 서식하는 미생물이 인체에 미치는 영향력이 매우 크다는 연구결과가 밝혀짐에 따라 마이크로바이옴에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 인체 내에 존재하는 마이크로바이옴은 인간의 몸속에서 함께 공존하고 있는 미생물의 유전정보 전체를 일컬으며, 유익균과 유해균이 생성되는 원리와 질병 간 연관성등을 분석할 수 있다. 특히, 콜레스테롤, 알레르기, 비염, 아토피, 비만과 관련된 각종 대사질환, 면역질환, 장염 및 심장병 등이 마이크로바이옴과 관련된 것으로 보고되어있다.
한편, 모든 세포들은 세포 밖 소포체 (extracellular vesicles, EVs)를 분비하며, 이러한 점은 박테리아로부터 식물과 인간에 이르기까지 진화적으로 보존된 현상이다. 세포 밖 소포체는 세포 간의 물질 (단백질, 지질, 유전물질 등)의 교환을 가능하게 하며, 생리적/병리적으로 신호를 전달하는 매개체로서 기능한다고 알려져 있다. 장내 미생물 역시 세포 밖 소포체를 분비하게 되는 데, 세포 밖 소포레 내에는 DNA, RNA 뿐만 아니라 단백질, 지질, 대사물질 등을 포함하고 있어 기능적으로 중요한 장내 미생물 탐색에 중요한 역할을 한다.
본 발명은 중증 알코올성 간염 치료를 위해 사용되는 리팍시민 (rifaximin)에 대한 치료 반응성을 예측하기 위해, 리팍시민 처리 전후의 시료에서 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 확인하여 리팍시민 약물 치료에 대한 증증 알코올성 간염 치료 반응성 예측을 위한 바이오마커 및 이를 이용한 예측 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae) 및 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae) 및 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명은 리팍시민 투여된 중증 알코올성 간염 환자로부터 분리된 시료를 수집하는 단계;
상기 수집된 시료에서 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae) 및 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 확인하는 단계; 및
상기 확인된 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 리팍시민 투여 전 시료와 비교하는 단계를 포함하는 리팍시민 투여에 따른 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 중증 알코올성 간염 환자로부터 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 시료에서 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae) 및 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 확인하는 단계; 및
상기 확인된 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 후보물질 처리 전 시료와 비교하는 단계를 포함하는 중증 알코올성 간염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 리팍시민 투여 전과 비교하여 리팍시민 투여된 중증 알코올성 간염 환자군으로 부터 분리된 시료에서 수준 변화나 나타나는 미생물군 및 상기 미생물군 유래 세포 밖 소포체를 확인함에 따라, 상기 수준 변화가 확인된 미생물군 및 상기 미생물군 유래 세포 밖 소포체를 중증 알코올성 간염 환자의 약물투여 후 치료 반응성 예측용 바이오마커 조성물로 제공하여 약물 치료에 따른 환자의 중증 알코올성 간염 치료 효과를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 사용할 수 있다.
도 1은 정상 대조군 (BT_HC)의 미생물, 중증 알코올성 간염 환자군의 미생물 (BT_SAH), 정상 대조군의 세포 밖 소포체 (EV_HC) 및 중증 알코올성 간염 환자군의 세포 밖 소포체 (EV_SAH)에 대한 마이크로마이옴의 상대적 풍부도를 확인한 결과로, 도 1A는 문 (phylum) 수준에서 확인한 결과이며, 도 1B는 강 (class) 수준에서 확인한 결과이며, 도 1C는 과 (family) 수준에서 확인한 결과이며, 도 1D는 속 (genus) 수준에서 확인한 결과이다.
도 2는 중증 알코올성 간염 (SAH)의 예측을 위한 예측적 미생물 특징 및 진단력의 상대적 풍부도를 확인한 결과로, 각각 증가 및 감소 풍부도를 나타내는 상위 20개의 미생물 무리 (taxa)로 도 2A는 SAH 환자의 미생물 (BT_SAH)을 확인한 결과이며, 도 2B는 SAH 환자의 세포 밖 소포체 (EVs)를 확인한 결과로, 코호트의 각 그룹에 대한 상대적 풍부도를 Box-and-whiskers plot으로 나타내었다. 도 2C 및 도 2D는 각각 SAH 환자의 장내 미생물군집에서 증가 및 감소 풍부도를 나타내는 속(genera)의 ROC (Receiver operating characteristic) 곡선 결과이며, 도 2E 및 도 2F는 각각 SAH 환자의 미생물 유래 세포 밖 소포체에서 증가 및 감소 풍부도를 나타내는 속의 ROC 곡선 결과이다.
도 3은 장내 미생물 조성에 대한 리팍시민의 영향을 확인한 결과로, 도 3A는 실험 과정에 대한 모식도로 화살표는 리팍시민 처리일을 나타내며, 도 3B는 장내 미생물군에 대한 UniFrac distances를 기초로 한 알파 다양성(왼쪽) 및 베타 다양성(오른쪽)의 Box-and-whiskers plot 결과이며, 도 3C는 미생물 유래 세포 밖 소포체에 대한 UniFrac distances를 기초로 한 알파 다양성(왼쪽) 및 베타 다양성(오른쪽)의 Box-and-whiskers plot 결과로, 모든 P-값은 twosided Kruskal-Wallis H test에 의해 결정되었다. **P < 0.01; ***P < 0.001. BT_HC, 정상 대조군의 미생물; BT_postRXM, 리팍시민 처리 후 미생물군; BT_preRXM, 리팍시민 처리 전 미생물군; EV_HC, 정상 대조군의 세포 밖 소포체군; EV_postRXM, 리팍시민 처리 후 세포 밖 소포체군; EV_preRXM, 리팍시민 처리 전 세포 밖 소포체군.
도 4는 리팍시민 처리 영향을 비교한 결과로, 막대 그래프는 예측된 미생물 무리 (taxa)의 상대적 풍부도를 확인한 결과로, 도 4A는 장내 미생물군의 결과이며, 도 4B는 미생물 유래 세포 밖 소포체 (EVs)에 대한 결과이며, 도 4C 및 도 4D는 각각 장내 미생물 및 미생물 유래 세포 밖 소포체에서 리팍시민 처리에 의한 대표적인 미생물 속 변화를 확인한 결과로, 막대 그래프는 중증 알코올성 간염 (SAH) 환자에 리팍시민 처리 전 및 처리 후 상대적 풍부도 변화를 나타내는 결과이다. BT_postRXM, 리팍시민 처리 후 미생물군; BT_preRXM, 리팍시민 처리 전 미생물군; EV_postRXM, 리팍시민 처리 후 세포 밖 소포체군; EV_preRXM, 리팍시민 처리 전 세포 밖 소포체군.
도 2는 중증 알코올성 간염 (SAH)의 예측을 위한 예측적 미생물 특징 및 진단력의 상대적 풍부도를 확인한 결과로, 각각 증가 및 감소 풍부도를 나타내는 상위 20개의 미생물 무리 (taxa)로 도 2A는 SAH 환자의 미생물 (BT_SAH)을 확인한 결과이며, 도 2B는 SAH 환자의 세포 밖 소포체 (EVs)를 확인한 결과로, 코호트의 각 그룹에 대한 상대적 풍부도를 Box-and-whiskers plot으로 나타내었다. 도 2C 및 도 2D는 각각 SAH 환자의 장내 미생물군집에서 증가 및 감소 풍부도를 나타내는 속(genera)의 ROC (Receiver operating characteristic) 곡선 결과이며, 도 2E 및 도 2F는 각각 SAH 환자의 미생물 유래 세포 밖 소포체에서 증가 및 감소 풍부도를 나타내는 속의 ROC 곡선 결과이다.
도 3은 장내 미생물 조성에 대한 리팍시민의 영향을 확인한 결과로, 도 3A는 실험 과정에 대한 모식도로 화살표는 리팍시민 처리일을 나타내며, 도 3B는 장내 미생물군에 대한 UniFrac distances를 기초로 한 알파 다양성(왼쪽) 및 베타 다양성(오른쪽)의 Box-and-whiskers plot 결과이며, 도 3C는 미생물 유래 세포 밖 소포체에 대한 UniFrac distances를 기초로 한 알파 다양성(왼쪽) 및 베타 다양성(오른쪽)의 Box-and-whiskers plot 결과로, 모든 P-값은 twosided Kruskal-Wallis H test에 의해 결정되었다. **P < 0.01; ***P < 0.001. BT_HC, 정상 대조군의 미생물; BT_postRXM, 리팍시민 처리 후 미생물군; BT_preRXM, 리팍시민 처리 전 미생물군; EV_HC, 정상 대조군의 세포 밖 소포체군; EV_postRXM, 리팍시민 처리 후 세포 밖 소포체군; EV_preRXM, 리팍시민 처리 전 세포 밖 소포체군.
도 4는 리팍시민 처리 영향을 비교한 결과로, 막대 그래프는 예측된 미생물 무리 (taxa)의 상대적 풍부도를 확인한 결과로, 도 4A는 장내 미생물군의 결과이며, 도 4B는 미생물 유래 세포 밖 소포체 (EVs)에 대한 결과이며, 도 4C 및 도 4D는 각각 장내 미생물 및 미생물 유래 세포 밖 소포체에서 리팍시민 처리에 의한 대표적인 미생물 속 변화를 확인한 결과로, 막대 그래프는 중증 알코올성 간염 (SAH) 환자에 리팍시민 처리 전 및 처리 후 상대적 풍부도 변화를 나타내는 결과이다. BT_postRXM, 리팍시민 처리 후 미생물군; BT_preRXM, 리팍시민 처리 전 미생물군; EV_postRXM, 리팍시민 처리 후 세포 밖 소포체군; EV_preRXM, 리팍시민 처리 전 세포 밖 소포체군.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae) 및 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.
상기 바이오마커 조성물은 리팍시민 (rifaximin) 처리에 따른 중증 알코올성 간염의 치료 반응성을 예측하는 것일 수 있다.
상기 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula) 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체는 정상 대조군과 비교하여 리팍시민 (rifaximin) 처리 전 증가되었다가 리팍시민 처리 후 감소되는 것일 수 있다.
상기 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae), 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum) 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체는 정상 대조군과 비교하여 리팍시민 (rifaximin) 처리 전 감소되었다가 리팍시민 처리 후 증가되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "바이오마커"란, 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표로서, 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 즉, 중증 알코올성 간염에 대한 진단, 예후 예측 및 약물에 대한 반응 정도 등을 측정할 수 있다.
본 발명은 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae) 및 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측용 키트를 제공할 수 있다.
상기 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 검출할 수 있는 제제는 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출할 수 있는 제제는 시료 내에서 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측용 바이오마커인 상기 장내 미생물 및 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, 상기 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 장내 미생물 및 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체를 검출할 수 있는 제제는 상기 장내 미생물 및 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체에 특이적인 프라이머일 수 있다. 상기 "프라이머"란, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 상기 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 상기 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 상기 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 프라이머는 상기 장내 미생물 및 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
상기 16s rRNA는 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 염기서열이 대부분 상당히 보존되어 있는 한편 일부 구간에서는 높은 염기서열 다양성이 나타난다. 특히, 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로, 상기 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다.
본 발명은 리팍시민 투여된 중증 알코올성 간염 환자로부터 분리된 시료를 수집하는 단계;
상기 수집된 시료에서 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae) 및 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 확인하는 단계; 및
상기 확인된 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 리팍시민 투여 전 시료와 비교하는 단계를 포함하는 리팍시민 투여에 따른 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 정보를 제공하는 방법은 리팍시민 투여된 시료에서 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula) 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체 수준이 리팍시민 투여 전 시료와 비교하여 감소되면 리팍시민에 의한 치료 반응성이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
상기 정보를 제공하는 방법은 리팍시민 투여된 시료에서 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae), 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum) 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체 수준이 리팍시민 투여 전 시료와 비교하여 증가되면 리팍시민에 의한 치료 반응성이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
상기 시료는 분변, 뇨, 조직, 세포 및 혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 중증 알코올성 간염 환자로부터 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 시료에서 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae) 및 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 확인하는 단계; 및
상기 확인된 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준을 후보물질 처리 전 시료와 비교하는 단계를 포함하는 중증 알코올성 간염 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 후보물질이 처리된 시료에서 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula) 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체 수준이 후보물질 처리 전 시료와 비교하여 감소되면 중증 알코올성 간염 치료제로 선별하는 것일 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 후보물질이 처리된 중증 알코올성 환자의 시료에서 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae), 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum) 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체 수준이 후보물질 처리 전 시료와 비교하여 증가되면 중증 알코올성 간염 치료제로 선별하는 것일 수 있다.
상기 장내 미생물 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체의 수준은 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing), RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 마이크로 어레이칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 임상 시료 수집
국내 6개 병원 (아주대병원, 성빈센트병원, 의정부성모병원, 고대안산병원, 부천순천향병원, 부천성모병원)에서 모집한 중증 알코올성 간염환자 (modified Maddrey discriminant function ≥32) 24명의 분변샘플 확보하여 임상데이터 정리하였다. 이 중 8명은 리팍시민 (rifaximin)을 투약하였고 투약 한 달 뒤 분변을 추가적으로 확보하였다.
건강대조군으로 해운대백병원 건강검진센터를 방문한 24명의 분변 분석결과를 확보하였다.
본 연구에 참여한 SAH 환자 24명과 정상 대조군 24명의 기본적인 특성은 표 1과 같으며, 이 중 리팍시민 치료를 받은 환자 8명의 리팍시민 치료 전후 간기능은 표 2와 같다.
이들의 중간 연령은 50세 였으며, 두 그룹 모두 피험자의 62.5%가 남성이었다. SAH 환자의 중간 MDF 값은 60.5 (interquartile range [IQR], 41.3-68.7)였으며, 말기 간질환 모델(MELD) 점수의 중앙 값은 24.1 (IQR, 21.5-27.4)였다. 16세 환자(66.7%)는 코르티코스테로이드 치료를 받았고, 코르티코스테로이드 치료가 어려운 환자 8명(33.3%)은 펜톡시필린 치료를 받았다.
상기와 같이 14명의 환자를 무작위로 배정하여 리팍시민 치료를 받았으며, 8명의 환자는 4주간 리팍시민 치료를 완료하였다.
표 2를 참고하면, MDF, MELD 점수, 빌리루빈, 프로트롬빈 시간 (국제 표준 비율) 및 알부민을 포함한 간 기능 마커는 리팍시민 치료 4주 후 현저한 개선 효과를 나타내었다.
| Characteristic | SAH (n = 24) | Control (n = 24) |
| Age, year | 50 (38-56) | 50 (49-56) |
| Male sex | 15 (62.5) | 15 (62.5) |
| Alcohol consumption, g/day | ||
| Women | 58.0 (44.0-141.0) | |
| Men | 108.0 (81.0-162.0) | |
| Encephalopathy | ||
| None/G1/2/3/4 | 23/1/0/0/0 (95.8/4.2/0/0/0) | |
| Ascites on admission | ||
| None/mild/moderate to severe | 5/15/4 (20.8/62.5/16.7) | |
| Infection on admission | 0 (0) | |
| Gastrointestinal bleeding on admission | 4 (16.7) | |
| Laboratory results | ||
| Bilirubin, mg/dl | 19.2 (10.5-23.5) | |
| Albumin, g/dl | 2.5 (2.2-2.8) | |
| AST, U/l | 104.0 (70.3-138.3) | |
| ALT, U/l | 40.0 (24.3-57.0) | |
| GGT, U/l | 213.0 (105.8 -319.3) | |
| Creatinine, mg/dl | 0.9 (0.6-1.3) | |
| WBC, Х mm9, (n=20) | 6.4 (3.6-9.4) | |
| Platelet, Х mm9 | 9.8 (7.1-13.7) | |
| Haemoglobin, g/dl | 10.2 (8.9-11.4) | |
| INR | 1.7 (1.5-2.2) | |
| Prognostic scores | ||
| MDF | 60.5 (41.3-68.7) | |
| MELD | 24.1 (21.5-27.4) | |
| Treatment group | ||
| Steroid/Pentoxifylline | 16/8 (66.7/33.3) |
| Baseline | After rifaximin | P value | |
| Discriminant function | 58.9 (49.8-63.9) | 24.8 (15.9-35.9) | 0.017 |
| MELD | 24.6 (21.7-27.1) | 16.0 (14.3-19.1) | 0.012 |
| Creatinine | 0.9 (0.5-1.7) | 0.7 (0.7-0.9) | 0.528 |
| Bilirubin | 21.2 (10.3-36.5) | 4.5 (3.4-8.6) | 0.025 |
| INR | 1.7 (1.5-1.8) | 1.4 (1.3-1.6) | 0.018 |
| Albumin | 2.5 (2.3-2.8) | 3.0 (2.6-3.2) | 0.080 |
2. 세포 밖 소포체(EV) 및 DNA 추출
분변 샘플은 24 시간 동안 10 mL의 인산염 완충 식염수에 희석한 뒤 세포 여과기를 통해 여과하고, 4℃에서 10 분 동안 10,000×g에서 원심분리 후 박테리아를 포함하는 펠렛과 EV를 포함하는 상청액을 분리하였다. EV 샘플은 0.22 μm 필터를 통해 상층액을 살균하고 정제하여 박테리아와 이물질을 완전히 제거하였다. 박테리아와 EV 샘플을 100℃에서 40 분 동안 끓인 뒤, 30 분 후 상층액을 수집하고, 4℃, 18214×g에서 원심분리하여 남아있는 부유 입자 및 폐기물을 제거하였다.
다음으로 박테리아와 박테리아 EV 막에서 DNeasy Power Soil kit (QIAGEN)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
3. 메타게놈 분석
박테리아 게놈 DNA는 16S rDNA의 V3-V4 초 가변 영역을 표적으로하는 프라이머로 증폭하였다 (16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3 '및 16S_V4_R 5'-GTCTCTCGTGGGCTCGGATCCGT'). 사이클링 조건은 3 분 동안 95℃였다 (30 초 동안 95℃, 30 초 동안 58℃ 및 30 초 동안 72℃의 35주기; 5 분 동안 72℃). 라이브러리는 MiSeq 시스템 지침 (Illumina)에 따라 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 제품을 사용하여 준비하고 QIAxpert (QIAGEN)를 사용하여 정량화하였다. 그 후 각 앰플리콘을 정량화하고 등몰 비율로 설정하고 제조업체의 권장 사항에 따라 MiSeq 플랫폼 (Illumina)에서 풀링하고 시퀀싱하였다.
<실시예 1> SAH 환자 및 정상 대조군에서 박테리아 및 박테리아 유래 세포 밖 소포(EV)의 미생물군집 분석
정상대조군과 중증알콜성간염군(SAH)으로부터 수집된 마이크로바이옴(BT) 및 세포밖 소포체 (EV) 시료에서 각각 (A) 문 (phylum) 수준, (B) 강 (class) 수준, (C) 과 (family) 수준 및 (D) 속 (genus) 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 1과 같이 Verrucomicrobia의 경우 BT (0.03)와 EV(0.02) 모두에서 존재했지만, SAH 군에서는 전혀 나타나지 않았고, 반대로 Fusobacteria의 경우는 SAH에서만 나타나는 것이 확인되었다 (BT; 0.02 및 EV; 0.01)). Cyanobacteria의 경우 BT 대조군에서는 나타나지 않았지만 상대적으로 EV에서 많이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. (EV_HC;0.23, EV_SAH;0.21)
또한, 정상대조군과 중증알콜성간염군(SAH)에 대하여 LEfSe analysis를 수행하여 Kruskal-Wallis H test를 적용한 후 문(phylum)부터 종(species)까지 의미있는 미생물 무리 (taxa; p-value < 0.05, LDA effect size ≥ 2)를 확인하였다.
BT의 경우, 총 267개의 taxa가 나왔으며, 이 중 SAH에서 증가된 20개와 감소된 20개가 확인되었다. 상기 결과로부터 확인된 Top 20개에 대하여 ROC (Receiver operating characteristic) 분석을 수행하여 가장 높은 AUC값을 보이는 3개씩을 선정하여 대표 그림으로 나타내었다.
그 결과, 도 2와 같이 BT_SAH에서 증가된 대표적인 taxa는 Bacilli, Lactobacillales, Veillonella로 확인되었으며, EV_SAH에서 증가된 대표적인 taxa는 Veillonella, Veillonella parvula group, Lactobacillales가 확인되었다. 또한, BT_SAH에서 감소된 대표적인 taxa는 Eubacterium_g23, Oscillibacter, Clostridiales 였으며, EV_SAH에서 감소된 대표적인 taxa는 Eubacterium_g23, Oscillibacter, Christensenellaceae 로 확인되었다.
<실시예 2> 리팍시민 (rifaximin) 투여 후 미생물군집 변화 확인
8명의 중증알콜성 간염 환자에게 리팍시민을 하루 400 mg씩 3번, 총 4주간 처리 후 마이크로바이옴 변화를 확인하였다. 또한, 정상대조군 (24명), 리팍시민 처리 전 중증 알코올성 간염환자 및 4주 처리 후 중증알콜성 간염 환자의 마이크로바이옴(BT) 또는 세포밖 소포체 (EV)에서 알파 다양성 (alpha diversity) 및 베타 다양성 (beta diversity)으로 각각의 다양성 지수를 확인하였다.
그 결과, 도 3과 같이 알파 다양성의 경우 BT에서 정상대조군과 리팍시민 처리 후 4주 후의 환자 샘플간의 통계적 유의성이 관찰되었으나 EV에서는 각 그룹에서의 차이는 확인되지 않았다.
반면, 베타 다양성은 BT에서 정상대조군에 비해 리팍시민 처리 전 중증알콜성 간염 환자에서 다양성 지수가 통계적으로 유의하게 증가하였고, 반대로 리팍시민 처리 4주 후 환자에서는 다양성 지수가 통계적으로 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. EV에서도 비슷한 경향을 보였으나, 리팍시민 전후 그룹에서 통계적 유의성은 확인되지 않았다.
한편, 중증알콜성 간염 환자에게 치료제인 리팍시민을 투여 뒤 4주 후에 변화되는 마이크로바이옴을 확인하였다. 이를 위해 LEfSe analysis를 수행하여 Kruskal-Wallis H test를 적용한 후, 문(phylum)부터 종(species)까지 의미있는 미생물 무리(taxa; p-value < 0.05, LDA effect size ≥ 2)를 확인하였다.
그 결과, 도 4A 및 도 4B와 같이 BT의 각 3개 그룹 (정상대조군, 리팍시민 처리 전 중증알콜성 간염 환자, 리팍시민 4주 처리 후 중증알콜성 간염 환자)에서 104개의 taxa가 확인되었고, EV에서는 94개의 taxa가 확인되었으며, 이 중 공통적인 taxa는 총 42개로 나타났다.
확인된 taxa 중 정상대조군과 리팍시민 처리 전 중증알콜성 간염 환자에서 감소하였으나, 리팍시민 4주 처리 후 중증알콜성 간염 환자에서 다시 증가하는 taxa와 반대로 정상대조군과 리팍시민 처리 전 중증알콜성 간염 환자에서는 증가하였으나, 리팍시민 4주 처리 후 중증알콜성 간염 환자에서는 다시 감소하는 taxa를 도 4C 및 도 4D와 같이 확인하였다.
상기 확인된 taxa 중 BT와 EV에서 공통적으로 정상대조군에 비해 리팍시민 처리 전 환자에서 증가되었다가 리팍시민 처리 후 다시 감소된 taxa로는 Veillonella 및 Veillonella parvula group가 확인되었으며, 반대로 정상대조군에 비해 리팍시민 처리 전 환자에서 감소되었다가 리팍시민 처리 후 다시 증가된 taxa로는 Prevotella, Prevotellaceae 및 Subdoligranulum이 확인되었다.
| Taxon name | Taxon rank | Taxonomy | LDA effect size | p-value | p-value (FDR) |
BT_
ontrol |
BT_
preRXM |
BT_
postRXM |
| Subdoligranulum | Genus | Bacteria: Firmicutes: Clostridia: Clostridiales: Ruminococcaceae | 3.44662 | 0.00008 | 0.00008 | 1.73043 | 0 | 0.55714 |
| Veillonella parvula group | Species | Bacteria: Firmicutes: Negativicutes: Veillonellales: Veillonellaceae: Veillonella | 3.44011 | 0.00032 | 0.00032 | 0.01304 | 6.3875 | 0.52857 |
| Veillonella | Genus | Bacteria: Firmicutes: Negativicutes | 4.52214 | 0.00038 | 0.00038 | 0.21739 | 22.975 | 6.87143 |
| Oscillibacter | Genus | Bacteria: Firmicutes: Clostridia: Clostridiales: Ruminococcaceae | 3.47242 | 0.00072 | 0.00073 | 4.4913 | 0.35 | 0.94286 |
| Prevotellaceae | Family | Bacteria: Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales | 3.1943 | 0.00086 | 0.00087 | 8.06087 | 0.6875 | 1 |
| Rikenellaceae | Family | Bacteria: Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales | 3.85562 | 0.00322 | 0.00334 | 8.10435 | 0.9375 | 2.37143 |
| Alistipes | Genus | Bacteria: Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales: Rikenellaceae | 3.85562 | 0.00322 | 0.00334 | 8.10435 | 0.9375 | 2.37143 |
| Prevotella | Genus | Bacteria: Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales | 3.1943 | 0.00565 | 0.00591 | 7.53478 | 0.6875 | 1 |
| Taxon name | Taxon rank | Taxonomy | LDA effect size | p-value | p-value (FDR) |
EV_
controls |
EV_
base_pre |
EV_
4wks |
| Veillonella | Genus | Bacteria: Firmicutes: Negativicutes | 3.97755 | 0.00028 | 0.00029 | 0.19167 | 4.1875 | 2.0875 |
| Veillonella parvula group | Species | Bacteria: Firmicutes: Negativicutes: Veillonellales: Veillonellaceae: Veillonella | 3.90565 | 0.00031 | 0.00031 | 0.18333 | 4.075 | 1.7875 |
| Prevotellaceae | Family | Bacteria: Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales | 3.63487 | 0.00195 | 0.00199 | 15.57917 | 1.925 | 2.7875 |
| Prevotella | Genus | Bacteria: Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales | 3.61557 | 0.00289 | 0.00297 | 15.325 | 1.925 | 2.75 |
| Rikenellaceae | Family | Bacteria: Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales | 3.20611 | 0.00286 | 0.00294 | 1.58333 | 1.2625 | 0.15 |
| Alistipes | Genus | Bacteria: Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales: Rikenellaceae | 3.20611 | 0.00286 | 0.00294 | 1.58333 | 1.2625 | 0.15 |
| Subdoligranulum | Genus | Bacteria: Firmicutes: Clostridia: Clostridiales: Ruminococcaceae | 3.05563 | 0.00158 | 0.00161 | 1.125 | 0.0875 | 0.3125 |
| Oscillibacter | Genus | Bacteria: Firmicutes: Clostridia: Clostridiales: Ruminococcaceae | 3.05262 | 0.00058 | 0.00058 | 4.03333 | 0.6 | 0.375 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (4)
- 리팍시민 투여된 중증 알코올성 간염 환자로부터 분리된 시료를 수집하는 단계;
상기 수집된 시료에서 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula), 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae) 및 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum)으로 이루어진 장내 미생물군 또는 상기 장내 미생물군 유래 세포 밖 소포체의 수준을 확인하는 단계; 및
상기 확인된 장내 미생물군 또는 상기 장내 미생물군 유래 세포 밖 소포체의 수준을 리팍시민 투여 전 시료와 비교하는 단계를 포함하는 리팍시민 투여에 따른 중증 알코올성 간염 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 정보를 제공하는 방법은 리팍시민 투여된 시료에서 베일로넬라 (Veillonella), 베일로넬라 파르불라 (Veillonella parvula) 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체 수준이 리팍시민 투여 전 시료와 비교하여 감소되면 리팍시민에 의한 치료 반응성이 높은 것으로 판단하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 정보를 제공하는 방법은 리팍시민 투여된 시료에서 프레보텔라 (Prevotella), 프레보텔라서애 (Prevotellaceae), 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum) 또는 이의 미생물 유래 세포 밖 소포체 수준이 리팍시민 투여 전 시료와 비교하여 증가되면 리팍시민에 의한 치료 반응성이 높은 것으로 판단하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 분변, 뇨, 조직, 세포 및 혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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| Smirnova, Ekaterina et al, Hepatology (2020.2.14.), vol 72, no 1, pp 271-286. |
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